一种新型纳米杀菌剂用于控制灰葡萄孢病：在植物体内的效果以及银纳米颗粒在巯基化树枝状介孔二氧化硅框架上的作用机制研究

《Phytopathology Research》：A novel nano-fungicide for Botrytis cinerea control: in planta efficacy and mechanistic insights of silver nanoparticles on a thiolated dendritic mesoporous silica framework

　　摘要：病原性真菌，如灰葡萄孢（Botrytis cinerea，简称B. cinerea），对可持续农业构成了重大挑战。在这项研究中，我们报道了一种新型巯基功能化树状介孔二氧化硅基纳米杀菌剂（Ag@DMSNs-SH）的设计与合成方法。该杀菌剂的特点是在巯基化的二氧化硅框架内均匀生成并固定了超小的银纳米颗粒（AgNPs）。这种创新的合成策略确保了AgNPs的均匀分散、提高了稳定性，并实现了持续的银释放效果。与游离的AgNPs相比，Ag@DMSNs-SH对B. cinerea表现出更强的、剂量依赖性的抗真菌活性。在1.5 mg/mL的浓度下，六天内其对菌丝生长的抑制率达到了78.63%，显著优于游离的AgNPs（抑制率为15.57%，P < 0.05）。机制研究表明，Ag@DMSNs-SH破坏了真菌细胞膜，导致细胞质泄漏。在离体草莓叶片实验中，Ag@DMSNs-SH在最低抑制浓度（MIC）下表现出92.27%的疗效，而游离的AgNPs仅为36.64%。其在盆栽植物和田间试验中的高抗真菌性能也得到了进一步验证，分别将疾病发生率降低了92.78%至26.11%和83.30%至19.79%。这些结果证明了Ag@DMSNs-SH作为新一代缓释纳米杀菌剂，在管理高价值作物的真菌病害方面具有巨大潜力。

背景：病原性真菌对农业、食品安全和医疗保健构成了重大威胁，导致广泛的农业损失、经济损失和食品污染（Flood 2010；Li等人2022；Shabeer等人2022）。开发有效的抗真菌剂对于减轻这些影响至关重要，尤其是在传统杀菌剂的环境影响日益受到关注以及耐药性真菌菌株不断增加的背景下。有多种策略可以抵御真菌感染，包括使用化学杀菌剂（Toda等人2021）、生物控制剂（Thambugala等人2020）以及热处理和辐射等物理方法（Liu等人2018）。银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性、优异的稳定性和对哺乳动物细胞的低毒性而受到广泛关注（Chernousova和Epple 2013；Magdy等人2024）。然而，它们的实际应用受到多种限制的阻碍。例如，AgNPs的高表面积与体积比和表面能常常导致其聚集，从而降低其抗菌效果（Fahim等人2024）。为了克服这些限制，研究人员探索了将AgNPs掺入各种支撑材料中的复合材料，如沸石（Nuti等人2024）、二氧化钛（Azeez等人2025）、活性炭（Wang等人2015）和二氧化硅（Shen等人2019）。介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）由于其较大的表面积和多孔结构，已成为AgNPs的有希望的载体（Wu等人2023）。这种结构不仅防止了AgNPs的聚集，还实现了银离子的控释，从而延长了其抗菌作用。例如，Liu等人（2019）成功合成了分散在MCM-41型MSNs中的小AgNPs，在低浓度下对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均表现出持久的抗菌活性。类似地，Zhang等人（Wijesiri等人2018）通过合成负载疏水性光敏分子的银核MSNs，展示了其在光动力灭活红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）方面的有效性。此外，其他研究也强调了Ag-MSNs复合材料的抗真菌潜力，mSiO2@AgNPs对白色念珠菌（Candida albicans）显示出有效的抗真菌活性（Qasim等人2015）。Silvia等人（Nuti等人2024）进一步证明了用聚氨酯作为聚合物基质制备的掺银介孔二氧化硅薄膜的抗菌效果。更先进的载体——树状介孔二氧化硅纳米颗粒（DMSNs）相比传统MSNs具有更优的性能，包括层次化的孔结构和三维的径向通道（Landskron和Ozin 2004）。这些特性为高密度、均匀装载AgNPs提供了理想的支架。研究表明，用氨基丙基修饰的DMSNs即使在相对较低的浓度下也能有效抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的增殖（Wang等人2019）。Chen等人进一步开发了一种新型纳米医学策略，利用DMSNs与超小AgNPs结合，通过靶向核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）并克服化疗耐药性来增强对病原体相关癌症的化疗效果（Chen等人2023）。

