塞西纳干腌牛肉中产霉菌毒素的青霉菌多样性表征及多相识别策略应用

《Foods》：Effects of Sequential Fermentation with Saccharomyces bayanus and Lactobacillus brevis on the Metabolite Composition and Antioxidant Activity of Chinese Yam Juice Aroosa Mushtaq, Zhoumei Huang, Xiangning Ma, Jun Sun, Chen Ma and Fang Chen

本研究针对西班牙传统干腌牛肉（Cecina de León）表面在成熟过程中易被真菌（特别是产霉菌毒素的青霉菌）大量定植，存在潜在食品安全风险的问题，开展了为期两年的真菌群落与产毒素潜力评估。研究采用多相鉴定法，成功分离并表征了16种青霉菌，发现其中51%的菌株具有产霉菌毒素能力，为制定针对性控制策略提供了科学依据。

　　

想象一块经过数月风干、烟熏，最终呈现诱人红色的西班牙传统干腌牛肉——塞西纳（Cecina de León）。它的表面往往会覆盖一层肉眼可见的、毛茸茸的霉菌“外衣”。在传统干腌肉类（如火腿、香肠）的制作中，某些有益真菌是风味形成的关键“功臣”。然而，这其中也可能混入不速之客——能够产生霉菌毒素（mycotoxins）的有害真菌，它们悄悄潜伏，不仅可能破坏产品品质，更会带来潜在的健康风险。长期以来，对于塞西纳这样具有地理标志保护（PGI）的传统肉制品，其表面真菌群落的具体构成，特别是其中产毒素青霉菌（Penicillium）的种类和潜在风险，人们却知之甚少。随着塞西纳在国际市场上日益受到追捧，系统评估其生产过程中的微生物安全，变得尤为迫切。

为此，一个研究团队开展了一项深入调查，旨在全面描绘与塞西纳及其生产环境共生的真菌世界，特别聚焦于青霉菌的种类及其产毒素潜力。这项研究历时两年，从西班牙莱昂省的肉类加工厂和当地市场采集了78份塞西纳样品和26份空气样本，运用了多相鉴定、霉菌毒素筛查、MALDI-TOF质谱分析等综合技术。相关成果发表在食品科学领域的国际期刊《Foods》上。

为开展研究，研究人员采用了多种关键的技术方法。首先，从塞西纳表面和其生产环境中（包括熟成室、烟熏室）系统采集了样本，并测定了其基本理化参数水活度（a_w）和pH值。核心鉴定工作采用了“多相鉴定”策略，整合了菌落宏观与微观形态学观察、针对特定霉菌毒素（如环匹阿尼酸CPA、赭曲霉毒素A OTA等）的产毒能力分析（HPTLC和HPLC-PDA技术），以及基于β-微管蛋白（BenA）、钙调蛋白（CaM）和ITS区的分子标记测序。此外，研究还引入了MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）作为一种快速补充鉴定工具，并通过加入特定菌株的主谱图（MSPs）对商业数据库进行了增强。统计分析方法则用于评估不同变量（如a_w、pH、熟成时间与霉菌数量、产毒菌株数量）之间的相关性。

研究结果：

3.1. 塞西纳的理化参数

分析显示，塞西纳样品的水活度（a_w）平均值为0.89 ± 0.03，pH值为5.93 ± 0.21，与文献中报道的该产品典型值一致。统计分析发现，样品的熟成时间与pH值存在显著关联，但与a_w的相关性未达到统计学显著性。

3.2. 与塞西纳及空气样本相关的真菌菌群

从所有样本中共分离到117株真菌，其中青霉菌属（Penicillium）占据绝对优势，占所有霉菌分离株的88%。通过多相鉴定方法，共鉴定出16种不同的青霉菌。其中，普通青霉（P. commune）是塞西纳和空气样本中最主要的物种。研究还设计了一个基于形态和产毒特征的流程图，成功快速鉴定了51株青霉菌。除了青霉，研究还发现了曲霉（Aspergillus）、枝孢菌（Cladosporium）等其他属的真菌，它们通常与肉类腐败有关。酵母菌以Candida famata（即Debaromyces hansenii）为主。分子系统发育分析证实了基于β-微管蛋白（BenA）和钙调蛋白（CaM）基因的鉴定结果具有可靠性，而ITS区在该研究中分辨率较差。

3.3. MALDI-TOF MS鉴定

MALDI-TOF MS被用作多相鉴定的补充工具。在默认数据库下，其只能可靠区分16种青霉中的6种。通过向数据库中添加普通青霉（P. commune）和P. solitum的自建主谱图（MSPs），其鉴定准确率得到显著提升。结果表明，MALDI-TOF MS在数据库足够丰富时，可成为青霉菌快速鉴定的有力工具，但需结合形态学和产毒谱分析以提高准确性。

3.4. 食品安全考量

在分离出的89株青霉菌中，有45株（51%）能够产生至少一种所筛查的霉菌毒素（CPA, OTA, PAT, CIT, GRI, MPA）。其中，普通青霉（P. commune）、P. nordicum和P. verrucosum的所有测试菌株均表现出100%的产毒能力。这凸显了在塞西纳中监测这些霉菌毒素（尤其是CPA和OTA）的重要性。目前，欧盟层面尚未对肉制品设定霉菌毒素的限量标准。

研究结论与重要意义

本研究首次系统揭示了西班牙传统干腌牛肉塞西纳所关联的、高度多样化的真菌群落，填补了该领域的知识空白。研究发现，普通青霉（P. commune）是定植于塞西纳表面的优势菌种，其产生环匹阿尼酸（CPA）的能力，以及其他产霉菌毒素物种的存在，指明了潜在的健康风险，为基于证据的食品安全管理决策提供了支持。

在方法论上，研究证实了β-微管蛋白（BenA）和钙调蛋白（CaM）基因标记在与表型特征结合的多相分类学中，能提供可靠的物种水平鉴别，而单独依赖分子数据可能导致鉴定模糊。同时，MALDI-TOF MS在数据库扩展后，展现出对青霉菌及相关真菌进行常规鉴定的巨大潜力，当与形态学和代谢物谱分析整合时，可以减少在时间和成本敏感情境下对分子方法的依赖。

这项研究的意义在于，其综合评估结果为制定针对性的监测和预防策略提供了科学基础，有助于提升干腌肉制品的质量和安全。特别是，通过实施环境监测计划、控制温湿度、以及强化良好生产规范（GMP），有望在整个生产过程中减少产霉菌毒素真菌的存在，从而保障这一具有重要经济和文化价值的传统食品的安全。