Bacillus aryabhattai菌和硅元素能够调节缺水条件下Mimosa caesalpiniifolia（一种植物）的土壤生物活性及其生长表现

《Brazilian Journal of Microbiology》：Bacillus aryabhattai and silicon modulate soil biological activity and performance of Mimosa caesalpiniifolia under water deficit

　　摘要：Mimosa caesalpiniifolia是一种原生于半干旱地区的豆科植物，常用于农林业系统、退化土地的恢复以及木材生产。尽管该物种本身具有很强的耐旱性，但其幼苗在生长初期对水分缺乏非常敏感，这限制了它们在干旱条件下的存活和生长。本研究在温室实验中，探讨了Bacillus aryabhattai菌接种和硅（Si）施用对幼苗生长、生理表现以及土壤微生物和酶活性的影响，实验设置了两种水分条件（50%和100%的土壤含水量）和四种处理方式（对照组、B. aryabhattai处理、Si处理以及B. aryabhattai+Si处理）。结果表明，在100%水分条件下，幼苗的地上部分和根部生物量、叶片数量、根长、植株高度及幼苗质量指数均显著增加。无论水分条件如何，B. aryabhattai+Si处理组的叶绿素和类胡萝卜素含量也有所提高。在干旱条件下（50%水分含量），水分利用效率得到改善。B. aryabhattai处理使土壤基础呼吸作用增加了约87%，而B. aryabhattai+Si处理则增加了75%。与对照组相比，B. aryabhattai+Si处理组的多种酶活性（芳基硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、磷酸酶、脲酶）提高了多达600%。在100%水分条件下，B. aryabhattai处理组的地上部分Si浓度最高；而在50%水分条件下，B. aryabhattai+Si处理组的根部Si浓度最高。这些发现表明，B. aryabhattai和Si的联合使用能够增强M. caesalpiniifolia幼苗的耐旱性并改善土壤生物质量，从而支持半干旱生态系统的可持续恢复。

引言：Mimosa caesalpiniifolia（俗称Sabiá）是一种原产于巴西的豆科树木，具有多种用途，包括退化土地的恢复、农林业系统、木材生产、景观美化以及饲料来源。尽管该物种具有生态潜力和适应性，但其幼苗在生长初期对水分缺乏特别敏感，这可能影响其在野外的存活和生长。目前，全球范围内的重新造林和农林业系统都面临着水资源短缺的严峻挑战，尤其是在植物生长初期。即使土壤湿度略有下降，也会导致幼苗生长显著减缓，据报道损失率可高达7.7%[1]。植物对干旱的响应高度依赖于具体环境条件、土壤性质和物种特有的功能特征。气候变化加剧了这一问题，导致降雨不规律性和干旱事件频发，对农业发展尤其是热带和半干旱地区构成了重大挑战。在这些环境中，水分不足会严重影响作物的生长和森林物种的存活率[2]。特别是在半干旱地区，水分缺乏会严重阻碍生物量的积累和幼苗的存活[2]。因此，提高植物对水分缺乏的适应性的策略日益受到关注。其中，使用促进植物生长的微生物（PGPM），包括有益的根际细菌如Bacillus aryabhattai，被认为是一种有前景的方法[4]。研究表明，Bacillus菌株可以通过产生植物激素、增强养分吸收和激活抗氧化防御机制来提高植物的耐旱性。此外，这些微生物还能改善根际环境，有助于在不利条件下维持土壤微生物群落的平衡并提升植物表现[5]。然而，许多相关研究是在受控或温带条件下进行的[6, 7]，其在半干旱环境中的有效性仍存在不确定性，因为这些地区通常温度较高、土壤湿度波动大且养分贫瘠[8, 9]。这种环境依赖性凸显了进行特定环境评估的必要性[10]。除了微生物策略外，硅（Si）也被广泛认为对提高植物耐旱性有益。它有助于形成物理屏障以减少水分流失，增强植物组织，并激活抗氧化系统以减轻干旱造成的损害[11, 12]。然而，Si的益处因物种和环境条件而异，在农业作物或受控环境中的积极效果并不总能在半干旱田间条件下得到复制[13, 14, 15]。最近的研究强调了Si与土壤微生物的协同作用，可以促进植物生长、改善土壤健康并增强对非生物胁迫的耐受性[16, 17]。因此，结合使用Si和B. aryabhattai可能是一种综合策略，即使在水分有限的情况下也能促进幼苗的健壮生长。

