《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Elucidating the mechanism of plasticizers associated with atherosclerosis through network toxicology, bulk RNA sequencing, and single-cell RNA sequencing analysis
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心血管疾病的主要诱因——动脉粥样硬化（AS）的现有疗法存在局限，而增塑剂广泛暴露与AS风险关联的分子机制未明。为此，研究人员整合网络毒理学、批量与单细胞RNA测序技术，筛选出与常见增塑剂（ATBC, DEP, DMP, DOP）暴露关联的AS关键生物标志物AR与CCR2，并揭示其在免疫浸润、细胞通讯及分化轨迹中的潜在作用，为探索AS的环境致病机制与靶向干预提供了新见解。
动脉，这条在人体内绵延十万公里的生命“高速公路”，负责将氧气和养分输送到全身各处。当这条通路的内壁逐渐增厚、变硬，形成斑块，血流就可能受阻甚至中断，这就是动脉粥样硬化。它是心肌梗死、脑卒中等致命性心血管疾病的主要病理基础。目前，以他汀类药物为代表的干预手段存在疗效和安全性问题，而手术疗法则成本高昂且有创伤风险。因此，寻找能够有效指示AS发生发展的新生物标志物，对于开发更精准的治疗策略至关重要。
与此同时，一种“隐形”的环境暴露因素正日益受到关注——塑料增塑剂。从食品包装、医疗器械到化妆品，以乙酰柠檬酸三丁酯（ATBC）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）等为代表的增塑剂无处不在，使得长期低剂量暴露几乎无法避免。现有研究表明，增塑剂可能通过诱发氧化应激、激活炎症因子、损伤血管内皮功能等多种机制推动AS进程，形成“氧化应激-炎症激活-内皮损伤-单核细胞募集”的级联反应。然而，将增塑剂暴露与AS联系起来的特定分子机制，尤其是在转录组和单细胞水平上的系统性影响，仍有待深入阐明。
面对这一挑战，由新疆第二医学院冯建廷、解玉、王素文、冯亮组成的研究团队，在《Ecotoxicology and Environmental Safety》期刊上发表了一项研究。他们提出了一个科学假说：增塑剂可能通过调控特定基因的表达并重塑免疫微环境，从而促进AS关键细胞的功能异常，驱动斑块进展。为了验证这一假说，研究团队没有局限于传统的单一毒性终点研究，而是采取了一种整合系统生物学策略，结合了网络毒理学、转录组学和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，旨在从多维度阐明增塑剂相关生物标志物在AS中的潜在作用机制。
研究人员运用了几个关键技术方法来开展这项综合性研究。首先，他们利用网络毒理学框架，从公共数据库（ChEMBL, STITCH, SwissTargetPrediction）预测了四种常见增塑剂（ATBC, DEP, DMP, DOP）的毒性及潜在人类靶点基因（PRGs），同时从疾病数据库（GeneCards, CTD, TTD）获取了AS相关基因（ASRGs）。其次，他们从GEO数据库获取了AS相关的批量转录组数据集（GSE43292, GSE57691）和单细胞RNA测序数据集（GSE159677），这些数据均包含来自动脉粥样硬化斑块和匹配对照组织的样本。接着，通过生物信息学分析流程，包括差异表达分析、多种机器学习算法（随机森林、支持向量机递归特征消除、LASSO回归）筛选生物标志物，以及功能富集、免疫浸润（CIBERSORT, xCell算法）、分子对接与分子动力学模拟等，对候选基因进行多层次验证。最后，他们利用单细胞数据分析（Seurat, CellChat, Monocle等工具）在单细胞分辨率下解析了AS微环境中关键细胞亚群的异质性、细胞间通讯和分化轨迹，从而将分子发现定位到具体的细胞类型和功能状态上。
3.1. 795个PRGs和2964个ASRGs的鉴定
研究人员首先评估了四种增塑剂的毒性，其中DOP的预测半数致死剂量（LD50）较低，毒性等级较高。通过数据库检索与整合，最终确定了795个增塑剂相关基因（PRGs）和2964个AS相关基因（ASRGs），两者的交集产生了264个重叠靶基因，并据此构建了“化合物-靶基因-疾病”网络。
3.2. 候选基因的发现与功能探索
在GSE43292数据集中，共鉴定出1190个差异表达基因（DEGs）。将DEGs与PRGs、ASRGs取交集，获得了48个候选基因。功能富集分析显示，这些基因显著富集于炎症反应、细胞因子活性等生物学过程，以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等KEGG通路。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示，CXCL8等基因处于网络的中心位置。