灰葡萄孢（B. cinerea）是一种引起灰霉病的坏死性真菌病原体，威胁着包括水果、蔬菜和观赏植物在内的经济作物的生产力（Dean等人2012；Weiberg等人2013）。利用DMSNs的独特优势，本研究提出了一种创新方法，通过将AgNPs封装在巯基化的DMSNs中来控制B. cinerea。巯基团提供的表面功能化实现了AgNPs的均匀装载，提高了稳定性并延长了抗菌活性。本文研究了这些巯基化DMSNs支持的AgNPs对B. cinerea的抗真菌效果，探讨了其作用机制，并在实验室和田间环境中评估了其性能。通过结合机制洞察和实践效果数据，本研究旨在阐明Ag@DMSNs-SH作为一种可持续、长效且抗性强的纳米杀菌剂在有效管理灰霉病和改善作物保护方面的潜力。

Ag@DMSNs-SH合成的优化：为了阐明巯基功能化在Ag@DMSNs-SH合成中的关键作用，在制备过程中使用了不同量的MPTES。如表1所示，将MPTES与DMSNs的质量比从0.03增加到0.5后，DMSNs-SH中的巯基含量显著增加，从2.79 ± 0.74 μmol/g增加到22.01 ± 0.25 μmol/g。这种巯基含量的逐步提高直接关联到银装载效率的提升，从21.67 ± 0.67%增加到36.67 ± 1.17%（Ag@DMSNs-SH产品）。表1显示了MPTES与DMSNs质量比对银装载效率的影响。

Ag@DMSNs-SH的表征：使用SEM、TEM、DLS和HAADF-STEM-EDS研究了优化后的Ag@DMSNs-SH的形态和结构特征。SEM成像显示，原始的DMSNs具有均匀分散的球形形态，平均直径为217 ± 21 nm（图1a）。TEM进一步揭示了典型的开放、径向排列的介孔和载体的明确树状结构（图1b）。

经过巯基功能化和银纳米颗粒的原位掺入后，Ag@DMSNs-SH纳米复合材料保持了其球形形态，平均直径为210 ± 30 nm（图1c）。TEM图像显示了超小AgNPs在介孔网络中的成功封装和均匀分布（图1d）。高分辨率TEM分析显示了明显的晶格条纹，晶面间距为0.235 nm，对应于金属银的（111）晶面，并确定了AgNPs的平均大小为3.75 ± 0.55 nm（图1e）。动态光散射分析进一步表征了样品的胶体行为（附加文件1：图S1）。DMSNs和Ag@DMSNs-SH的流体动力学直径分别为264.8 ± 22 nm和314.6 ± 12 nm，PDI值分别为0.144和0.163，表明具有良好的胶体稳定性。相比之下，游离的AgNPs表现出显著的聚集，流体动力学尺寸显著增加（约442.7 ± 40 nm），PDI值为0.522。非巯基功能化的对照组（Ag@DMSNs）也观察到了类似的聚集趋势，在TEM图像中显示出AgNPs的明显聚集（图1f），这突显了巯基团在纳米颗粒装载过程中的稳定作用。

通过HAADF-STEM-EDS研究了Ag@DMSNs-SH中的元素组成和空间分布。如图1g所示，C、O、Si、S和Ag在纳米复合材料中均匀分布，表明银在巯基化的DMSNs框架内分散良好。EDS光谱确认了S和Ag的存在，原子比约为4.39:5.29，证实了成功的巯基接枝和高效的银原位装载。FTIR光谱用于表征DMSNs和DMSNs-SH中的特征基团。FTIR光谱（图2a）显示，DMSNs-SH中的-CH伸缩振动峰在2936 cm?1和2975 cm?1处的强度增强，表明巯基团的成功引入。此外，约690 cm?1处的弱信号归因于C-S键的不对称伸缩，进一步证实了巯基修饰。

XRD分析（图2b）显示，制备好的DMSNs在22°处有一个宽峰，表明其为非晶态二氧化硅（Chen等人2024a, b）。对于Ag@DMSNs-SH，XRD图案在2θ = 38.1、44.1、64.4和77.2°处显示出四个明确的衍射峰，分别对应于金属银的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（PDF#87-0597）。DMSNs、DMSNs-SH和Ag@DMSNs-SH的N2吸附-脱附等温线均显示出IV型等温线，这是介孔材料的特征，并在0.4–1.0的相对压力范围内呈现H3型滞后环（Wang等人2016）。巯基功能化和AgNPs装载后，孔结构和比表面积均有所下降（表2）。DMSNs的比表面积为333.463 m2/g，孔体积为1.525 cm3/g。巯基功能化后，DMSNs-SH的比表面积和孔体积均减小，分别为298.491 m2/g和1.362 cm3/g。此外，AgNPs在DMSNs-SH孔内的原位生长导致比表面积和孔体积进一步减小，分别为252.539 m2/g和1.250 cm3/g。关于孔径，DMSNs、DMSNs-SH和Ag@DMSNs-SH的孔径分别为18.29、18.25和19.80 nm。

