两种新型PCR检测方法的开发与初步评估：用于提高对猪带绦虫（Taenia saginata）和牛带绦虫（Taenia solium）卵的检测灵敏度

《Food and Waterborne Parasitology》：Development and preliminary evaluation of two novel PCR assays for improved detection of Taenia saginata and Taenia solium eggs

　　赛义德·穆萨·拉扎·纳克维（Syed Musa Raza Naqvi）|彼得·格尔德霍夫（Peter Geldhof）|英格·范达姆（Inge Van Damme）|莎拉·加布里埃尔（Sarah Gabri?l）
比利时根特大学兽医学院转化生理学、传染病学和公共卫生系食源性寄生虫人畜共患病实验室，地址：133 Salisburylaan, B-9820 Merelbeke

**摘要**
牛带绦虫（Taenia saginata）和猪带绦虫（Taenia solium）的卵通过露天排便和废水传播到环境中。本研究针对在复杂环境中检测这两种绦虫卵污染的迫切需求，开发了敏感且特异的分子方法。设计了两种聚合酶链反应（PCR）检测方法：一种专门针对牛带绦虫，另一种可以同时检测这两种绦虫。引物针对线粒体cox1基因设计。使用从绦虫卵中提取的DNA评估了这些PCR方法的初步敏感性。将这两种新开发的PCR方法与三种已使用的PCR方法进行了比较，这些方法使用了来自不同年龄段的牛带绦虫节片的10批卵样本（年龄范围为2至89周）。每批样本中分别取1个、2个和5个卵，使用微拾取放置系统进行三次重复实验。还测试了1批猪带绦虫卵中的2个和5个卵。为了验证特异性，这些PCR方法还针对基因相似的寄生虫进行了测试，包括囊尾蚴绦虫（Taenia hydatigena）、多房棘球绦虫（Echinococcus spp.）和微小膜壳绦虫（Hymenolepis spp.）。结果显示，针对牛带绦虫的PCR方法敏感性为92%，针对猪带绦虫的PCR方法敏感性为87%。囊尾蚴绦虫、多房棘球绦虫、颗粒棘球绦虫、加拿大棘球绦虫和微小膜壳绦虫的DNA在使用这两种新方法时均未产生扩增产物。该研究验证了这两种新PCR方法在检测环境污染方面的潜力。

**1. 引言**
牛带绦虫和猪带绦虫是重要的食源性绦虫，对公共卫生和经济造成威胁。牛带绦虫主要感染人类小肠，广泛存在；牛作为中间宿主被感染后，其肌肉中会形成活的囊尾蚴，导致牛囊尾蚴病。在比利时，牛肉产业因此遭受了重大经济损失，每年约有10,991人因绦虫病接受治疗（Jansen等人，2018年）。猪带绦虫主要分布在撒哈拉以南非洲、拉丁美洲和东南亚地区。人类是最终宿主（患绦虫病），若摄入猪带绦虫卵则可能成为偶然的中间宿主，导致神经囊尾蚴病，这是地方性癫痫的主要原因（Gabri?l等人，2017年）。这两种绦虫可通过食用未煮熟的牛肉（牛带绦虫）或猪肉（猪带绦虫）感染。人类会将绦虫卵排入环境中，露天排便会导致卵直接沉积在环境中；如果厕所处理不当，尤其是在暴雨期间，废水可能污染牧场和水体（Verbyla等人，2013年）。附近土地被废水淹没、使用污水污泥作为肥料以及地表水易被污染都是关键风险因素（Jansen等人，2021年）。目前主要研究了牛带绦虫卵在环境中的存活能力，发现其可在环境中存活长达1年；北欧的冬季条件更有利于卵的存活，增加了传播风险（Bucur等人，2019年）。相比之下，猪带绦虫卵在环境中的存活情况研究较少。湿度有助于卵的存活，而干燥会缩短其存活时间；洪水、溪流和蜣螂活动可能将卵扩散到环境中（Wardrop等人，2015年）。传统上通过显微镜技术检测人类粪便样本中的绦虫卵来诊断绦虫病，但这些方法的敏感性和特异性有限。不同种类的绦虫卵形态相似，因此显微镜鉴定无法区分物种（Galán-Puchades，2022年）。还使用了其他方法，如粪便中的寄生虫特异性抗原检测（copro-Ag-ELISA，Guezala等人，2009年；Tembo和Craig，2015年）。已开发多种分子方法用于诊断人类绦虫病（Roelfsema等人，2016年；Song等人，2019年）。也有研究调查土壤、水、昆虫和蔬菜样本中的污染情况。有研究将先前设计的PCR方法改进为数字滴液PCR，用于检测土壤样本中的猪带绦虫卵（Maganira等人，2019年），后来该方法被应用于坦桑尼亚的土壤污染检测（Maganira等人，2020年）。另有研究将传统PCR方法改进为实时PCR，用于检测浆果和绿叶蔬菜上的绦虫卵（Frey等人，2019年）。然而，最初为临床诊断设计的分子工具在环境样本检测中可能表现不佳，可能因环境中的未知分布、低卵浓度以及DNA损伤而影响灵敏度和特异性（Alvarez Rojas等人，2018年）。在恶劣环境中DNA易降解，可能仅存在短片段（Huver等人，2015年）。建议目标DNA片段长度不超过300 bp以提高PCR敏感性（Deagle等人，2006年；Hashizume等人，2017年）。针对土壤和废水等环境样本的方法需要进一步开发和标准化，考虑潜在抑制剂的存在及最佳处理方式以获得纯DNA（Saelens等人，2022年）。本研究旨在开发两种分子方法来检测环境中牛带绦虫和猪带绦虫卵的污染情况。

