双酚A及其类似物对海洋多毛类动物Arenicola marina的毒性比较：又一起令人遗憾的替代品案例？

《Marine Pollution Bulletin》：Comparative toxicity of bisphenol A and analogues to the marine polychaete Arenicola marina: Another case of regrettable substitutes?

　　保拉·米利肯（Paula Milliken）|阿娜伊斯·安萨里（Anais Ansari）|乔恩·巴里（Jon Barry）|伊奥安娜·卡西亚达基（Ioanna Katsiadaki）|梅琳达·朗（Melinda Long）|萨拉·洛萨达（Sara Losada）|克里斯托弗·马丁（Christopher Martin）|拉拉·皮尔森（Lara Pearson）|玛尔塔·瓦诺尼（Marta Vannoni）|亚历克斯·R.O.卡曾斯（Alex R.O. Cousins）

环境、渔业和水产科学中心（洛斯托夫特实验室），帕克菲尔德路（Pakefield Road），洛斯托夫特（Lowestoft），萨福克（Suffolk），NR33 0HT，英国

**摘要**

本研究调查了双酚A（BPA）及其三种类似物——BPAP、BPZ和BPAF（BPs）对Arenicola marina的毒性。Arenicola marina是一种常用于评估化学物质对沉积物栖息生物毒性的海洋多毛类动物。BPA会在海洋沉积物中积累，而这些类似物的性质也表明它们更倾向于在沉积物中积累而非水中。研究发现，BPA和这三种BPs在相似浓度下都会导致生物死亡。根据名义暴露浓度，BPA、BPAF、BPAP和BPZ的LC50值分别为7.23、4.56、3.84和5.07毫克/千克干重。与之前涉及使用端足类动物（也常用于评估化学物质对海洋底栖生物毒性的研究）的比较表明，多毛类动物可能对BPA更为敏感。观察到的生物标志物变化趋势与碳水化合物储备的减少和脂质过氧化的增加一致。实际测得的化学物质浓度远低于名义浓度，尤其是BPA。这归因于研究过程中BPA的快速降解，但也可能与平衡缓慢和未完全回收有关。本研究的条件有利于有氧降解，因此可能不适用于所有环境基质。与其他BPs相比，BPA的损失更大，这表明这些替代品可能比BPA本身对环境更具危害性。

**1. 引言**

双酚A（BPA）是一种产量巨大的化学物质，仅2024年的产量就超过了800万吨（Paolella等人，2024年）。它主要用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂，自20世纪中叶以来，这些材料的广泛应用导致BPA大量进入环境，并来自多种来源（Vogel，2009年；Adamovsky等人，2024年）。许多研究得出结论，接触BPA会对人类健康和环境造成损害（Qi等人，2024年；Meena等人，2025年）。因此，对BPA的生产和使用实施了限制。在欧盟（EU），这些限制包括：2011年禁止在婴儿奶瓶中使用BPA；2018年限制食品接触材料中的BPA含量；2020年禁止在热敏纸上使用BPA（Lambré等人，2023年）；2024年欧盟委员会完全禁止在食品接触材料中使用BPA（欧盟委员会，2024年）。

尽管有这些限制，BPA仍然存在于环境中，全球表层水中的平均浓度估计为2.5微克/升（dos Santos等人，2024年）。然而，这些限制促进了类似物的使用，这些类似物具有相似的结构特征。许多双酚类似物（BPs）已被发现存在于水生基质中，其中Bisphenol AF（BPAF）、Bisphenol AP（BPAP）和Bisphenol Z（BPZ）的浓度分别为144.8、68和3.31纳克/升（dos Santos等人，2024年）。本研究是“化学品风险评估伙伴关系”（PARC）项目的一部分，旨在调查双酚类似物的毒性。选择BPAF、BPAP和BPZ是因为在环境基质中缺乏毒性数据，以及它们倾向于在沉积物中积累的特性（Adamovsky等人，2024年）。

**2. 材料与方法**

**2.1. Arenicola marina和沉积物的采集**

从英格兰南安登（Shoeburyness，坐标51°31′46.4″ N, 0°47′57.4″ E）采集了每只约1.7克的Arenicola marina个体，并根据ICES指南（Thain和Bifield，2001年）在实验室条件下适应了3天后开始实验。同时从同一地点采集了含泥的细沙。采集地点的地图见补充材料中的图S1。含泥的细沙在用作参考沉积物之前，通过500微米筛网过滤以去除较大的底栖生物。经过24小时的沉淀后，去除海水层，然后将沉积物置于空气中干燥48小时。每批沉积物的湿干比是通过在60°C下干燥三份沉积物样本来确定的。湿干比是通过将湿重除以干重计算得出的。