Ag@DMSNs-SH的抗真菌活性：通过菌丝生长抑制试验评估了Ag@DMSNs-SH对B. cinerea的抗真菌效果。Ag@DMSNs-SH在六天内表现出剂量依赖性的持续抑制作用，显著优于游离的AgNPs（图3a, b）。图3显示了Ag@DMSNs-SH在不同浓度下对B. cinerea的抗真菌效果，分别对应0.75 mg/mL和1.5 mg/mL的Ag@DMSNs-SH。低浓度（l）和高浓度（h）的AgNPs分别代表0.275 mg/mL和0.55 mg/mL。Pyrimethanil（0.05 mg/mL）作为阳性对照。图3b显示了从第1天到第6天的菌丝生长抑制的定量分析。

对于Ag@DMSNs-SH，无论是低浓度（0.75 mg/mL，1/8 MIC，附加文件1：图S2）还是高浓度（1.5 mg/mL），都表现出逐渐增加的抗真菌活性。在1.5 mg/mL浓度下，抑制率从第1天的38.34%显著增加到第6天的78.63%，而在0.75 mg/mL浓度下，抑制率从第1天的5.03%增加到第6天的56.93%。这种持续且渐进的增强效果在游离的AgNPs或阳性对照Pyrimethanil中并未观察到。例如，Pyrimethanil（0.05 mg/mL）在初始时从67.35%（第1天）增加到第2天的77.42%，随后在第6天显著下降到34.51%。此外，Ag@DMSNs-SH在相同浓度下始终优于游离的AgNPs，且性能差距随时间扩大。在1.5 mg/mL浓度下，Ag@DMSNs-SH相对于游离AgNPs的抑制率比从第1天的3.17增加到第6天的5.05，表明其抗真菌活性逐渐增强。这种效果在较低浓度（0.75 mg/mL）下同样明显，从第3天开始就显示出比游离AgNPs显著更高的活性。到第6天时，1.5 mg/mL和0.75 mg/mL浓度的Ag@DMSNs-SH的抑制率分别达到了78.63%和56.93%，而高浓度（0.55 mg/mL）的游离AgNPs仅表现出短暂的效果，在第2天达到峰值17.77%，到第6天下降到15.57%。

为了阐明Ag@DMSNs-SH的抗真菌机制，研究了不同处理后B. cinerea菌丝和孢子的形态和超微结构完整性（图4a）。光学显微镜观察显示，对照组（CK）的菌丝结构保持光滑、规则的外观。相比之下，暴露于不同浓度Ag@DMSNs-SH的菌丝表现出显著的形态变化，包括隔膜缩短和大量侧枝的形成。这些变化伴随着菌丝细胞的明显变形和肿胀。扫描电子显微镜（SEM）被用来进一步在超微结构层面研究这些效应（图4b）。在对照组中，菌丝表面看起来光滑且完整，表明真菌细胞健康。相比之下，暴露于Ag@DMSNs-SH的菌丝显示出明显的形态改变，包括严重的变形、收缩和结构崩溃，表明其整体完整性和稳定性受到了损害。值得注意的是，这些破坏性效应在低浓度（1/8 MIC）下就出现了，对应的银载量为0.275 mg/mL。相比之下，单独使用AgNPs需要四倍的浓度（1.1 mg/mL）才能引起类似的损害。高倍率SEM提供了细胞死亡机制的直接证据（图4c）。在较高浓度的Ag@DMSNs-SH（1/2 MIC）下，菌丝表面出现了许多小孔，而对照组则保持相对光滑的表面。

通过PI染色评估了真菌细胞膜的完整性（图5a）。对照组的菌丝几乎不显示荧光，表明膜是完整的。Ag@DMSNs-SH处理后，红色荧光显著增加，且这种增加与等浓度下游离AgNPs观察到的荧光强度明显不同。通过测量260 nm处的吸光度（OD260）来量化细胞内核酸。Ag@DMSNs-SH处理组在72小时内OD260值持续显著增加，这一趋势比游离AgNPs观察到的增加更为明显（图5b）。电子顺磁共振（EPR）光谱用于检测羟基自由基的生成（图5c）。用Ag@DMSNs-SH处理的B. cinerea的EPR光谱显示了特征性的1:2:2:1四重峰信号，证实了DMPO-羟基自由基加合物的存在。该信号的强度依赖于浓度，并且明显高于单独使用游离AgNPs或DMSNs-SH处理的组。

