《Journal of Environmental Sciences》：Exploring the comprehensive toxicity of PPD pollutants: Perspective of combining spectral experiments with molecular modeling and network toxicology
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PPDs通过非共价复合物与HSA/PEP相互作用影响运输稳定性，网络毒理学揭示其通过PI3K-Akt、MAPK和Ras等通路导致肝毒性，N-取代基结构差异决定代谢与内分泌毒性特异性。
作者：董雅茹 | 郭明 | 程杰
中国浙江省农林大学化学与材料工程学院，杭州，311300
摘要
对苯二胺（PPD）化合物在汽车工业中广泛使用，是重要的环境污染物，对人体存在暴露风险。然而，它们的环境行为、特定的毒理学特性以及涉及干扰关键生理蛋白的毒性分子机制仍很大程度上不清楚。本研究结合了多光谱分析、分子模拟和网络毒理学，探讨了三种代表性PPD（N-（1,3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺（6PPD）、N-异丙基-N′-苯基-对苯二胺（IPPD）和N,N′-二苯基-对苯二胺（DPPD）的分子相互作用和潜在毒性机制。具体而言，我们研究了它们与人类血清白蛋白（HSA）和胃蛋白酶（PEP）的结合情况，以评估其传输和胃稳定性，并利用网络毒理学预测潜在的肝脏毒性途径。结果表明，PPD通过单点、两态结合模型与PEP/HSA形成了稳定的非共价复合物。荧光淬灭实验显示HSA-6PPD、HSA-IPPD和PEP-6PPD复合物呈现静态淬灭现象，而HSA-DPPD和PEP-IPPD/DPPD复合物则表现出混合淬灭现象。结合自由能计算表明，范德华相互作用是主要的稳定力，其作用远大于静电作用。网络毒理学预测PPD通过与EGFR、SRC等枢纽蛋白的结合，通过PI3K-Akt、MAPK和Ras通路干扰肝脏功能。N取代基带来了不同的风险：6PPD通过PIK3R1靶向代谢信号通路，IPPD通过ESR1带来内分泌风险，DPPD通过MET抑制肝脏再生。这项工作提供了PPD与蛋白质相互作用的结构性见解，并为评估环境污染物的健康影响提供了数据驱动的假设。
引言
近年来，轮胎磨损颗粒（TWPs）已成为城市环境污染物的主要来源，并成为橡胶衍生化学添加剂进入城市和水生生态系统的主要载体。在影响轮胎使用寿命和安全性的添加剂中，N,N'-二取代的对苯二胺（PPDs）化合物具有核心重要性（Wang等人，2022；Wang等人，2025）。全球每年新兴PPD（如N-（1,3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺（6PPD）及其结构类似物N,N′-二苯基-对苯二胺（DPPD）和N-异丙基-N′-苯基-对苯二胺（IPPD）的消耗量已超过60万吨（Cao等人，2022；Wang等人，2024）。因此，这些化合物经常在各种环境介质和生物样本中被检测到，城市道路灰尘中的总PPD及其醌衍生物浓度可达2.4 μg/g，大气PM2.5中的浓度为13.2 ng/m，人体尿液中的浓度超过8.6 ng/mL（Chen等人，2025b；Liang等人，2025；Zhang等人，2024）。
关于PPD的毒性效应和机制的研究引起了全球关注。大量研究表明，6PPD及其氧化衍生物对水生和哺乳动物物种都有不利影响（Peng等人，2022；Rao等人，2024）。其他PPD普遍存在于人类环境中，通过吸入或饮食（例如受污染的水产品和作物）进入人体（Matsumoto等人，2013）。然而，尽管毒性后果已有充分记录，但分子起始事件，特别是与驱动这些下游系统效应的生理大分子的相互作用机制仍不够明确。