**2. 材料与方法**
**2.1. 分子方法**
开发了一种针对牛带绦虫的特异性PCR方法和一种通用绦虫PCR方法。本文中分别将其称为方法1（针对牛带绦虫的PCR方法）和方法2（通用绦虫PCR方法）。两种方法均以cox1基因为目标，因为线粒体基因组存在多个拷贝，从而确保更高的敏感性（Roelfsema等人，2016年）。方法1使用的引物为：F: 5′-TGGGTGCTGGTATAGGGTGG-3′；R: 5′-CTAGACGCACCCGCCAAATG-3′，扩增产物长度为112 bp。方法2使用的引物为：F: 5′-TTGGTCATCCMGAGGTTTATG -3′；R: 5′-GTCTTAACATCTAACCCAACCGTA ?3′，扩增产物长度为192 bp。引物设计基于GenBank中的牛带绦虫（AY684274）和猪带绦虫（AB086256）参考序列。使用NCBI工具Primer3生成引物，目标PCR产物长度设定为100至300 bp。引物熔解温度（Tm）优选为61°C，最大差异为3°C。引物的GC含量至少为45%。允许最多五个错配，其中三个碱基对位于3′端。使用BLAST软件评估引物与其他GenBank序列的亲和性，使用IDTDNA的Oligo Analyzer检测二级结构（如异构体和自身二聚体、发夹结构）。方法2设计的引物对可同时扩增牛带绦虫和猪带绦虫的同一基因位点。为准确区分两种目标物种，需对PCR产物进行下游测序。使用CLUSTALW比对目标寄生虫的cox1基因，确认引物的结合情况。选定引物的反向引物能完全结合两种目标。为优化与两种寄生虫的结合，将退化碱基加入正向引物中。每种PCR反应混合物包含25 μL反应液：12.5 μL GoTaq G2 Hot Start Master Mix、每种引物0.35 μL（浓度25 μM）、9.8 μL无核酸酶水和2 μL提取的DNA。方法1的PCR循环条件为：94°C变性2分钟，随后45个循环（每次变性15秒、退火30秒、延伸45秒），最后在72°C延伸7分钟。方法2的循环条件相同，但退火温度为61°C。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳（120 V，60分钟）检测，用溴化乙锭染色，并在紫外光下观察。