材料与方法：
实验地点与土壤特性分析：本研究在巴西塞阿拉联邦大学（UFC）皮西校区（Fortaleza）的土壤科学系温室中进行，所用土壤取自该大学的城市农业教学与研究中心。实验期间，温室内的平均气温为29°C，相对湿度为75%。实验中使用的聚乙烯温室覆盖材料能透过约70-80%的太阳光合有效辐射（PAR）。土壤采样深度为0.0-0.2米，化学和物理分析由塞阿拉气象与水资源基金会（FUNCEME）的实验室完成。实验所用土壤的化学和物理特性如下：水中pH值为4.5；K?含量为0.18 cmolc kg?1，Ca2?含量为2.40 cmolc kg?1，Mg2?含量为0.40 cmolc kg?1，Na?含量为0.06 cmolc kg?1，H? + Al3?含量为4.46 cmolc kg?1，Al3?含量为0.50 cmolc kg?1。碱度（SB）总和为3.04 cmolc kg?1，总阳离子交换容量（CEC）为7.44 cmolc kg?1，碱饱和度（V%）为41.0%。有机质（OM）含量为21.39 g kg?1，其中碳（C）含量为12.49 g kg?1，氮（N）含量为1.36 g kg?1，C/N比为9。颗粒大小分布显示，土壤中粘土含量为37.0 g kg?1，沙子含量为868.0 g kg?1，粉砂含量为95.0 g kg?1。土壤pH值采用1:2.5的土壤与水比例测定。可交换钙（Ca2?）、镁（Mg2?）和铝（Al3?）用1 mol L?1 KCl溶液提取，潜在酸度（H + Al）则使用pH 7缓冲的0.5 mol L?1醋酸钙测定。阳离子交换容量（CEC）通过计算Ca2?、Mg2?、K?、H?和Al3?的浓度总和得出，碱度（SB）则通过Ca2?、Mg2?、K?和Na?的合计值计算得出。碱饱和度（V%）为SB与CEC的比值，以百分比表示。土壤质地（粘土、沙子和粉砂含量）采用[22]描述的方法通过移液管法测定。

实验设计：采用完全随机设计，采用两因素因子排列，包括：（i）两种灌溉水平（50%和100%的田间持水量）；（ii）四种处理方式：对照组（无接种剂或Si）、B. aryabhattai处理、Si处理以及B. aryabhattai+Si处理。每种处理重复四次，共计32个实验单元。

基于土壤水分参数确定水分水平：为了确定50%和100%的水分水平，在UFC的土壤物理实验室分别三次测量了土壤的田间持水量（FC）和永久萎蔫点（PWP）。FC使用张力计在10 kPa下测定，PWP使用Richards室在1500 kPa下测定[23]。根据这些值，根据以下公式计算所需灌溉水量：$$\text{VI}={\left(\text{Vp}-\text{Vd}\right)}/{\left(1-\text{L}\right)}$$其中VI为需灌溉的水量（mL）；Vp为已灌溉的水量（mL）；Vd为排出的水量（mL）；L为淋溶分数（0.15）。根据排水渗漏仪原理调整水分水平[24]，保持对照组土壤湿度为100%（高水分水平），水分胁迫处理组为50%（低水分水平），并在整个实验期间持续监测土壤湿度。

实验设置：Mimosa caesalpiniifolia的栽培在装有3公斤预先测定过化学性质的土壤的盆中进行。根据这些数据，使用白云石石灰（中和能力为95%）调整土壤酸度，以达到50%的碱饱和度（V%）。经过15天的培养后，施用硅（Si），使用硅酸钠（Na?SiO?）作为硅源，施用量根据先前的研究确定[25, 26]。施用后彻底混合土壤并继续培养7天。播种前，将M. caesalpiniifolia种子浸泡在70%乙醇中30秒以降低表面张力，然后用1%次氯酸钠溶液消毒10分钟，再用无菌蒸馏水多次冲洗以去除残留的次氯酸盐[27, 28]。表面消毒后，用Bacillus aryabhattai CMAA 1363菌株进行接种，该菌株是Embrapa与NOOA Ciência e Tecnologia合作开发的商业产品AURAS?的成分之一，施用量为每公斤种子4毫升，并充分混合以确保接种剂均匀分布。每个盆中种植四粒种子，发芽一周后间苗，每个实验单元保留一株幼苗。M. caesalpiniifolia幼苗在温室中生长至出苗后90天（DAE）。