**2.2. 使用Arenicola marina进行的沉积物生物测定**

10天的急性毒性沉积物生物测定基于Thain和Bifield（2001年）的方法进行。BPA（CAS：80-05-7）、BPAF（CAS：1478-61-1）、BPAP（CAS：1571-75-1）和BPZ（CAS：843-55-0）由PARC项目从Chiron公司（Chiron AS，Stiklestadveien 1，NO-7041 Trondheim，挪威）统一采购。所有化学物质的纯度均超过98%，所有项目合作伙伴使用的是同一批次。添加化学物质的沉积物制备在暴露期前2天开始。由于双酚类物质的低水溶性，使用了HPLC级丙酮（Rathburn Chemicals Limited）作为溶剂载体。将溶液加入干燥的参考沉积物中，然后让丙酮蒸发后再将其混入剩余的参考沉积物中。沉积物的添加浓度分别为BPA和BPAF 0.1、0.3、1、3、10和30毫克/千克，BPZ和BPAP 0.3、1、3、10和100毫克/千克。这些浓度是根据初步范围测试（0.1至1000毫克/千克）选定的。在第0天和第10天，采集少量沉积物样本以验证测试浓度。使用仅含参考沉积物和海水的对照组进行了六次重复实验。每个对照组包含一个1.8升的玻璃容器，其中装有3厘米的沉积物，并加入3厘米的紫外线过滤人工海水。对于溶剂对照组，添加了与最高浓度下相同体积的丙酮，并允许相同的蒸发时间。每种测试物质在每个浓度下准备了三个重复实验。

每个重复实验中加入五只Arenicola marina个体。每24小时（±2小时）观察一次它们产生的粪便，并在记录后轻轻抚平粪便。在添加测试生物之前、第1天和第6天以及实验结束时测量水质参数，并每天检查并调整空气供应和水位以监测盐度。第10天，在观察粪便后，仔细筛选每个重复实验中的存活个体。由于它们分解迅速，未发现的Arenicola marina个体被视为死亡。存活的个体使用液氮快速冷冻以供进一步分析。由于多毛类动物不受1986年《动物（科学程序）法案》（ASPA）的保护，因此本研究不需要伦理批准。尽管如此，这些动物仍得到了高标准的照料。

**2.3. 生物标志物分析**

为了使样本均匀，将存活的个体在液氮中机械研磨后立即分装并储存在-80°C。用于生物标志物分析的浓度是每种测试化学物质在存活个体中的最高两个浓度，以及溶剂对照组中的存活个体。

**2.3.1. 细胞能量分配（CEA）**

CEA量化了生物体中的可用能量储备（以蛋白质、碳水化合物和脂质的形式），以及电子传输系统（ETS）的活性，后者是细胞能量消耗的指标。细胞能量分配是可用能量储备与消耗能量之间的比率，用于计算生物体的净细胞能量预算。CEA是通过在液氮研磨后使用50毫克Arenicola marina样本测量的。样品使用超声波探头和纳米纯水（1:30 v/w）进行超声处理。这种匀浆液用于通过De Coen和Janssen（1997年）描述的方法测量总脂质、蛋白质和碳水化合物来评估可用能量。对于脂质含量测定，提取后将在200°C下加热脂质层60分钟，然后加入1.5毫升去离子水并在375纳米处读取吸光度。甘油三棕榈酸酯用作脂质标准品。葡萄糖溶液用作碳水化合物标准品，在492纳米处读取吸光度。牛血清白蛋白（Sigma Aldrich）用作蛋白质标准品，在492纳米处读取吸光度。

**2.3.2. 谷胱甘肽S-转移酶（GST）**

为了测量谷胱甘肽S-转移酶（GST），将研磨的组织在0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中以1:2的比例超声处理，然后在10,000g和4°C下离心20分钟（Pires等人，2016年）。上清液被收集并储存在-80°C直到使用。总GST活性是通过使用含有1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）和还原型谷胱甘肽（GSH）的底物来测量的。GST催化这两种物质的结合，导致在340 nm处的吸光度增加。根据Habig等人（1974年）的方法修改后，使用分光光度计在25°C下读取5分钟的吸光度。

2.3.3 脂质过氧化
脂质过氧化是通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法来量化的，如Aguilar Diaz De Leon和Borges（2020年）所描述的。该测定法基于这样一个原理：马来酸醛（MDA）是多不饱和脂肪酸氧化降解的副产物，在酸性和高温条件下与硫代巴比妥酸（TBA）形成显色加合物。生成的MDA-TBA复合物在532 nm处通过分光光度法进行测量。
样品用三氯乙酸（TCA，100%）沉淀，并在离心前进行涡旋混合。上清液与EDTA（0.1 M）和TBARS反应溶液（1% TBA - 0.05 M NaOH - 0.025% BHT）混合。反应混合物被覆盖以防止光诱导的降解，并在100°C下孵育45分钟。样品在黑暗中冷却后转移到96孔板中（每孔200 μL），然后进行分光光度测量。MDA浓度是根据已知浓度的马来酸醛双（二甲基缩醛）（0–160 μM）制备的标准曲线来确定的。