通过评估新开发的方法1和方法2的初步敏感性，将其与三种已发表的PCR方法进行比较：方法3（Trachsel等人，2007年）用于诊断棘球绦虫和绦虫病，针对线粒体rrnS基因，扩增产物长度为267 bp；方法4（Rodriguez-Hidalgo等人，2002年）扩增线粒体12S rDNA基因，产物长度为798 bp，随后通过限制性内切酶进行消化以区分物种。本研究未进行消化操作，因为无需进一步区分物种。方法4分别应用于5 μL和0.5 μL的DNA样本，称为方法4a和方法4b。方法4a和方法4b的阳性及阴性对照相同（图2、图5）。方法5（Yamasaki等人，2004年）基于扩增牛带绦虫、猪带绦虫和亚洲带绦虫的cox1基因片段（长度分别为827 bp、720 bp和269 bp）（见图1）。

**2.2. 敏感性评估实验**
使用10批牛带绦虫节片样本评估方法的初步敏感性。每批样本中分别取1个、2个和5个卵进行三次重复实验（补充图1A）。这些节片来自比利时的五个临床实验室，采集时间跨度为两年，年龄范围为2至89周。年龄根据样本到达实验室至DNA提取日期计算。用无菌刀片分割妊娠节片，用镊子轻轻压碎，悬浮在PBS中并通过40 μm滤膜去除杂质。过滤后的卵用PBS和抗生素（每毫升PBS含青霉素1 IU和链霉素1 μg）在4°C下保存。使用微拾取放置系统（Nepa Gene Co. Ltd., Ichikawa, Chiba, Japan）精确计数和提取卵。每次实验分别取1个、2个或5个卵。

**2.3. 特异性评估**
使用多种密切相关的绦虫DNA（包括囊尾蚴绦虫、多房棘球绦虫、颗粒棘球绦虫和加拿大棘球绦虫）评估分析特异性。这些DNA样本来自意大利高等卫生研究院（ISS）下属的欧盟寄生虫参考实验室（https://www.iss.it/en/eurlp-chi-siamo）。微小膜壳绦虫和微小膜壳绦虫也用于特异性分析。牛带绦虫的阳性对照包括囊泡和节片的混合DNA，猪带绦虫的阳性对照仅使用囊泡DNA。**统计分析**
每种PCR检测的初步灵敏度是通过检测到的阳性卵提取物的比例来计算的。为了考虑同一批次中T. saginata卵的聚集现象，使用了aods3包中的varbin函数（Lesnoff, 2018）来估计概率和方差，该函数专为聚集的二项数据设计。应用了自助法（bootstrap method）以获得稳健的估计值。同样，也评估了每种方法在不同接种水平下的初步灵敏度。对于T. solium，仅使用了一批次卵，但对每个批次中的两个和五个卵分别进行了三次提取，因此在计算置信区间时考虑了相同提取物的聚集情况。

**3. 结果**
**3.1. 灵敏度**
**3.1.1. Taenia saginata**
方法1显示出最高的总体初步灵敏度，即92%（95% CI, 84–99%）；方法2的灵敏度为87%（95% CI, 75–100%）。一个批次的结果显示在图2中。方法3产生了一个非特异性条带，其中一个单卵大约位于200 bp处，与原始目标长度267 bp不匹配（图2C）。方法5在200至300 bp之间产生了非特异性扩增（图2F）。通常，方法5会产生269 bp的条带长度用于T. asiatica，但由于使用的卵仅限于T. saginata，因此该条带被归类为非特异性。详细结果见表1。

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**图2. Taenia物种的检测方法。**
(A) 方法1的结果。
(B) 方法2的结果。
(C) 方法3的结果。
(D) 方法4a的结果。
(E) 方法4b的结果。
(F) 方法5的结果。
注意：D和E面板使用相同的阳性对照（5 μl T. saginata和T. solium的DNA）进行PCR分析。三个T. saginata卵的等分样本（泳道1–3）、两个（泳道4–6）和五个（泳道7–9）的结果，使用所有方法进行分析。T. saginata阳性对照（泳道10），T. solium对照（泳道11），阴性对照（泳道12），标记物（M）。