在植物保护模型中验证了Ag@DMSNs-SH的抗真菌效果。一系列分层测试评估了其实际抗真菌效果。离体叶片实验首次直接证明了这种纳米复合材料的治愈潜力。未经处理的叶片（CK组）迅速出现了典型的灰霉病症状，而Ag@DMSNs-SH在96小时后提供了强大的、浓度依赖性的保护（图6a）。在最低抑制浓度（MIC）下，Ag@DMSNs-SH在96小时后的控制效果达到了92.27%，显著优于游离AgNPs（36.64%）（图6b）。即使在较低浓度（1/2 MIC和1/4 MIC）下，Ag@DMSNs-SH也保持了显著的抗真菌活性，控制效果分别为72.43%和59.40%，优于相应浓度的游离AgNPs。

为了评估在更复杂的生物和环境系统中的性能，实验扩展到了盆栽植物和田间试验。在盆栽植物实验中（图7），虽然CK组的发病率很高（92.78%），但用2 MIC浓度的Ag@DMSNs-SH处理后，发病率显著降低到26.11%（P < 0.05），并且病斑面积减少到0.049平方厘米——明显小于CK组（0.74平方厘米）或其他处理组（AgNPs：0.31平方厘米；DMSNs-SH：0.29平方厘米）。为了确保视觉证据完全代表定量结果，支持信息中提供了所有九株不同处理组草莓植物的图像（附加文件1：图S3–S5）。详细的接种设计在附加文件2：表S1中总结，相应的发病率和病斑面积在附加文件2：表S2中呈现。

纳米复合材料的稳健性在田间试验中得到了进一步证实（图8），Ag@DMSNs-SH将发病率和病斑面积减少了大约75%。

Ag@DMSNs-SH增强抗真菌效果的结构和物理化学基础主要归因于硫醇功能化和独特的树枝状介孔二氧化硅框架的协同效应。MPTES前体引入的硫醇基团在决定银的负载能力和纳米复合材料的稳定性方面起着关键作用。如表1所示，增加含硫醇前体（MPTES）与DMSNs的质量比导致硫醇含量增加，从而提高了银的负载效率。这证实了更多的结合位点直接促进了更高且更有效的银离子负载量，这是确保持续和强大抗真菌活性的关键因素。在优化了硫醇含量和银负载后，Ag@DMSNs-SH的结构和形态特性进一步揭示了其优越的抗真菌性能。DMSNs框架的开放、多孔和树枝状结构，通过SEM和TEM成像得到证实（图1a，b），是理想的纳米载体。FTIR光谱（图2a）证明了成功的硫醇基团功能化，这种修饰对复合材料的稳定性至关重要（Sankaraiah等人，2008年）。硫醇基团作为坚固的锚定点，抑制了银纳米颗粒（AgNPs）的聚集，而在没有硫醇化的情况下观察到了这个问题（图1f）。因此，高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）显示，在介孔内形成了均匀分散的超小AgNPs（3.75 ± 0.55纳米），最大化了反应表面积并促进了抗菌效果。动态光散射（DLS）结果（附加文件1：图S1）进一步证实了形态观察结果，Ag@DMSNs-SH表现出314.6 ± 12纳米的流体动力学直径和0.163的低粒子分布指数（PDI），表明良好的胶体稳定性。相比之下，游离AgNPs表现出明显的聚集，其流体动力学尺寸显著更大（约442.7纳米）和高的PDI（0.522）。DLS得到的粒径略大于SEM观察到的尺寸，这是由于两种分析方法的原理不同（Chen等人，2024a，b；Guerrero-Florez等人，2024年）。总的来说，这些发现强调了硫醇功能化在稳定二氧化硅框架内的AgNPs以及在水中分散中的关键作用，从而增强了纳米复合材料的结构完整性和生物功能性。

使用高角分辨透射电子显微镜-扫描电子显微镜-能量色散光谱（HAADF-STEM-EDS）进行的元素分布分析为复合材料的成功形成提供了额外证据。映射图像（图1g）显示S和Ag在整个纳米结构中均匀分布，与均匀的硫醇接枝和有效的银掺入一致。相应的EDS光谱进一步证实了硫与银的原子比约为4.4:5.3，支持了硫醇基团在合成过程中有效协调Ag?的结论。进一步的结构分析证实了纳米复合材料的完整性和组成。X射线衍射（XRD）图案（图2b）证明了无定形二氧化硅基质内成功形成了结晶银纳米颗粒，这与HRTEM的结果一致。DMSNs框架的衍射峰没有显著变化，表明其结构稳定性得到了保持，即使在硫醇功能化后也是如此。通过功能化和负载后孔体积和表面积的逐渐减小，证实了AgNPs成功占据了孔隙（图2c–e，表2）。最终Ag@DMSNs-SH材料中孔径的轻微增加可能是由于在原位还原银离子过程中施加的局部压力导致的，这可能导致孔壁的轻微膨胀。