2.4 化学分析
2.4.1 试剂和化学品
用于提取的甲醇和流动相是LiChrosolv Grade for Liquid Chromatography（Merck KGaA，德国达姆施塔特），而用于LC-MS的水是HiPerSolv Chromanorm，适用于UPLC（VWR International，英国莱斯特郡卢特沃斯）。≥99.0%的醋酸铵是CHROMASOLV? LC-MS Ultra洗脱剂添加剂，经过UHPLC-MS测试（Fluka Chemicals Limited，英国多塞特郡吉林厄姆）。BPA的标准品，标记有BPA（13C12）、BPZ、BPAP和BPAF，浓度均为50 μg/mL，溶解在甲醇中（Wellington Laboratories Inc.，加拿大安大略省圭尔夫）。标记的BPAP（13C6）和BPZ（13C12）以固体形式提供（纯度>98.5%），来自Toronto Research Chemicals（TRC North York，加拿大）。标记的双酚B（BPB）（13C12，溶解在丙酮中）和BPAF（13C12，溶解在甲醇中），浓度为100 μg/mL，来自Cambridge Isotope Laboratories（CIL，美国马萨诸塞州特克斯伯里和安多弗）。BPA、BPZ、BPAP和BPAF的固体标准品也由Chiron提供（Chiron AS，挪威特隆赫姆Stiklestadveien 1，NO-7041）。

2.4.2 样品制备和分析
湿沉积物样品收集在用溶剂冲洗过的玻璃罐中，在室温下的循环Hepa柜中干燥至恒重。通过重量差异计算每个样品的水分含量。干燥后，样品被研磨、筛分（2 mm），并准确称重后放入塑料离心管中进行提取。为了质量控制，每10个样品分析一个空白样品和一个内部参考样品。内部参考样品是通过在0.5 g干燥沉积物中加入250 ng/mL的天然双酚制备的。程序空白样品是一个加入提取溶剂的空管。所有样品、空白样品和参考样品在提取前都加入125–170 μg/mL的回收标准品（含有13C12-双酚Z、13C6-双酚AP、13C12-双酚AF和13C12-双酚A）。
提取时，向试管中加入5 mL甲醇，以1400 rpm的速度涡旋混合0.5分钟，然后在40°C下超声处理15分钟，最后以2000 rpm的速度离心10分钟。上清液转移到干净的15 mL塑料管中。提取过程重复两次。合并的提取物使用氮气（1.2 mL/min/<5 psi，40°C）蒸发至0.5 mL。加入500 μL 4 mM的醋酸铵水溶液（65:35甲醇:水），随后加入40 μL注射标准品（13C12-双酚B，浓度为0.5 μg/mL）。提取物涡旋混合后转移到仪器小瓶中，准备进行分析。对于预期浓度非常高的样品（超过30 μg/mL），将其稀释至校准曲线范围内（2.5 ng/mL至30 μg/mL）。
提取物的分析使用超高压液相色谱（Vanquish，Thermo）与高分辨率质谱（UHPLC-HRMS）结合进行，检测器为Orbitrap（Exploris 120，Thermo），采用负离子模式（ESI -）。作为混合器和泵之间的隔离柱使用了Hypersil Gold 50 mm × 3.0 μm柱（Thermo Fisher Scientific），分离柱使用Acquity BEC C18 3.0 μm 100 mm × 2.1（Waters）。流动相由A：2 mM醋酸铵水溶液和B：2 mM醋酸铵甲醇溶液组成。流动相流速为0.25 mL/min，梯度程序如下：B 10%持续1分钟，然后增加到60% B持续5分钟，保持2分钟，再增加到100% B持续4分钟，最后降低到10% B持续5分钟。柱温和样品温度分别为40°C和21°C。离子传输管温度为200°C，蒸发器温度为300°C。鞘气、辅助气和扫气分别设置为45、10和0（任意单位）。采集数据采用全扫描模式，质量范围为m/z 200–950，分辨率为60,000。
数据处理使用TraceFinder 5.1 EFS（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。目标分析物（BPA、BPZ、BPAP和BPAF及其标记衍生物）的质量以及仪器和方法的检测限可以在补充表S2和S3中找到。

2.4.3 质量保证和质量控制
为了质量保证，每批样品或至少每10个样品分析一个方法空白样品和一个内部参考样品。由于所有标准品的保质期至少为1年，并且实验表明这些目标化学物质在甲醇或水中储存时没有降解（Kova?i?等人，2019年），因此在研究期间认为不需要进行稳定性实验。
整个方法已经针对天然沉积物中的BPA、BPZ、BPAP和BPAF的三种浓度水平进行了验证。使用人工沉积物进行了测试，以查看它们的行为是否与天然沉积物中的不同；没有观察到差异。对于验证，使用相同的天然沉积物样品，分别加入50 ng/g（低浓度）、500 ng/g（中等浓度）和100 μg/g（高浓度）的标记物。验证结果总结在补充表S4中。回收率在87%到111%之间，相对标准偏差在1%到7%之间，表明样品制备方法适用于此目的。
定量是通过同位素稀释法进行的，使用每个标记化合物对应的天然化合物。因此，计算出的浓度已经进行了回收校正。为了质量控制并量化稀释样品，还使用了标记的BPB作为注射标准品。
校准曲线的范围为2.5 ng/mL至30 μg/mL。二次拟合最适合调整校准曲线，整个校准曲线范围内的R2 > 0.998。