**表1. 5种分子方法检测T. saginata卵的比较初步灵敏度和统计性能。**
两种新开发的分子方法，方法1（T. saginata特异性PCR）和方法2（Taenia spp. PCR），与三种已建立的方法进行了比较：方法3（Trachsel等人，2007年），方法4a和4b（Rodriguez-Hidalgo等人，2002年），以及方法5（Yamasaki等人，2004年）。该表总结了每种方法在三种条件下的灵敏度：一个卵（n = 27）、两个卵（n = 30）和五个卵（n = 30），每种数量都进行了三次重复实验，样本来自医学实验室，年龄范围从2周到89周（未分析单个卵）。阳性数量代表87次试验中的总成功检测次数。灵敏度表示每种方法检测到的阳性百分比。置信区间（CI）包括下限和上限，以95%的水平表示灵敏度估计的统计精度和可靠性。

| 方法 | 阳性数量 | 灵敏度 | CI（下限） | CI（上限） |
|------|--------|--------|---------|---------|
| 方法1 | 80/87 | 92% | 84% | 99% |
| 方法2 | 76/87 | 87% | 75% | 100% |
| 方法3 | 67/87 | 77% | 60% | 94% |
| 方法4a | 76/87 | 87% | 78% | 96% |
| 方法4b | 47/87 | 54% | 36% | 71% |
| 方法5 | 75/87 | 86% | 76% | 96% |

从最少的卵数量（即单个卵）来看，方法1检测到了27个中的23个，方法2检测到了27个中的24个，这比其他方法要高（图3）。方法1和方法5在两个卵的数量上检测到的数量最多。方法1检测到了所有批次中的所有五个卵提取物。图3详细显示了每种方法的初步灵敏度估计值，按卵的数量分类（见图4）。

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**图3. 使用不同分子方法，每批T. saginata的一个、两个和五个卵的阳性样本比例。**

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**图4. 每种方法和每批阳性样本的比例可视化。**
一个点代表一批T. saginata，不考虑单个卵的数量。

在不同卵批次中观察到方法性能的差异。考虑到每个批次的阳性数量，没有观察到随着批次年龄增长的一致模式。新的方法1和方法2在所有批次中表现良好，除了第6批次（40周龄），其中方法2的检测效果较差。详细结果见补充图4。

**3.1.2. Taenia solium**
总体而言，18次T. solium重复实验中有8次获得了阳性结果，且仅通过方法2获得。具体来说，9个中有4个含有两个T. solium卵的批次和9个中有4个含有五个T. solium卵的批次获得了阳性结果。一个重复实验中所有方法的结果显示在图5中。关于其他方法，只有添加了五个T. solium卵的一个提取物通过方法3获得了阳性结果。

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**图5. 使用方法1–5对三个T. solium卵等分样本（泳道1–3）和五个T. solium卵等分样本（泳道4–6）的DNA进行灵敏度分析。**
(A) 方法1的结果。
(B) 方法2的结果。
(C) 方法3的结果。
(D) 方法4a的结果。
(E) 方法4b的结果。
(F) 方法5的结果。
注意：D和E面板使用相同的阳性对照（5 μl T. saginata和T. solium的DNA）进行PCR分析。T. saginata阳性对照（泳道7），T. solium对照（泳道8），阴性对照（泳道9），标记物（M）。

**3.2. 特异性**
T. hydatigena、E. multilocularis、E. granulosus、E. canadensis、H. diminuta和H. nana的DNA使用这两种新方法均未产生任何扩增。T. solium囊泡的DNA使用方法1也未产生任何扩增（图6）。

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**图6. 方法1（A）和2（B）的特异性分析，使用E. canadensis（泳道1）、E. granulosus（泳道2）、E. multilocularis（泳道3）、H. diminuta（泳道4）、H. nana（泳道5）、T. saginata对照（泳道6）、T. solium对照（泳道7）、阴性对照（泳道8）、标记物（M）。**

**4. 讨论**
初步研究结果表明，方法1的初步灵敏度为92%，使其适用于T. saginata普遍存在且是唯一目标的情况。相比之下，方法2的灵敏度稍低，为87%，但其优势在于可以同时检测T. saginata和T. solium，因此更适合这两种物种共存的地区。此外，在讨论检测性能时，必须强调从最少数量的T. solium卵（两个）开始的关键发现，这些结果仅通过方法2获得，表明其性能优于之前的方法。需要注意的是，由于T. solium卵的可用性有限、进口规定以及优先考虑更多卵的数量，灵敏度分析中省略了单个卵。未来的研究应包括使用单个T. solium卵测试方法2，并进一步使用多个批次的卵进行验证。这项初步研究表明了新开发方法的增强潜力。