菌丝生长抑制结果（图3）直接证明了Ag@DMSNs-SH的优越抗真菌性能。观察到的持续、强烈的、剂量依赖性的抑制是材料结构特性的直接结果。DMSNs基质不仅提供了与真菌细胞紧密接触的大表面积，还实现了银离子的控制和持续释放。与由于快速离子耗尽和聚集而表现出短暂效果的游离AgNPs不同，硫醇稳定的超小AgNPs在介孔二氧化硅结构中保持了有效的银离子浓度。这种机制防止了效果的快速丧失，使Ag@DMSNS-SH成为长期应用中更稳健和高效的抗真菌剂。

本研究的一个值得注意的方面是与商业杀菌剂嘧菌胺（Shao等人，2021年）的比较评估。在0.05 mg/mL的浓度下（大约4 MIC），嘧菌胺在第二天表现出强烈的初始抗真菌效果，抑制率为77.42%；然而，到第六天其效果显著下降到34.51%，表明在低剂量条件下的持久性有限。相比之下，1.5 mg/mL（1/4 MIC）浓度的Ag@DMSNs-SH从第一天的38.34%逐渐增加到第六天的78.63%。这种持续的改善表明Ag@DMSNS-SH能够实现银离子的控制和持续释放，从而保持长期抗真菌活性并克服了嘧菌胺的快速下降。尽管Ag@DMSNS-SH在水中的最低抑制浓度（MIC）为6.0 mg/mL，高于嘧菌胺的0.0125 mg/mL（附加文件1：图S2），但需要注意的是，嘧菌胺通常在作为喷雾制剂使用时在相对干燥的环境中发挥其活性。在这些实际应用条件下，1/4 MIC浓度的Ag@DMSNS-SH比4 MIC浓度的嘧菌胺表现出显著更高的抑制率，这突显了其优越的持续抗真菌性能。此外，越来越多对嘧菌胺具有抗性的B. cinerea菌株的出现大大降低了嘧菌胺的田间效果（Sun等人，2010年；Xu等人，2018年；Zhao等人，2024年）。因此，Ag@DMSNS-SH的缓释和抗性抵抗特性使其成为可持续管理灰霉病的有希望的替代品。

形态学和机制研究的结果为Ag@DMSNS-SH对抗B. cinerea的抗真菌作用提供了有力证据。光学和SEM图像（图4a，b）清楚地显示，这种纳米复合材料对真菌菌丝造成了显著的形态损伤，包括细胞变形、肿胀和收缩。这些结构破坏表明对真菌细胞的整体完整性和存活能力有深远影响。一个关键发现是，与游离AgNPs相比，Ag@DMSNS-SH在引起这些形态变化方面具有更高的效果。即使在低浓度（1/8 MIC）下，Ag@DMSNS-SH造成的损伤也与四倍高浓度的游离AgNPs相当。这表明DMSNs-SH载体显著增强了银纳米颗粒的效力。高倍率扫描电子显微镜（SEM）图像（图4c）显示了真菌细胞表面的孔洞，为质膜破坏作为细胞死亡的主要机制提供了直接的视觉证据。为了进一步验证这一机制，研究人员调查了细胞膜的完整性和活性氧（ROS）的产生情况。PI染色结果（图5a）和细胞内泄漏测量（图5b）证实，Ag@DMSNs-SH对真菌细胞膜造成了严重且持续的损伤，导致细胞成分的释放（Cai等人，2015年；Cui等人，2021年）。这与菌丝表面孔洞形成的形态观察结果一致（图4c）。相对于游离的AgNPs，增强的红色荧光和OD260值进一步表明DMSNs-SH载体促进了更有效的相互作用，并在细胞膜层面导致了显著的破坏。此外，电子顺磁共振（EPR）光谱结果（图5c）表明该纳米复合材料是氧化应激的强诱导剂。Ag@DMSNs-SH处理组中羟基自由基的强信号与游离AgNPs的弱信号形成对比，表明DMSNs-SH载体在放大银的ROS生成能力方面起着关键作用（Zou等人，2022年）。这可能是由于银离子的持续释放以及纳米颗粒与真菌细胞表面的紧密接触，这种接触得益于多孔载体的作用。综合这些发现，可以认为Ag@DMSNs-SH具有双重抗真菌机制：直接对细胞膜造成物理损伤导致泄漏，以及通过产生细胞毒性羟基自由基来诱导氧化应激。