2.5 统计分析
为了减少蚯蚓数量对产卵量的影响，每天计算每只存活蚯蚓产生的卵块数量（假设沉积物中的蚯蚓是活的）。然后将每只个体的每日卵块总数标准化到对照组（包括溶剂对照组），以避免季节性变化。标准化的卵块数据用于计算卵块的有效浓度中位数（EC50s）。
使用Comprehensive Environmental Toxicity Information System（CETIS v2.1.5.4）计算A. marina生物测定的中位致死浓度（LC50s）和EC50s。使用线性插值法获得卵块数据的EC50s，并使用未修剪的Spearman-K?rber方法进行死亡率分析。
所有其他分析都使用统计软件R（R Core Team，2024）进行，旨在比较化学物质的低浓度和高浓度与溶剂对照组。我们首选的方法是使用下面描述的混合模型方法，因为它明确地将重复实验之间的差异作为随机效应进行建模。然而，有时统计软件在拟合这些模型时会出现数值问题。当这种情况发生时，采用以下程序来检查重复实验之间是否存在差异。我们首先检查溶剂对照组和相应化学浓度组内的重复实验之间是否有明显的视觉差异。我们还从方差分析中计算了p值，以查看重复实验均值之间的差异。如果p值大于0.05且没有明显的视觉差异，则使用随机化测试将溶剂对照组的均值与浓度均值进行比较。我们使用R库中的permute.groups函数（Barry等人，2017）进行此操作。

2.5.1 混合模型
为了比较溶剂对照组均值和浓度均值，使用R包lme4中的lmer函数拟合了两个混合效应线性模型。第一个模型的形式为：
(1) Yij = a + TREATi + Repi + εij
其中i是第i组的第j个观察值，TREATi是第i组中使用的处理（例如SC或浓度水平），Repi是第i组的随机效应，满足Repi～N(0,τ2)，εij～N0σ2是随机误差项。
第二个模型与(1)相同，只是不包含TREATi项：
(2) Yij = a + Repi + εij
模型(1)和(2)使用似然比测试进行比较（Faraway，2006）。本质上，该测试衡量了包含两种处理时模型的优劣。如果处理效应大致相同，则模型(1)和(2)的拟合结果相似，似然比测试将不显著。

3. 结果
3.1 沉积物生物测定
当比较基于名义浓度的卵块产生和死亡率（LC50s）的EC50s时，BPAP的毒性更强（卵块产生的EC50为2 mg/kg，LC50为3.84 mg/kg），如图2和图3所示。BPAF的结果类似，卵块产生的EC50为2.07 mg/kg，LC50为4.56 mg/kg。BPZ暴露的EC50为5.06 mg/kg，LC50也为4.56 mg/kg，而BPA的毒性最低，卵块产生的EC50为7.10 mg/kg，死亡率的LC50为7.23 mg/kg。结果总结在表1中。除了BPZ外，所有化学物质的摄食行为变化通过卵块产生作为更敏感的终点。在BPZ的最低浓度下，摄食量增加，如图3所示。

下载：下载高分辨率图像（221KB）
下载：下载全尺寸图像
图2. 在BPA、BPAF、BPAP和BPZ的名义浓度和验证浓度下，每组蚯蚓的平均存活数。每组有5只蚯蚓；每个测试浓度有3组重复实验，共有12组对照组重复实验。基于名义值的曲线使用定量限（LOQ），即2.5 μg/kg干重。基于验证值的曲线使用每种BP的检测浓度或LOQ中的较高值。
下载：下载高分辨率图像（236KB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 标准化到对照组的总卵块产量（包括溶剂对照组）。在BPA、BPAF、BPAP和BPZ的验证和名义浓度下，卵块产量。基于名义值的曲线使用定量限（LOQ），即2.5 μg/kg干重。基于验证值的曲线使用每种BP的检测浓度或LOQ中的较高值。
表1. A. marina沉积物生物测定的卵块产生和LC50s结果。结果以EC50s和LC50s表示，95%置信限-上置信限用括号表示。
化学物质 EC50（卵块产生，mg/kg） EC50（验证，mg/kg）
BPA 7.10 (3.61–16.36) 0.54 (0.32–1.46) 7.23 (4.95–10.56) 0.63 (0.40–0.98)
BPAF 2.07 (0–3.42) 1.34 (0.67–1.70) 4.56 (3.63–5.73) 2.90 (2.25–3.75)
BPAP 2.00 (0.27–4.35) 1.13 (0.16–2.41) 3.84 (2.57–5.75) 2.02 (1.36–2.98)
BPZ 5.06 (n/a–6.26) 2.41 (n/a–3.01) 5.07 (4.36–5.70) 2.36 (2.02–2.76)
通过化学分析验证浓度后发现，沉积物中的实际浓度平均低于名义浓度（见补充材料中的表S5和S6）。对于BPAF、BPAP和BPZ这三种类似物，验证后的平均浓度比名义浓度低32%到88%。对于BPA，沉积物中的浓度平均低7%到16%，验证后的浓度范围从0.01 mg/kg到4.8 mg/kg。
调整验证后的浓度后，BPA在卵块产生（0.54 mg/kg）和死亡率（0.63 mg/kg）方面表现出最低的EC50。调整后的类似物的EC50s和LC50s也较低。BPAP在三种类似物中仍然具有最低的EC50和LC50值，其EC50值分别为1.13 mg/kg（用于幼虫产生）和2.02 mg/kg（用于死亡率），而BPZ的EC50值最高，分别为2.41 mg/kg（用于幼虫产生）和2.36 mg/kg（用于死亡率）。为了避免混淆，除非另有说明，关于浓度的进一步讨论将参考标称浓度。