我们的特异性分析评估了这些PCR检测方法对具有相似基因组特征的相关绦虫的检测能力，重点关注引物的潜在非目标扩增。我们使用这两种方法测试了T. hydatigena、E. multilocularis、E. granulosus、E. canadensis、H. diminuta和H. nana的DNA。如果使用更浓缩的DNA样本（例如临床样本中可能含有更高浓度的DNA），特异性可能会发生变化。在环境样本中，预期的DNA浓度较低，因此这些测试物种的特异性更有可能得到保持。一些其他密切相关的绦虫，如Versteria spp.和Hydatigera spp.，未包含在特异性分析中，这是研究的局限性。由于环境样本中的微生物或生物学复杂性，特异性可能会面临挑战。此外，我们强调准确鉴定物种需要使用这两种新方法对PCR产物进行测序。

DNA的老化会影响分子检测的性能，因为随着时间的推移，DNA在环境中会发生降解（Deagle等人，2006年；Dejean等人，2011年）。针对短扩增子的PCR检测具有更高的灵敏度（Huver等人，2015年）。选择线粒体目标基因（即cox1）可以提高分子检测的灵敏度（Maganira等人，2020年；Maganira等人，2019年）。在本研究中，对于方法1而言，112 bp的目标片段；对于方法2而言，192 bp的目标片段被证明是有利的，与其他方法使用的大型目标片段相比。新开发的检测方法显示出良好的检测能力，有可能在含有老化及降解DNA的生态矩阵中识别目标寄生虫。

本研究中观察到的老化效应并不随节片年龄的增加而均匀下降。尽管我们预期阳性结果会随年龄增加而均匀减少，但我们的发现表明，从35周到78周，总体检测率有所下降，而在最老的批次中阳性比例再次增加。节片在4°C下储存直至DNA提取，从而减少了降解。此外，节片收到时的初始条件也有所不同：一些节片状况良好，而其他节片在收到时显示出退化迹象。结果的不一致可能归因于初始储存和运输条件，包括PBS、水以及在各种天气条件下的干燥运输，这些可能影响了卵和DNA在实验室到达时的质量。为了更准确地评估老化及其对灵敏度的影响，应在模拟环境条件的情况下进行更多研究，以允许降解的发生。

世界卫生组织建议用于灌溉的废水中蠕虫卵的数量应≤1个/升，并且饮用水中绝对不应含有蠕虫卵（Saelens等人，2022年；世界卫生组织，2006年）。为环境研究设计的检测方法必须能够检测到每升废水中低至一个卵。在环境矩阵中，卵和潜在的PCR抑制剂混合物可能会干扰检测性能（Douchet等人，2022年）。本研究首先关注实验室研究。我们从节片中获得了卵，这些卵不含各种潜在的环境PCR抑制剂。虽然我们的新方法能够检测到单个卵，但我们不能将其归类为环境矩阵中的真正诊断灵敏度。当将这些方法应用于环境样本时，灵敏度可能会发生变化。未来的研究应在不同的环境矩阵（包括土壤和废水样本）中测试这些新方法。此外，还需要验证和标准化不同的样本处理方法（包括卵的分离和浓缩以及DNA提取），以提高结果的可靠性（De Bock等人，2022年）。

**5. 结论**
根据结果，新开发的T. saginata特异性PCR和Taenia spp. PCR与其他方法相比，表现出更高的灵敏度和一致性。需要更全面地评估这些方法在不同环境矩阵（包括土壤、水、蔬菜和昆虫）中的性能。这是改进检测方法以支持T. saginata和T. solium控制工作的重要一步。

**数据和材料的可用性**
所有相关数据已包含在正文中。未发表的数据可根据合理请求从相应作者处获得。

**作者贡献声明**
Syed Musa Raza Naqvi：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查、概念化。
Peter Geldhof：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。
Inge Van Damme：撰写——审阅与编辑、软件、形式分析。
Sarah Gabri?l：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、方法学。

**资助**
相应作者获得了巴基斯坦高等教育委员会（HEC）的资助来进行这项研究。