环境性灌溉增加了青蛙感染壶菌的概率

《Ecosphere》：Environmental watering elevates chytrid infection probability in frogs

　　摘要

与气候变化相关的长期干旱对两栖动物构成了全球性的威胁。环境补水可能有助于减缓种群数量的下降，但可能会加剧在潮湿环境中繁殖的壶菌病（chytridiomycosis）的蔓延。我们的研究旨在探讨环境水源与壶菌如何相互作用，从而影响澳大利亚南部濒危物种Pseudophryne bibronii的生存状况。我们在五个地点的每个地点设置了20个屋顶避难所，并为它们提供水源，而另外五个地点则保持自然状态。在2022年和2023年的繁殖季节期间，我们每月对这些位于屋顶和自然避难所下的青蛙进行壶菌检测、测量并逐一识别。研究发现，向屋顶避难所供水会增加壶菌感染率并降低青蛙的存活率。壶菌的游动孢子数量与被捕获的概率呈负相关，感染壶菌的青蛙存活率更低，身体状况也更差。壶菌病似乎对P. bibronii既有亚致死效应也有致死效应。另一方面，一些P. bibronii似乎能够自行清除壶菌感染，这可能与当地不利于壶菌生存的环境条件或它们对疾病的抵抗力有关。2022年降雨量较大时，壶菌感染率最高；此外，感染率还与土壤湿度和pH值有关，但与土壤温度无关。我们得出结论，在正常降雨年份和降雨量较大的年份，应避免创建潮湿的避难所，因为这会降低青蛙的存活率并增加壶菌感染的风险。然而，在干旱期间重复我们的研究方法仍然至关重要，因为补水可能会加剧壶菌病的传播，但同时也可以通过防止脱水来减少青蛙的死亡。

