在间充质基质细胞的体外软骨形成过程中，SMAD2/3的二元调控机制以及肝素的抗高血压活性

《Cellular & Molecular Biology Letters》：Dichotomous SMAD2/3 regulation and selective antihypertrophic activity of heparin during in vitro chondrogenesis of mesenchymal stromal cells

　　

摘要

背景

软骨内成骨方向的分化而非软骨方向的分化阻碍了间充质基质细胞（MSC）在临床软骨再生中的应用。我们之前已经证明，负载有转化生长因子TGF-β的肝素-聚乙二醇（PEG）水凝胶能够在体内引导MSC稳定地向软骨方向分化。在这里，我们在体外评估了这种方法，使用了肝素-PEG水凝胶或添加了可溶性肝素的软骨形成培养基的颗粒培养系统。

方法

人类MSC在肝素-PEG水凝胶（22.4 mg/mL交联肝素，120 ng TGF-β1）中培养，或者作为颗粒培养，在含有TGF-β1（10 ng/mL）的软骨形成培养基中添加可溶性肝素（0、10、100、700 μg/mL）。通过Western blot、组织学、定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和酶活性分析软骨和软骨内成骨信号通路（1-3小时，4周）以及软骨基质的形成（4周）。

结果

与体内情况不同，人类MSC在肝素-PEG水凝胶中分化为产生X型胶原和碱性磷酸酶的肥大软骨细胞。有趣的是，用可溶性肝素（10-700 μg/mL）处理MSC颗粒后，TGF-β-SMAD3的激活降低，但SMAD2的激活未受影响，II型胶原和蛋白聚糖/DNA的水平也未发生变化。我们推测，肝素对胰岛素-AKT通路的刺激有助于维持SMAD2的激活，而SMAD2在MSC软骨形成过程中似乎比SMAD3起更重要的作用。肝素处理在体外抑制了促肥大的WNT/β-连环蛋白通路，但未能充分抑制TGF-β-SMAD1/5/9的激活，并且不幸地降低了抗肥大的前列腺素PGE2的水平。最终，10 μg/mL的肝素处理将几种肥大相关标志物（MEF2C、IHH、IBSP信使RNA [mRNAs] 和碱性磷酸酶活性）的上调降至对照组水平以下，但X型胶原仍然没有反应。因此，可溶性肝素处理与之前的抗肥大干预措施（PTHrP脉冲、WNT抑制）具有相似的选择性和有效性，同时具有技术上的简便性、成本降低以及无溶剂配方等优点。

结论

总体而言，肝素-TGF-β在维持软骨形成分化的同时表现出新型的SMAD2/3双重抑制作用，并具有依赖于环境的谱系导向特性——在体外允许软骨内成骨方向的分化，而在体内则促进软骨方向的分化。因此，环境因素对于肝素-PEG引导的MSC在体内向软骨或软骨内成骨方向分化至关重要，这可能涉及SMAD1/5/9抑制剂和PGE2来源的作用。

图形摘要