3.2. 生物标志物分析
3.2.1. 细胞能量分配（CEA）
如图4所示，每种化学物质对细胞能量分配的影响各不相同。在较低浓度（3 mg/kg）下，BPA对CEA没有显著影响；但在较高浓度（10 mg/kg）下，CEA显著增加（p < 0.01）。对于BPAF，在低浓度（1 mg/kg）和高浓度（3 mg/kg）下，CEA均显著增加（p < 0.01）。图4还展示了能量储备，即碳水化合物、脂质和蛋白质的总和。与对照组相比，所测试的任何化学物质都没有导致能量储备的显著差异。

下载：下载高分辨率图像（141KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 在低（绿色）和高（蓝色）浓度下，暴露于BPA、BPAF、BPAP和BPZ的Arenicola marina的细胞能量分配（CEA）和能量储备。红色虚线表示平均对照值。点表示平均值，误差条表示标准偏差。对于BPA，低浓度=3 mg/kg标称值，高浓度=10 mg/kg标称值。对于BPAF、BPAP和BPZ，低浓度=1 mg/kg，高浓度=3 mg/kg标称值。p < 0.01用**表示。有关生物数量的信息，请参阅补充材料表S7。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

图5提供了CEA分析的额外结果。BPA和BPAP对A. marina的电子传输系统（ETS）没有显著影响。然而，BPZ在1 mg/kg和3 mg/kg浓度下分别使ETS增加了36%和28%（p < 0.01）。在1 mg/kg浓度下，BPAF的ETS显著减少了53%（p = 0.02），在3 mg/kg浓度下减少了58%（p = 0.01）。

下载：下载高分辨率图像（201KB）
下载：下载全尺寸图像
图5. 与对照组相比的脂质、蛋白质、碳水化合物和电子传输系统（ETS）的能量。红色虚线表示平均对照值。点表示平均值，误差条表示标准偏差。对于BPA，低浓度=3 mg/kg标称值，高浓度=10 mg/kg标称值。对于BPAF、BPAP和BPZ，低浓度=1 mg/kg，高浓度=3 mg/kg标称值。p < 0.01用**表示，p < 0.05用*表示。有关生物数量的信息，请参阅补充材料表S7。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

如图5所示，暴露于BPA及其类似物的生物体的碳水化合物含量低于对照组生物体。在低BPA浓度（3 mg/kg）下，与对照组相比没有显著差异；但在高浓度（10 mg/kg）下，BPA的碳水化合物含量显著下降（38%，p = 0.04）。与BPA类似，BPAP和BPZ在1 mg/kg低处理下也没有发现碳水化合物含量的显著差异。对于BPAF和高浓度（3 mg/kg）处理，这两种化学物质分别使测试生物体中的碳水化合物水平显著下降了54%和45%（p < 0.01）。暴露于BPAF的生物体在低（1 mg/kg）和高（3 mg/kg）浓度下的碳水化合物水平分别显著但非单调地下降了52%和41%（p < 0.01）。

与对照组生物体相比，所测试的任何化学物质都没有对A. marina的蛋白质或脂质含量产生显著影响。对于BPA和BPAF，对照组的平均蛋白质含量为1379 mJ/mg ww，而低浓度和高浓度BPA组的平均蛋白质含量分别为1435 mJ/mg ww和1721 mJ/mg ww，低浓度和高浓度BPAF组的平均蛋白质含量分别为1352 mJ/mg ww和1494 mJ/mg ww。对于BPAP和BPZ，组的平均蛋白质含量为887 mJ/mg ww，与低浓度和高浓度BPAP的平均蛋白质含量分别为778 mJ/mg ww和841 mJ/mg ww以及低浓度和高浓度BPZ的平均蛋白质含量分别为703 mJ/mg ww和753 mJ/mg ww相似。

脂质含量在BPA和BPAF对照组中平均为407 mJ/mg ww，在低浓度和高浓度BPA中分别为447 mJ/mg ww和375 mJ/mg ww，在低浓度和高浓度BPAF中分别为404 mJ/mg ww和427 mJ/mg ww。对于BPAP和BPZ，对照组的脂质平均值为477 mJ/mg ww。这与低浓度和高浓度BPAP的平均值（分别为489 mJ/mg ww和491 mJ/mg ww）没有显著差异，也与低浓度和高浓度BPZ的平均值（分别为456 mJ/mg ww和473 mJ/mg ww）没有显著差异。

3.2.2. 谷胱甘肽S-转移酶（GST）
如图6所示，与对照组相比，所有添加了化学物质的沉积物中的测试生物体都表现出GST产量的增加。在添加了BPA的沉积物中，GST产量在低浓度（3 mg/kg）和高浓度（10 mg/kg）下分别平均增加了13%和19%。对于BPZ，在低浓度（1 mg/kg）和高浓度（3 mg/kg）下，GST产量分别增加了16%和21%。BPAF在低浓度（1 mg/kg）和高浓度（3 mg/kg）下使GST产量增加了30%和19%，但这些增加与对照组没有显著差异。BPAP显著影响了测试生物体中的GST产量，在1 mg/kg（低浓度）下增加了33%，在3 mg/kg（高浓度）下显著增加了51%（p > 0.01）。