分析测量：出苗后90天，收集植株并将其分为叶片、茎和根部分，然后放入纸袋中进一步分析。收获时记录的生长参数包括高度、叶片数量、茎直径、根长和干生物量。**植物生长参数**
根据水分水平和处理方式的不同，M. caesalpiniifolia幼苗的生长情况存在显著差异（图1）。在100%水分水平下，所有处理的茎干和根系的干质量、叶片数量以及根长均较高（图2A、B、E、F）。在100%水分水平下，单独施用B. aryabhattai和Si的处理组中，植株高度显著增加，分别比对照组高出约13%和7%（图2C）。相比之下，在50%水分水平下，所有处理的茎干直径均较低（图2D）。

**幼苗质量**
在100%水分水平下，所有处理的幼苗稳健性指数（Robustness Index）值均较高，尤其是单独施用B. aryabhattai和Si的处理组（图3A）。同样，在100%水分水平下，Dickson质量指数（Dickson Quality Index）也较高（图3B）。

**生理参数**
无论水分水平如何，B. aryabhattai + Si处理组中的叶绿素A、叶绿素B、总叶绿素和类胡萝卜素的含量均最高（图4A、B、C、D）。然而，在50%水分水平下，水分利用效率（Water Use Efficiency, WUE）较高（图4E）。

**微生物活性**
在50%水分水平下，接种B. aryabhattai后，再结合B. aryabhattai + Si的处理组显示出最高的土壤基础呼吸速率（Soil Basal Respiration, SBR）均值，分别比对照组高出约87%和75%（图5A）。在50%水分水平下，对照组和Si处理组的微生物生物量碳（Microbial Biomass Carbon, MBC）值最高（图5B），同时qCO?值最低（图5C）。

**土壤酶活性**
在50%水分水平下，B. aryabhattai + Si处理组中的芳基硫酸酯酶（Arylsulfatase）活性最高（图6A）；而β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）活性在单独施用B. aryabhattai的处理组中最高（图6B），分别比对照组高出约600%和140%。无论水分水平如何，B. aryabhattai + Si处理组中的酸性磷酸酶（Acid Phosphatase）活性也较高；在100%水分水平下，无论是否施用B. aryabhattai或Si，酸性磷酸酶活性也较高（图6C）。B. aryabhattai的存在使得在100%水分水平下，无论是单独施用还是与Si结合使用时，碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）活性均显著增加（图6D）。在100%水分水平下，B. aryabhattai + Si处理组中的脲酶（Urease）活性最高，比对照组高出约100%（图6E）。

**植物组织中的硅含量**
采用[37]方法测定茎、根和土壤中的硅浓度。将干燥并研磨后的0.1克茎或根样品与2毫升30% H?O?和3毫升50% NaOH混合，在Falcon管中消化。混合物在85°C的水浴中加热1小时，然后在123°C、1.5 atm的压力下高压灭菌1小时。消化后，样品通过分光光度计在410纳米波长下进行分析。土壤中可利用的硅含量按照[38]方法测定。将干燥并过筛的土壤样品（10克）转移到塑料Erlenmeyer烧瓶中，加入100毫升0.5摩尔/升的醋酸溶液，水平振荡器中振荡1小时。之后过滤样品，并在660纳米波长下通过分光光度计测定硅浓度。

**统计分析**
对整个数据集进行了初步的统计假设评估，通过Shapiro-Wilk检验评估数据正态性分布，通过Levene检验检查方差齐性。在这些评估之后，使用F检验（p < 0.05）进行方差分析（ANOVA）。当检测到显著差异时，使用Scott-Knott检验在同一置信水平上进行均值比较。统计分析使用AgroEstat软件（版本1.1.0.712）[39]进行。使用R软件（版本2024.12.1）和corrplot包进行Spearman等级相关性分析，仅呈现显著相关性（p < 0.05）。