草莓植株中的抗真菌效果
分层植物保护模型的结果为Ag@DMSNs-SH的实际应用提供了关键验证。体外实验已经证明了其强大的抗真菌效果，并阐明了其作用机制，即严重的膜损伤和压倒性的氧化应激。离体叶片实验的数据（图6）将这些实验室发现与实际应用直接联系起来，表明该纳米复合材料的有效性转化为对植物组织的保护。即使在较低浓度下，Ag@DMSNs-SH也优于游离的AgNPs，这突显了其纳米结构的显著优势。这种增强的性能在更复杂的盆栽植物生物系统和田间试验（图7和图8）中得到了一致复制和确认。在这些不同条件下观察到的疾病发生率和病斑面积的显著减少，强调了Ag@DMSNs-SH的稳健性和可靠性。即使在真实的农业环境中，其卓越且持久的性能也可以直接归因于其智能设计。DMSNs-SH载体通过确保与植物表面的粘附，促进了活性剂的持续和局部释放。这种控释机制防止了银离子的快速耗尽，这是游离AgNPs的主要限制。通过在真菌-植物界面维持抗真菌剂的持续存在，纳米复合材料确保了长期的、持久的抑制效果。

结论
总之，我们成功开发了一种新型纳米杀菌剂Ag@DMSNs-SH，该方法通过将超小银纳米颗粒固定在巯基化的树枝状介孔二氧化硅框架上来实现。这种独特的结构对于稳定AgNPs、防止聚集以及实现银离子的持续释放至关重要。与游离AgNPs相比，Ag@DMSNs-SH显示出明显更优越和持久的抗灰霉病活性，机制研究证实了其通过破坏真菌膜和产生ROS来发挥作用。关键的是，其在植物体内的有效性得到了验证，在田间试验中，它将草莓上的灰霉病发生率降低了高达75%。Ag@DMSNs-SH持续且抗性的抗真菌性能凸显了其作为下一代基于纳米技术的可持续作物保护和灰霉病管理策略的潜力。

方法
化学品和仪器
硝酸银（AgNO3，99%）、硼氢化钠（NaBH4，99%）、正硅酸四乙酯（TEOS，98%）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB，99%）购自Chemical Reagent Co., Ltd.。水杨酸钠（NaSal，99.5%）来自Shanghai Rhawn Reagent Co., Ltd.。三乙醇胺（TEA，98%）、自旋捕获剂5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）和乙酸乙酯由Aladdin Chemistry Co., Ltd.（上海）提供。此外，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTMS）和碘化丙啶（PI）分别来自Shanghai Dibo Biotechnology Co., Ltd.和Shanghai Acmec Biochemical Technology Co., Ltd.。嘧菌胺（40%）来自Limin Chemical Co., Ltd.。0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）是通过将标准磷酸盐和氯化物盐（NaCl、KCl、Na?HPO?、KH?PO?）溶解在蒸馏水中，调节pH至7.0，并通过高压灭菌制备的。
样品的形态和超微结构使用Hitachi S-4800扫描电子显微镜（SEM）和JEOL-2100F透射电子显微镜（TEM）在200 kV下进行观察，后者也用于高分辨率（HRTEM）成像。元素分布使用配备EDS检测器的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM，Hitachi S-5500，30 kV）进行分析。动态光散射（DLS）测量在Zetasizer Nano-90（Malvern Instruments Ltd.）上进行，以确定样品的流体力学尺寸和尺寸分布。结晶相通过X射线衍射（XRD）使用Bruker D8 ADVANCE衍射仪和Cu Kα辐射（λ = 1.54056 ?）进行鉴定。NEXUS 670光谱仪用于记录4000–400 cm?1范围内的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。孔结构参数是通过在77 K下使用Quantachrome Autosorb iQ分析仪测量的氮吸附-脱附等温线获得的。比表面积（A）使用多点Brunauer–Emmett–Teller（BET）方法在相对压力（P/P?）范围0.02–0.30内计算得出。总孔体积（V）是根据P/P? = 0.99时的吸附氮体积估算的，平均孔径（D）通过D = 4 V/A计算得出。Ag@DMSNs-SH材料中的银含量使用北京Puxi TAS-990原子吸收光谱仪（AAS）进行定量。
对于生物学评估，使用Nikon Eclipse Ei光学显微镜观察真菌菌丝。通过用碘化丙啶（PI）染色并用Olympus IX81荧光显微镜观察来评估细胞膜的完整性。通过使用Thermo Scientific NanoDrop 2000c分光光度计在260 nm（OD???）处测量吸光度来量化细胞内成分的泄漏。使用Bruker ESR 300E电子顺磁共振（EPR）光谱仪检测细胞内自由基的产生。测量在以下条件下进行：9.858 GHz微波频率、2.37 mW功率、3511.94 G中心场和100.00 G扫描宽度，使用DMPO作为自旋捕获剂。