下载：下载高分辨率图像（117KB）
下载：下载全尺寸图像
图6. （左）与对照组相比的谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性；（右）通过蛋白质质量的TBARS含量测量的脂质过氧化。对于BPA，低浓度=3 mg/kg，高浓度=10 mg/kg。对于BPAF、BPAP和BPZ，低浓度=1 mg/kg，高浓度=3 mg/kg。统计显著性p < 0.01用**表示，p < 0.05用*表示。有关生物数量的信息，请参阅补充材料表S7和S8。

3.2.3. 脂质过氧化
除了3 mg/kg的BPAP外，所有暴露于BPA和BP测试物的Arenicola marina都表现出硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）产量的增加，如图6所示。暴露于1 mg/kg BPAP的生物体与溶剂对照组相比，TBARS产量显著增加了（p = 0.02，从0.07 ± 0.05增加到0.14 ± 0.07 μmol/mg蛋白质）。然而，在3 mg/kg BPAP下，TBARS产量与溶剂对照组没有差异。所有其他测试的化学物质都显示出TBARS产量与浓度之间的正相关关系，其中BPA的TBARS产量增加了最多，大约是溶剂对照组的3倍（在3 mg/kg和10 mg/kg浓度下分别为0.12 ± 0.05 μmol/mg蛋白质和0.35 ± 0.16 μmol/mg蛋白质）。暴露于BPAF的生物体在低浓度（1 mg/kg）和高浓度（3 mg/kg）下的TBARS产量分别为0.25 ± 0.15 μmol/mg蛋白质和0.35 ± 0.08 μmol/mg蛋白质，这都显著高于溶剂对照组（p < 0.01）。BPZ暴露使TBARS产量从溶剂对照组的0.07 ± 0.05 μmol/mg蛋白质增加到1 mg/kg下的0.19 ± 0.07 μmol/mg蛋白质，以及在3 mg/kg BPZ下的0.23 ± 0.10 μmol/g蛋白质。

4. 讨论
4.1. 沉积物生物测定
当使用测试化学物质的标称浓度进行生物测定时，所有三种双酚类似物对A. marina的毒性都高于BPA。尽管涉及不同的分类群，但最近的一些研究报道双酚类似物的毒性高于BPA。例如，dos Santos等人（2024年）的综述发现几种双酚类似物在急性测试和慢性测试中对藻类、甲壳类动物和鱼类的毒性显著高于BPA；而Wang等人（2018年）报告称BPAF对鱼类、甲壳类动物和软体动物的毒性高于BPA。然而，使用验证的浓度时观察到了不同的趋势，BPA具有最低的EC50和LC50值。这可能是由于BPA的降解产物导致了毒性。关于BPA降解产物的毒性研究有限且结果不一。Han等人（2015年）发现了多种毒性高于BPA的降解产物，而Ike等人（2002年）仅发现BPA的生物降解产物的毒性低于BPA。不幸的是，我们没有筛查沉积物中的降解产物，因此无法确定这是否对本研究的毒性有贡献。尽管如此，四种化合物之间的差异很小，LC50值的范围小于4 mg/kg dw，这表明它们对测试生物体的毒性大致相当。预期脂溶性会增加毒性，但并未明显观察到；这可能归因于BP的相似分配系数以及由于降解导致的BPA浓度的不确定性。

BPA引起的死亡机制很可能是由于基线毒性（麻醉）或极性麻醉。许多涉及双酚的研究特别关注与内分泌干扰相关的不良影响。虽然有研究支持多毛类动物中存在同源受体靶点（Keay和Thornton，2009年），并且一些关于环节动物的研究将BPA的影响解释为雌激素机制（Wang和Wang，2021年），但此处考虑的终点并未研究这些特定的毒性机制。

对于暴露于BPA、BPAF和BPAP的A. marina，幼虫产生的数量是比死亡率更敏感的终点。对于BPZ，在较低浓度下幼虫产生的数量增加，表明在低量BPZ存在的情况下测试生物体的摄食活动增加。当BPZ浓度达到10 mg/kg时，幼虫产生的数量降至零，此时没有存活的生物体。摄食活动的增加可能与代谢活动的增加有关，这通过ETS活动的增加以及碳水化合物能量储备的减少观察到。暴露于BPAP的生物体在碳水化合物能量储存和ETS活动方面也观察到了类似的结果；然而，BPZ是唯一导致摄食行为增加的化学物质。

据作者所知，这是首次报道BPA和BP对A. marina的存活和摄食行为的影响。在文献中几乎没有关于其他双酚类似物的类似数据。Biggers和Laufer（2004年）研究了多毛类Capitella sp.幼虫在BPA存在下的定居情况，并根据幼虫的定居和变态情况报告了约0.01 mg/L的EC50值。Li等人（2011年）研究了双酚A处理对Perinereis aibuhitensis的影响，并报告称随着BPA浓度的增加（最高测试浓度为200 μg/L），死亡率显著增加（高达30.83%）。随后，Zhao等人（2014年）研究了同一物种中特定G蛋白的表达变化，但即使在最高浓度0.1 mg/L BPA下也未观察到死亡率。Staples等人（2016年）探讨了BPA对其他环节动物如Lumbriculus variegatus的影响，估计LC50/EC50值为>56 mg/kg dw。Vought和Wang（2018年）以及随后的Wang和Wang（2021年）也研究了BPA对Lumbriculus variegatus的影响，但他们关注的是不同的生理终点。