**结果**
**生长参数**
M. caesalpiniifolia幼苗的生长受水分水平和处理方式的显著影响（图1）。在100%水分水平下，所有处理的茎干和根系干质量、叶片数量以及根长均较高（图2A、B、E、F）。在100%水分水平下，单独施用B. aryabhattai和Si的处理组中，植株高度显著增加，分别比对照组高出约13%和7%（图2C）。相反，在50%水分水平下，所有处理的茎干直径均较低（图2D）。

**幼苗质量**
在100%水分水平下，所有处理的幼苗稳健性指数值均较高，尤其是单独施用B. aryabhattai和Si的处理组（图3A）。同样，在100%水分水平下，Dickson质量指数也较高（图3B）。

**生理参数**
无论水分水平如何，B. aryabhattai + Si处理组中的叶绿素A、叶绿素B、总叶绿素和类胡萝卜素的含量均最高（图4A、B、C、D）。然而，在50%水分水平下，水分利用效率较高（图4E）。

**微生物活性**
在50%水分水平下，接种B. aryabhattai后，再结合B. aryabhattai + Si的处理组显示出最高的土壤基础呼吸速率（SBR）均值（图5A）。在50%水分水平下，对照组和Si处理组的微生物生物量碳（MBC）值最高（图5B），而qCO?值最低（图5C）。

**土壤酶活性**
在50%水分水平下，B. aryabhattai + Si处理组中的芳基硫酸酯酶活性最高（图6A）；而单独施用B. aryabhattai的处理组中β-葡萄糖苷酶活性最高（图6B），分别比对照组高出约600%和140%。无论水分水平如何，B. aryabhattai + Si处理组中的酸性磷酸酶活性也较高；在100%水分水平下，无论是否施用B. aryabhattai或Si，酸性磷酸酶活性也较高（图6C）。B. aryabhattai的存在使得在100%水分水平下，无论是单独施用还是与Si结合使用时，碱性磷酸酶活性均显著增加（图6D）。

**植物组织中的硅含量**
在100%水分水平下，B. aryabhattai处理组中的茎部硅含量最高（图7A）。在根部，B. aryabhattai + Si处理组的硅含量最高（图7B）；在土壤中，B. aryabhattai单独处理组的硅含量最高（图7C）。

**不同水分水平下的生理、土壤生物学特性与植物生长关系**
Spearman相关性分析显示，在不同水分水平下，植物生长、生理特性、土壤酶活性、微生物属性和植物组织及土壤中的硅含量之间存在关联（图8）。在50%水分水平下（图8A），显著相关性较少。植物生长特性与土壤生物学属性的关联有限，尤其是高度、茎干直径和叶片数量方面多为负相关。根系干质量与β-葡萄糖苷酶和脲酶呈正相关。稳健性指数与土壤基础呼吸速率、β-葡萄糖苷酶和脲酶呈正相关，而Dickson质量指数与脲酶呈负相关。在100%水分水平下（图8B），显著相关性更为频繁。茎干干质量与光合色素呈正相关。相比之下，茎干直径与β-葡萄糖苷酶和芳基硫酸酯酶呈负相关，而根长与光合色素呈负相关。稳健性指数与芳基硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶和水分利用效率呈正相关，而Dickson质量指数与土壤基础呼吸作用和碱性磷酸酶呈正相关。在不同水分条件下，硅组分与植物生长性状之间的负相关关系比在50%水分水平时更为常见。图8显示了在不同水分条件下，植物生长和幼苗性状与生理参数、土壤微生物活性、土壤酶活性以及植物组织和土壤中硅浓度之间的关系（A）50%水分水平；（B）100%水分水平。颜色强度代表相关性的强度和方向（蓝色=正相关，红色=负相关）。星号表示显著相关性（p<0.05）。Si shoot、Si root和Si soil分别代表茎、根和土壤中的硅浓度。