3.3. 鉴定AR和CCR2为生物标志物
结合三种机器学习算法，从48个候选基因中筛选出8个特征基因。其中，雄激素受体（AR）和C-C趋化因子受体2型（CCR2）在两个独立数据集中均表现出优异的诊断性能（AUC > 0.7）。表达验证进一步确认，在AS样本中，AR表达显著下调，而CCR2表达显著上调，因此将二者确定为稳健的生物标志物。
3.4. 生物标志物的功能与定位综合分析
基因互作网络分析发现了与AR和CCR2功能相关的20个基因。基因集富集分析（GSEA）显示，AR和CCR2共同富集于“造血细胞谱系”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”等通路。染色体定位显示AR位于X染色体，CCR2位于3号染色体。亚细胞定位分析表明AR主要位于内质网，而CCR2主要位于细胞外囊泡和细胞质。
3.5. 探索AS与正常样本间的免疫浸润差异
免疫浸润分析揭示了AS样本与正常样本之间22种免疫细胞浸润模式的差异。其中，CD8+T细胞、单核细胞、活化的自然杀伤（NK）细胞和调节性T细胞（Tregs）在AS样本中浸润显著降低，而M0型巨噬细胞浸润显著升高。相关性分析显示，CD8+T细胞与AR呈最强正相关，而调节性T细胞与CCR2呈最强负相关。使用xCell算法的分析结果对上述发现进行了交叉验证。
3.6. 研究生物标志物的调控机制与靶向药物
研究人员预测了靶向AR和CCR2的microRNAs（miRNAs）和转录因子（TFs），并构建了调控网络。药物预测发现了364种靶向AR的药物和4种靶向CCR2的药物，其中辛伐他汀（simvastatin）被鉴定为同时靶向两者的化合物。分子对接显示，增塑剂ATBC与AR和CCR2均能稳定结合，结合能分别为-5.8 kcal/mol和-7.1 kcal/mol，其中与CCR2的结合更为稳定。
3.7. 探索ATBC与生物标志物之间的动态相互作用
分子动力学（MD）模拟结果显示，CCR2-ATBC复合物的均方根偏差（RMSD）波动幅度小于AR-ATBC复合物，且结合位点残基的均方根涨落（RMSF）较低，表明复合物构象稳定。此外，CCR2-ATBC系统的能量更低，且在模拟过程中保持了更多的氢键数量，进一步证实了其结合的稳定性。
3.8. AS关键细胞类型的鉴定与功能探索
对单细胞数据集GSE159677的分析鉴定出了包括巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）、T淋巴细胞等在内的多种细胞类型。通过比较AS与正常样本，确定了VSMCs、自然杀伤T细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和肥大细胞为差异丰度细胞。其中，在AS样本中，AR在VSMCs中的表达显著降低，而CCR2在T淋巴细胞中的表达显著升高，因此将VSMCs和T淋巴细胞确定为AS的关键细胞类型。KEGG通路分析揭示了这两类细胞在AS状态下的特异性功能变化。
3.9. 关键细胞类型的相互作用、分化轨迹与功能差异探索
细胞通讯分析表明，在AS样本中，关键细胞类型（VSMCs和T淋巴细胞）与其他细胞类型的相互作用更为频繁，其中巨噬细胞与肥大细胞通过SPP1-CD44信号通路的通讯概率最高。拟时序分析将VSMCs和T淋巴细胞分别划分为不同的分化阶段和亚群，并动态展示了AR和CCR2在各自分化轨迹中的表达变化：在VSMC分化早期AR表达高，而CCR2在早期和晚期表达高；在T淋巴细胞分化晚期AR表达高，而CCR2在早期表达高。基因集变异分析（GSVA）进一步揭示了VSMCs和T淋巴细胞在AS样本中特异性上调和下调的代谢与信号通路。
该研究的核心结论是，通过整合多组学分析，成功将常见增塑剂暴露与动脉粥样硬化（AS）的发病机制联系起来，并鉴定出AR和CCR2作为关键桥梁分子。AR在AS中表达下调，可能减弱其对血管的保护作用（如抑制炎症、维持VSMCs收缩表型）；而CCR2表达上调，则可能直接放大炎症信号，促进免疫细胞向血管壁的募集。两者在“细胞因子-细胞因子受体相互作用”等通路中共同富集，提示其功能协同。分子对接与动力学模拟为ATBC直接作用于这两个靶点提供了结构依据。单细胞分析将分子发现落实到细胞层面，揭示增塑剂可能通过抑制VSMCs中的AR促使其向促炎表型转化，同时通过上调T淋巴细胞中的CCR2增强其炎症趋化与应答，共同塑造AS的病理微环境。
这项研究的重要意义在于，它首次系统性地运用网络毒理学结合多组学技术，将环境化学物（塑料增塑剂）暴露与心血管疾病的分子和细胞机制直接关联，提出了“增塑剂-AR/CCR2-血管炎症/稳态失衡-AS”的可验证假说框架。这不仅为理解AS的环境病因学提供了新视角，揭示了AR和CCR2作为环境相关AS潜在生物标志物和治疗靶点的新角色，也为未来开展靶向干预（如利用已预测的药物如辛伐他汀）或通过减少特定增塑剂暴露以预防心血管疾病提供了重要的理论线索和研究方向。尽管结论仍需后续实验验证，但该研究成功搭建了连接环境暴露、分子靶点、细胞功能与复杂疾病之间的桥梁，是环境健康与心血管病理学交叉领域的一项有力探索。