Ag@DMSNs的合成
DMSNs最初按照我们之前建立的程序（Yu等人，2025年）制备。为了在DMSNs表面引入巯基，将300 mg的DMSNs分散在15 mL乙醇中。随后，向悬浮液中加入375 μL氨水（NH?·H?O）和150 μL MPTMS。混合物在持续搅拌下反应12小时。通过离心并用乙醇洗涤三次获得所得的巯基化DMSNs（DMSNs-SH）。为了制备载银的DMSNs-SH（Ag@DMSNs-SH），将10 mg的DMSNs-SH产品悬浮在5 mL去离子水中。接着加入2.5 mg的AgNO?，并搅拌1小时。随后迅速加入5 mg的NaBH?以还原吸附的Ag?，反应再继续进行一小时。最终通过离心并用清水洗涤获得Ag@DMSNs-SH。

银的负载能力
为了确定Ag@DMSNs-SH复合材料中的银负载量，使用了原子吸收光谱法（AAS）。取10 mg的Ag@DMSNs-SH样品，在2 mL 1:1（V/V）的硝酸水溶液中消化。然后将消化液稀释至总体积25 mL。离心去除不溶性残留物。取1 mL的上清液进一步稀释至50 mL用于分析。制备了一系列浓度从0.50到5.0 mg/L的标准银离子（Ag?）溶液以构建校准曲线。通过将其吸光度与校准曲线比较来确定Ag@DMSNs-SH中的银含量。

体外抗真菌活性
使用琼脂圆盘扩散法（Wang等人，2021年）评估了Ag@DMSNs-SH对真菌病原体B. cinerea的抗真菌效果。制备了马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板，并添加了两种不同浓度的AgNPs或Ag@DMSNs-SH复合材料。每个平板中央接种了7-mm的B. cinerea菌丝圆盘。对照平板包括不含抗真菌剂的空白对照（CK）和仅含DMSNs-SH的空白载体对照。商业嘧菌胺作为阳性对照（Shao等人，2021年）。所有处理和对照均重复三次。然后在28°C下培养平板。通过每天记录菌落直径来监测真菌生长的进展（Xu等人，2020年）。使用以下公式计算每个处理组的抗真菌活性：\({\text{抑制率 }}\left( \% \right)\, = \,\left( {{\text{对照菌落直径}}{-\!\!-}{\text{处理组菌落直径}}} \, / \, \left( {{\text{对照菌落直径 }} - 0.{7}} \right)\, \times \,{1}00\%\)。
使用系列稀释法（Huang等人，2019年）确定Ag@DMSNs-SH和嘧菌胺对B. cinerea的最小抑制浓度（MIC）。将Ag@DMSNs-SH（0.75–24 mg/mL）和嘧菌胺（0.78–50 mg/L）的系列两倍稀释液加入到含有B. cinerea孢子（1?×?105 CFU/mL）的培养基中。MIC表示在28°C培养5天后防止可见真菌生长的最低浓度。

膜完整性评估
为了评估Ag@DMSNs-SH和AgNPs对细胞膜完整性的影响，将B. cinerea分生孢子（1?×?105 CFU/mL）在添加了不同浓度测试物质（1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC）的马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中培养72小时。为了进行比较分析，还准备了含有相同浓度AgNPs和DMSNs-SH的对照组。培养结束后，通过8064 g离心3分钟收获真菌菌丝。所得菌丝团块随后用PBS冲洗三次以去除任何残留的培养基。将菌丝重新悬浮在1 mL PBS中，并用10 μL 1.0 mg/mL的PI溶液在暗处染色30分钟。染色后，样品再用PBS冲洗三次以去除多余的PI。在荧光显微镜下检查制备的样品以评估细胞膜损伤；红色荧光表明PI渗透到了膜受损的细胞中。所有实验均重复三次。

OD260的测定
为了评估细胞泄漏，制备了浓度为5?×?105 CFU/mL的B. cinerea分生孢子悬浮液。将1毫升该悬浮液接种到4 mL含有亚抑制浓度（1/2、1/4和1/8 MIC）Ag@DMSNs-SH的PDB中。包括含有相同浓度AgNPs和DMSNs-SH的平行对照。所有培养物均在28°C下保持静态条件。在指定时间点（0、12、24、36、48、60和72小时），通过离心分离上清液并测量OD260以评估细胞泄漏。