从监管角度来看，最可比的数据可能是Staples等人（2016年）对海洋端足类Leptocheirus plumulosus的研究。该研究基于初始测量的BPA浓度确定了49 mg/kg dw的LC50值，以及使用模型端足类进行的28天研究中的无效应浓度（NOEC）为12 mg/kg。另一项针对海洋端足类Corophium volutator的研究也描述了类似的EC50值为36 mg/kg dw（Joint Research Centre，2010年）。虽然Arenicola marina通过摄取含有有机物的沉积物颗粒获取营养，而像Corophium volutator这样的端足类则以沉积物表层的碎屑和腐烂有机物为食，但这些物种在系统发育上相距甚远，但它们共享相同的环境，即海洋沉积物。此外，Corophium volutator或Leptocheirus plumulosus等多毛类动物和Arenicola marina常用于评估生态毒性化学危害的信息需求（欧洲化学品管理局，2023年），并且被视为等效的。这些端足类动物的效应水平表明，与本研究中估计的BPAP的LC50值（介于0.63毫克/千克（实测）和7.23毫克/千克（名义值）之间相比，BPA对底栖生物的毒性较低。无论是实测浓度还是名义浓度，都表明BPA对底栖生物的毒性都高于端足类动物研究中的预期。生物测定数据的解释受到名义浓度与实测浓度之间巨大差异的影响；对于BPA而言，这种差异非常显著，因为实测浓度仅为名义浓度的10%以下。尽管如此，对于其他双酚类物质（BPAF和BPZ），也观察到了相同的趋势，即实测浓度大约是名义浓度的一半。这种差异在实验开始时（在沉积物平衡2天后加入测试生物）和实验结束时都存在。需要注意的是，在进行化学分析之前，沉积物已经过干燥处理，这一过程可能导致了一些数据的损失。BPA在有氧条件下会迅速降解，包括在沉积物中（例如参见Cousins等人，2002年或Choi和Lee，2017年的研究），尽管通常很难区分降解和从沉积物基质中无法回收测试物质的情况。

在本测试系统中观察到的双酚类物质浓度降低可以解释为对底栖生物的潜在风险较小，但相对于BPA而言，其他双酚类物质可能带来更高的风险。然而，本研究使用的条件相对有氧，涉及浅层、混合良好的沉积物，有利于有氧降解和快速降解，这可能并不代表真实的环境基质。先前研究双酚类物质在环境中的命运时，曾指出沉积物中的双酚类物质水平高于预期，并因此对这一环境中的生物降解过程进行了高度保守的估计（Cousins等人，2002年）。

关于沉积物中双酚类物质的环境浓度的数据有限。Adamovsky等人（2024年）的最新综述没有发现任何报告的BPAP或BPZ浓度超过检测限的研究。在沉积物中报告的最高BPAF浓度为0.155毫克/千克干重，低于本研究中发现的效应水平。关于环境基质中BPA水平的数据更为全面，但根据所查阅的文献，沉积物中的BPA浓度通常也低于本研究中的效应水平。Heemken等人（2001年）报告河流沉积物中的BPA浓度在66至343微克/千克干重之间，而Flint等人（2012年）的综述列出的沉积物中BPA浓度最高为43微克/千克干重。Kle?ka等人（2009年）的荟萃分析利用欧洲海洋沉积物中报告的BPA浓度累积分布，确定了95百分位浓度为0.566毫克/千克干重。许多关于海洋沉积物的观察结果低于检测限（66%，n=44），尽管作者认为采样可能存在偏向受污染地点的偏差。尽管如此，这项荟萃分析表明，在海洋沉积物中确实记录到了非常高的BPA浓度。本研究中发现的最低LC50值为0.63毫克/千克（基于实测浓度），这表明在考虑评估因素时，应关注沉积物中BPA的存在。

4.2 生物标志物分析
4.2.1 细胞能量分配（CEA）
据作者所知，这是首次将CEA与BPA及双酚类物质的暴露联系起来进行测量。尽管所有测试组在所有浓度下的总体CEA没有显著差异，但暴露于BPAP和BPZ的生物体的CEA显著下降，表明这些化合物造成了显著的压力。暴露于BPA和BPAF的生物体的CEA趋势不同，其中BPA的最高浓度下CEA显著升高，而BPAF的低浓度和高浓度下CEA也有所升高。这种额外的能量消耗表明，BPA和BPAF造成的压力小于BPAP和BPZ。ETS结果与CEA结果一致，BPAP和BPZ导致能量使用增加，而BPA和BPAF则减少了生物体的能量需求。