讨论
在这项研究中，我们评估了应用B. aryabhattai和硅（Si）促进M. caesalpiniifolia幼苗生长和生理表现的潜力，同时考察了它们对不同水分胁迫下土壤生物活性的影响。主要研究结果证实，水分供应对M. caesalpiniifolia的发育至关重要，显著影响其生长参数。实际上，在水分胁迫条件下，我们观察到茎和根的干质量以及叶片数量和根长都有显著减少。尽管单独或联合应用B. aryabhattai和硅显示出相对积极的效果，但水分限制仍然是主导因素，表明M. caesalpiniifolia的早期营养生长对水分短缺特别敏感。这种敏感性可能与幼苗的生理特性有关，这些特性可能倾向于快速初期生长[40]。虽然硅被广泛认为在缓解非生物胁迫方面发挥作用，但其单独或与B. aryabhattai联合应用并未显著改善所评估的形态性状。这种反应可能与低蒸腾条件下植物内部硅运输的限制有关[41]。特别是在50%水分水平下，根中观察到的高硅浓度支持了这一假设，表明硅优先分配给根系。相关性分析进一步证实了这一解释，揭示了在水分不足时，根中的硅与生长性状之间的关联更为紧密，表明硅向茎部的转移受到限制。这种有限的分布可能限制了硅向茎部的移动，而茎部是进行光合作用和调节水分损失的关键过程发生的地方[42]。此外，值得注意的是，接种根瘤菌的植物在长期栽培（通常超过90天）后通常表现出更明显的生理和形态反应[43]。据报道，这种共生相互作用的最显著效果通常在接种后120至270天之间出现，这可能部分解释了本早期研究中各处理组之间没有更显著差异的原因。

稳健性指数和Dickson质量指数被广泛认为是森林幼苗活力和质量的重要指标[25, 26]。根据[44]建立的标准，Dickson质量指数低于0.2表明幼苗不适合移植到田间，而较高的指数则与更高的存活和建立潜力相关。在本研究中，无论是否施用硅或B. aryabhattai，100%水分条件下的Dickson指数值都较高。尽管施用硅或B. aryabhattai已被证明可以增强对非生物胁迫的耐受性[5, 44]，但它们单独或联合应用的效果不足以缓解水分限制对幼苗性状的影响。另一方面，单独施用B. aryabhattai和硅时，稳健性指数有显著变化。这种变化可能与幼苗高度的增加有关，该参数直接包含在指数计算中。然而，观察到的增益不足以克服水分不足带来的限制。这些发现进一步强调了水分供应是M. caesalpiniifolia幼苗质量的主要决定因素，而在严重胁迫条件下，硅和接种剂的贡献较为有限。

从生理学角度来看，植物对处理交互作用的反应最为敏感。在我们的研究中，水分胁迫下的水分利用效率更高，这可以归因于气孔限制的增强，这是植物减少蒸腾作用以节约水分的常见适应性反应[45]。虽然这种机制有助于水分保存，但它也限制了二氧化碳的吸收，从而影响了碳固定与水分损失之间的平衡。因此，在严重干旱条件下，提高水分利用效率并不一定转化为更高的生物量。此外，在我们的研究中，无论水分供应如何，施用硅和B. aryabhattai的植物中叶绿素和类胡萝卜素的浓度都更高。色素与茎生物量之间的正相关关系，尤其是在水分充足的情况下，表明色素的保存有助于有效积累生物量。这种模式表明在保护与光合作用相关的色素方面存在协同效应，可能与其抗氧化损伤的减轻或抗氧化机制的激活有关[46]。类似的结果也被[47]报道，他们发现施用硅或B. aryabhattai后，Zea mays在水分不足时的相对水分含量更高，色素降解更低。同样[48]观察到，在中等胁迫下用硅处理的豆科植物中叶绿素和类胡萝卜素水平增加，表明这种保护作用通过膜稳定性和降低脂质过氧化来实现。