为了填补这一知识空白，从分子水平探索PPD在生物体内的关键动力学过程至关重要。现有的PPD毒理学研究主要集中在下游效应上，如基因毒性和代谢转化（Song等人，2024；Yang等人，2025；Ye等人，2024）。然而，进入生物体后的关键上游步骤（特别是胃稳定性和系统传输）的分子机制仍缺乏研究。PPD的疏水性决定了它们在体内水环境中的传输和命运主要受其与内源性大分子的相互作用控制。口服摄入后，消化过程始于胃肠道，PPD可能与胃蛋白酶（PEP）等消化酶相互作用（Ji等人，2025；Li等人，2022b）。这种相互作用可能产生双重影响：改变PPD从食物基质中的生物可利用性，并可能通过改变PEP的构象而损害正常的消化功能（Siri等人，2021；Wu等人，2023；Jiang等人，2023a）。进入系统循环后，疏水性PPD通过与人类血清白蛋白（HSA）结合在体内传输。作为最丰富的血浆蛋白，HSA介导的结合显著影响污染物的循环、滞留、器官特异性传输和生物累积（Chen等人，2025a；Zhang等人，2013；Huang等人，2022）。
尽管PPD与蛋白质的相互作用至关重要，但现有研究大多是一维的，通常仅限于使用光谱等技术表征单一化合物（如6PPD及其转化产物6PPD-醌（6PPD-q）与单一蛋白质的结合（Chen等人，2024；Li等人，2025）。虽然这些研究具有基础性，但它们缺乏将分子结合事件与系统、器官水平病理结果联系起来的预测能力。为了克服这一限制，网络毒理学提供了一种新的、强大的系统级视角。这种方法通过系统分析化学物质与生物网络之间的相互作用，成功用于阐明多氯联苯（PCBs）和双酚A（BPA）等污染物的毒性机制（Li等人，2022a；Feng等人，2025）。
然而，仅凭分子结合行为难以全面了解系统病理学，而计算毒性预测需要生物利用度的信息才能具有意义。因此，本研究采用综合方法来探索这一复杂性。我们利用多光谱分析和分子动力学（MD）模拟全面评估了三种代表性PPD（6PPD、IPPD和DPPD）与关键生物分子PEP和HSA之间的相互作用，以表征它们的胃稳定性和系统传输潜力。结合这些动力学发现，我们利用网络毒理学生成关于潜在器官特异性毒性的假设，特别是肝脏毒性风险。通过解释PPD的生物利用度特征及其预测的毒性机制，本研究提出了一个探索性框架，将分子起始事件与潜在的器官功能障碍联系起来。目的是为评估像PPD这样的普遍环境污染物的健康风险提供新的见解。
材料与试剂
本研究中使用了PEP（≥ 98%，上海源业生物科技有限公司，中国）和HSA（≥ 99%，上海源业生物科技有限公司，中国）。6PPD、IPPD和DPPD（≥ 98%，上海麦克林生化科技有限公司，中国）溶解在甲醇中制备储备溶液（1.0 × 10-3 mol/L）。所有溶液均在4 °C下避光保存。本研究中使用的仪器和制造商的详细信息见附录A。
紫外-可见（UV-Vis）光谱
PEP和HSA溶液
UV吸收光谱和荧光发射光谱特性
PEP/HSA与6PPD/IPPD/DPPD之间相互作用的光谱见附录A图S1和表S1。随着PPD浓度的增加，吸光度值逐渐增加。所有系统的吸收峰均发生红移，其中PPD-PEP系统的红移比PPD-HSA系统更为明显。
PEP/HSA与6PPD/IPPD/DPPD相互作用的荧光发射光谱见附录A图S2和表S2。所有发射峰均出现在
结论
本研究采用多光谱分析、分子对接和分子动力学模拟方法，深入阐明了三种结构不同的PPD与关键消化/传输蛋白（PEP/HSA）之间相互作用的分子机制，并利用网络毒理学预测了它们的潜在肝脏毒性特征。
光谱和热力学分析证实，PPD与PEP和HSA形成了稳定的非共价复合物。结合机制被确定为静态
CRediT作者贡献声明
董雅茹：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、概念化。郭明：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、软件使用、资金获取、概念化。程杰：项目管理、方法学、研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国浙江省自然科学基金白马湖实验室联合基金（编号LBMHZ24B060001）的支持。