尽管结合后的能量储备没有变化，但所有组中的碳水化合物都显著减少。这种减少可能归因于进食量的减少，正如BPA、BPAF和BPAP暴露时观察到的蜕皮产物减少所显示的那样。然而，暴露于BPZ的生物体蜕皮产物增加，以及同时暴露于BPZ和BPAP的生物体ETS增加，表明这些增加的能量需求消耗了碳水化合物储备。10天的暴露时间可能不足以影响其他能量储备，因为碳水化合物是首先被利用的储备物质。与人类研究不同（Franko等人，2024年；Tang等人，2025年），本研究中未观察到脂质含量的变化，后者发现BPA和双酚类物质的暴露会导致脂质积累。这种差异可能是由于研究持续时间、人类和多毛类动物之间的代谢途径差异，或是两者的结合所致。虽然蛋白质相对于对照组没有变化，但绝对蛋白质含量在对照组和测试组之间存在差异；这可能是由于季节性差异，因为分析需要分两部分进行。由于生物体的大小，本研究无法针对特定器官进行CEA分析，因此是在整个生物体水平上进行的分析。然而，这可能会掩盖对特定组织的影响。

4.2.2 谷胱甘肽S-转移酶活性
谷胱甘肽结合通过使目标分子更具水溶性来帮助外源物质的解毒，从而促进其从生物体中排出。底物通常是亲脂性的，含有亲电碳或杂原子，可以通过添加或先添加后去除适当的离去基团或谷胱甘肽部分来进行结合（Parkinson等人，2019年）。GST还具有更广泛的功能，通过催化GSH与活性氧物种的副产物的结合来控制细胞内氧化应激，而且已知促氧化化学物质会增加GST的表达（Hayes等人，2005年）。

GST通过促进对亲电底物的攻击来实现GSH的结合。对于缺乏亲电基团的双酚类物质，GST结合可能不是生物转化和消除的最可能途径。文献中描述了哺乳动物中双酚类物质的替代第二阶段代谢过程，如磺化和葡萄糖醛酸化（Nachman等人，2014年；Parkinson等人，2019年；Testa和Kr?mer，2008年；V?lkel等人，2002年）。尽管如此，双酚类物质可能通过其激活后产生的活性代谢物诱导GST活性，或者作为外源物质识别反应的一部分（Adamovsky等人，2024年；Marcos等人，2021年）。本研究发现暴露于双酚类物质的蠕虫中GST活性较高。然而，只有BPAP显示出统计学上的显著增加（p<0.05）（见图6）。GST活性研究中使用的高和低名义浓度（1-3毫克/千克干重）代表了高于环境基质中可能预期的暴露水平，这部分被分析物较低的实测浓度所缓解。尽管GST活性对BPA暴露有反应，但考虑到使用的相对较高浓度，我们认为它是一个相对不敏感的生物标志物。我们认为观察到的活性增加最可能的机制是对氧化应激的间接反应。

4.2.3 脂质过氧化
除了BPAP的高浓度外，脂质过氧化与测试的双酚类物质浓度之间存在显著的正相关。总体而言，脂质过氧化似乎是一个比GST更敏感的生物标志物，尽管高暴露浓度的相关考虑同样适用。Babi?等人（2016年）报告BPA对蚯蚓Eisenia fetida也有类似的影响，在暴露后的24小时和48小时内观察到脂质过氧化显著增加。对于暴露于BPAP的蠕虫，低浓度下脂质过氧化增加，随后在高浓度下减少，这表明抗氧化防御系统被激活。

5. 结论
总之，本研究考察了BPA及其三种替代品（BPAP、BPAF、BPZ）对海洋多毛类动物A. marina的毒性，并对选定的生物标志物进行了分析。发现这些双酚类物质的毒性相似，而观察到的EC50趋势取决于选择的是名义浓度还是验证浓度。在选定的生物标志物中，最一致的趋势是暴露后碳水化合物储备的消耗和脂质过氧化的增加。实测的双酚类物质浓度，特别是BPA，显著低于名义浓度，这与基于先前文献报告的快速降解预期一致，但这使得实际暴露情况的解释变得复杂。观察到的毒性具有监管意义，因为它们表明A. marina（一种常用于评估海洋沉积物中化学物质毒性的生物）对BPA的敏感性高于其他底栖生物。此外，本研究还为较少研究的双酚类物质提供了毒理学数据。虽然研究没有直接测量测试物质的降解情况，但有迹象表明这些替代品的持久性相对于BPA更强。这一观察结果，结合其相似的毒性，突显了潜在的环境问题，特别是如果任何类似物以与BPA相似的水平进入环境的话。另一个与BPA替代相关的问题是，多对一替代和叠加效应可能引入的复杂性，这可能会使测量、监测和危害评估变得复杂。

**作者贡献声明**
Paula Milliken：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析、概念化。
Anais Ansari：撰写——初稿、方法学、调查。
Jon Barry：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学、正式分析。
Ioanna Katsiadaki：撰写——审阅与编辑、资金获取。
Melinda Long：方法学、正式分析。
Sara Losada：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学、正式分析。
Christopher Martin：撰写——初稿、方法学、正式分析。
Lara Pearson：撰写——初稿、方法学、调查、正式分析。
Marta Vannoni：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、方法学、调查、正式分析、概念化。
Alex R.O. Cousins：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、正式分析、概念化。

**关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明**
本文档的撰写过程中未使用任何生成式AI或AI辅助技术。

**资金来源**
本工作得到了英国环境、食品和农村事务部（Defra）以及英国研究与创新机构（UKRI）通过其与英国Horizon合作伙伴关系（PARC）关于化学品风险评估的协议（授权号101057014）的支持。