羟基自由基的测定
为了研究真菌细胞内自由基的生成，使用了电子顺磁共振（EPR）光谱。将B. cinerea分生孢子（1?×?105 CFU/mL）在含有不同浓度（1/8 MIC至2 MIC）Ag@DMSNs-SH或AgNPs的PDB中培养5天。之后，从每个培养物中抽取50 μL样品并与5 μL DMPO（自旋捕获剂）混合，如Stefan等人（2020年）所述。混合物超声处理40分钟以促进细胞裂解和自由基捕获。然后将所得溶液转移到100 μL毛细管中，在EPR光谱仪的共振腔内进行分析。

真菌菌丝的形态学检查
为了研究Ag@DMSNs-SH处理引起的形态变化，将B. cinerea菌落在含有不同浓度（1/8 MIC至1/2 MIC）Ag@DMSNs-SH或AgNPs的PDA平板上培养5天。然后将菌丝从平板上收集，放置在显微镜载玻片上，并用光学显微镜观察。对于电子显微镜分析，将小（3 mm?×?3 mm）的菌丝块在4°C下用2.5%戊二醛固定过夜，用PBS洗涤三次，然后在逐步递增的乙醇系列（30%、50%、70%、80%、90%和95%）中脱水，最后冷冻干燥。干燥的样品最终用SEM进行分析。

Ag@DMSNs-SH对接种了B. cinerea的草莓植株的治疗效果
使用人工接种了B. cinerea的离体草莓叶片评估了Ag@DMSNs-SH的治疗活性（Sacks等人，2018年）。从三个月大的“Hongyan”植株上选取均匀健康的叶片，在2% NaClO中表面消毒2分钟，用蒸馏无菌水冲洗三次，然后风干。从5天大的B. cinerea培养物中切下的菌丝塞（直径7毫米）被放置在每片叶子的近轴面上，伤口部位是用无菌针头制造的（每片叶子一个菌丝塞）。叶片通过喷洒AgNPs或Ag@DMSNs-SH悬浮液进行处理，这些悬浮液的浓度分别对应于最小抑制浓度（MIC）、1/2 MIC和1/4 MIC。处理在接种后2小时、4小时或8小时进行，使用手持喷雾器进行，对照组分别使用CK和DMSNs-SH。每个处理组包括15片重复叶片。接种后的叶片在生长室中培养3天（温度28°C，相对湿度80%，光照16小时/黑暗8小时）。为了保持水分，叶柄被包裹在湿润的棉布中。

疾病进展通过测量病变在两个垂直方向上的直径来量化，从而计算病变面积。对照效果（CE）的计算公式为：CE (%) = [(对照叶片的病变面积) - (处理叶片的病变面积)] / (对照叶片的病变面积 - 菌丝塞的面积) × 100。

**盆栽植物试验**
Ag@DMSNs-SH的抗真菌效果在受控温室条件下的盆栽植物试验中进一步评估。实验在恒定温度28°C和80%湿度（光照16小时/黑暗8小时）下进行，以确保B. cinerea的最佳生长条件和感染进展。植物定期浇水，并注意防止根腐病。

实验中选择了9株健康、3个月大的盆栽草莓植物，这些植物大小和形状均匀，分别移植到标准盆中（顶部直径22.5厘米，底部直径17.5厘米，高度18厘米），盆中填充了从田间采集的土壤。为了减少个体植物之间的差异，每株植物作为一个重复样本，并接受四种处理：CK、AgNPs、DMSNs-SH和Ag@DMSNs-SH（2 MIC）。接种程序与离体叶片试验相同，将B. cinerea接种到叶片上。每个处理组再分为三个亚组（附加文件1：图S3–S5），每个亚组用于计算疾病发生率和病变面积。疾病发生率的计算公式为：发生率 (%) = (患病叶片数 / 总叶片数) × 100。

**田间试验**
田间试验在浙江省金华农业科学院进行（经度：119°37'，纬度：29°1'），时间从2025年4月3日至2025年5月2日。十株草莓植物被接种B. cinerea，并按照盆栽植物试验的相同方案用AgNPs、DMSNs-SH和Ag@DMSNs-SH（2 MIC）进行处理。每种处理重复三次。3天后，使用与盆栽试验相同的方法评估发病率和病变面积。

**统计分析**
统计分析使用SPSS软件（版本27.0，美国）进行。所有实验均重复三次，数据以平均值±标准差（SD）表示，显著性阈值设定为P < 0.05。三个或更多组之间的总体比较使用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey的Honest Significant Difference（HSD）事后检验，显著差异用不同的小写字母表示。具体对于抑制率试验（图3b），组内不同时间点的差异使用单因素ANOVA和Tukey的HSD进行分析，而同一时间点Ag@DMSNs-SH与仅使用Ag的处理之间的成对比较使用独立样本t检验，显著性水平分别表示为***P < 0.001、**P < 0.01和*P < 0.05。被认为不显著的差异标记为“ns”。