土壤微生物活性指标揭示了硅和B. aryabhattai在碳动态中的功能相互作用。相关性进一步表明，在100%水分条件下，微生物生物量和酶活性与茎生物量和幼苗质量指数呈正相关，表明在水分不受限时植物和微生物变量之间的关联更为紧密。在50%水分条件下，单独或联合施用B. aryabhattai的处理中，SBR（土壤呼吸速率）的增加表明即使在水分限制下，微生物代谢活动也得到增强。这种反应可能与B. aryabhattai诱导的根系分泌物增加有关，这些分泌物可以为微生物群提供易于吸收的底物，此外微生物可能产生胞外多糖，从而增强根际的水分保持能力并保护微生物细胞[43, 49]。相反，在干旱条件下，对照组和仅施用硅的处理中MBC（微生物生物量）较高，表明微生物采取了保守策略，碳稳定性和周转率较低[49]。这种解释与观察到的低qCO?值一致，表明微生物碳利用效率更高[50]。这些结果表明，即使在水分不足时叶片对硅的吸收受到限制，硅仍能对土壤生态系统产生有益的间接影响。因此，硅和B. aryabhattai之间的相互作用倾向于创造更稳定和受保护的微环境，从而在水分胁迫下提高代谢效率和微生物韧性。

土壤酶活性受到B. aryabhattai接种和硅应用之间相互作用的显著调节，特别是在50%水分条件下。参与有机硫化合物矿化的芳基硫酸酯酶活性显著增加，表明可利用硫的释放更多。这种效应可能与根际微生物群落对联合刺激的响应有关[51]。仅在B. aryabhattai处理中，β-葡萄糖苷酶活性显著增强，表明土壤中的腐生活动增强，碳动态更为活跃。负责释放有机磷的酸性磷酸酶在B. aryabhattai和硅联合处理中表现出最大活性，表明这种关联促进了无论水分条件如何都能促进磷的吸收[52]。同样，碱性磷酸酶和脲酶在这些剂联合应用下的活性也更高，表明酶反应特定于每种酶和目标营养物质，并且也受到土壤水分供应的调节。这些结果加强了硅和促进植物生长的微生物联合体作为根际功能催化剂的潜力，即使在水分限制条件下也能增强必需营养物质的可用性[53]。因此，在水分受限的土壤中联合应用这些剂可能有助于改善土壤条件，刺激关键生化过程，促进养分循环并提高生物肥力。因此，这种管理方法可能有助于恢复土壤质量并重新植被退化区域，为其他植物物种在不利环境中的建立和生长创造更有利的条件。

植物和土壤中的硅浓度显示出根据水分水平和处理类型的不同分配。仅在100%水分条件下，特别是在B. aryabhattai处理中，茎中的硅浓度较高，表明元素的吸收和运输直接依赖于蒸腾流和与根际微生物群相关的根活动[54]。在水分胁迫下，水分质量流受到限制，限制了硅通过木质部的运输，导致其滞留在根部[55]。这种滞留可能为根部提供结构保护，防止细胞塌陷，促进外皮层的发展，并调节根系分泌物。另一方面，在100%水分条件下，施用硅的处理中土壤中硅的可用性较高，表明部分元素留在土壤溶液中，但并不一定被大量吸收，这加强了水分梯度在活性硅运输中的作用[56]。硅的生理效应强烈依赖于水分条件，在有利于蒸腾的条件下更为有效，这是其运输的主要驱动力，在严重水分胁迫下效果较差[57]。这种行为也被[58]描述，他们观察到在水分不足时Triticum aestivum的根部硅积累增加，但由于蒸腾流减少，向茎部的转移较少。同样[59]报告，在胁迫条件下，硅倾向于在根组织中积累，促进细胞壁增厚并保护细胞免受干燥，而其向茎部的转移仍然受到限制。总体而言，这些发现表明硅的有效性受到植物水分状态的强烈调节，在维持蒸腾流的条件下生理表达更强。

结论
M. caesalpiniifolia幼苗的生长和质量受到水分限制的显著影响，突显了该物种对干旱胁迫的敏感性。在水分限制下生长的幼苗表现出生物量积累和质量指数的显著减少，强调了充足水分供应对成功建立的重要性。B. aryabhattai和硅的联合使用与更高的生理表现和土壤酶及微生物功能的改变相关，变化幅度取决于所评估的酶和土壤湿度条件。研究结果表明，B. aryabhattai和硅的结合可以增强土壤生物功能，并促进更有利于根际的条件，即使植物生长增益受到干旱强度的限制。这种相互作用显示出在半干旱环境中产生更具韧性的幼苗的潜力，通过促进土壤功能恢复来实现生态恢复。这种方法的有效性取决于干旱强度，需要进一步跨物种和更长时间栽培的研究来确定其在半干旱条件下的一致性和田间适用性。