引言

不受控制的人为气候变化正在导致世界许多地区出现极端天气（Clarke等人，2022年）。随着碳排放的增加，这些极端天气模式预计会变得更加严重，对生物多样性造成严重影响（IPCC，2023年）。除了极端天气外，其他压力因素如野火、栖息地丧失和野生动物疾病也在持续威胁物种（Harfoot等人，2021年；Kearney等人，2019年），并且这些因素可能与气候变化的极端影响相互作用，加速生物多样性的丧失（Geary等人，2019年）。了解如何管理这些日益增长且可能相互作用的生物多样性威胁至关重要，因为保护管理者正试图在这一人类活动高峰期保护生物多样性。两栖动物处于全球生物多样性危机的最前沿（Harfoot等人，2021年；Hof等人，2011年）。壶菌病这种流行性疾病已导致全球501个物种的数量下降（Scheele等人，2019年），是极度濒危两栖动物的主要威胁（Due?as等人，2021年）。此外，两栖动物比其他类群更容易受到气候变化的影响（Urban，2024年），干旱已在多个国家导致两栖动物数量下降（Daszak等人，2005年；Hof等人，2011年；Scheele等人，2012年），且预计这种趋势会持续恶化（Wu等人，2024年）。连续干旱之间的短暂湿润期可能不足以让两栖动物恢复，预计整个地区的种群数量将持续下降（Mac Nally等人，2014年，2017年）。两栖动物生物多样性的丧失具有重大后果，因为它们在食物网和生态系统中扮演着重要角色（Beard等人，2003年；Hickerson等人，2017年），并且为生态系统提供服务（Hocking & Babbitt，2014年），包括对人类健康和福祉的贡献（Mavoa等人，2019年；Valencia-Aguilar等人，2013年）。壶菌病和干旱给保护管理者带来的最大问题是它们可能会相互作用（Hof等人，2011年），其结果尚不确定。壶菌病由真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）引起，这种真菌在干燥条件下会死亡。因此，干旱期实际上可能有助于两栖动物的生存（Beyer等人，2015年；Kriger，2009年；Riley等人，2013年；Terrell等人，2014年）。然而，如果两栖动物聚集在潮湿的避难所中，Bd的传播可能会增加（Longo等人，2010年）。此外，当池塘提前干涸时，蝌蚪会加速变态过程，但这会削弱它们的免疫系统，使它们更容易受到Bd感染（Brannelly等人，2019年；Kohli等人，2019年）。干旱季节还可能使成年两栖动物更容易感染高浓度的Bd（Ruggeri等人，2018年），这可能通过破坏皮肤细菌来实现（Buttimer等人，2025年）。因此，干旱期既有可能降低也可能增加壶菌病的风险，但目前的研究还不足以预测具体结果。这种不确定性使得保护管理者难以阻止两栖动物数量的持续下降。通过建造能够延长水存期的栖息地（即池塘保持水的时间），可以增加变态为青蛙的蝌蚪数量，从而避免与干旱相关的死亡（Scheele等人，2016年；Scheele, Foster等人，2019年；Turner等人，2022年）。同样，通过在干旱期间提供潮湿的避难所来改变微气候，可以帮助青蛙在繁殖期之间避免脱水（Hoffmann等人，2021年）。然而，在某些情况下，这种环境补水措施也可能增加Bd感染的风险，因为疾病宿主会持续存在（Hite等人，2016年），并且更潮湿的栖息地有利于Bd的传播（Ruggeri等人，2018年）。除了水分供应外，Bd感染还受到其他环境因素的影响，特别是微气候的温度变化（Heard等人，2015年；Turner, Wassens, Heard, & Peters，2021年）和土壤性质如pH值（Chew等人，2024年）。个体特征也可能影响感染风险（Gervasi等人，2017年），包括身体状况（Sasso等人，2024年）。在澳大利亚，这些问题尤为突出，因为该地区有43种两栖动物受到Bd的严重影响，其中7种已经灭绝（Scheele, Skerratt等人，2017年），而且干旱是一个周期性威胁（Mac Nally等人，2017年）。濒危物种Pseudophryne bibronii的数量最近有所下降（Heap等人，2015年；SWIFFT，2020年）。干燥的筑巢地点会降低幼体的繁殖成功率（Chambers等人，2006年），同属物种也因Bd和干旱而濒临灭绝（Scheele等人，2012年；Scheele, Hunter等人，2017年）。因此，P. bibronii可能特别容易受到干旱和疾病相互作用的影响。这种物种在干燥的秋季将卵产在木头和草垫等遮蔽物下，随后这些地方会被暂时形成的水池淹没。因此，通过环境补水来延长水存期具有巨大潜力，因为只需要少量的水即可达到这一效果。在这项研究中，我们探讨了四个研究问题：（1）环境水源如何影响P. bibronii对Bd感染的脆弱性？（2）Bd感染是否降低了被捕获的概率？（3）环境水源的提供和Bd感染如何影响检测和存活率？（4）哪些环境因素会影响感染风险，Bd感染与身体状况之间有什么关系？我们的研究提供了新的实地实验证据，说明环境水源的提供和壶菌病如何相互作用，从而影响青蛙的生存。我们的发现可以帮助保护管理者和公众制定利用环境水源来提高两栖动物在干旱和疾病面前的抵抗力的计划。

方法

研究物种

P. bibronii的分布范围从南澳大利亚延伸到昆士兰州东南部。它们是小型青蛙（本研究中的平均吻肛长度（SVL）为27毫米，标准差为2.4毫米），雌性每次可产下97-235枚直径4.5-5.5毫米的卵，这些卵可以分多次产下（Anstis，2002年；Humphries，1979年）。变态过程在120-180天后完成（Woodruff，1977年）。

调查设计和采样

我们选择了十个地点，这些地点的土地所有者表示有P. bibronii的种群，并获得了进入这些地点和安装水箱的许可。这些地点分布在澳大利亚维多利亚州中部的四个区域，靠近本迪戈（Bendigo）、卡斯尔梅因（Castlemaine）、西摩（Seymour）和默顿（Merton）（图1），各区域之间相距至少33公里，总面积达150平方公里。其中三个区域各有一个湿润（有水源）和一个干燥（无水源）的地点，第四个区域有两个湿润地点和两个干燥地点。同一区域内的地点之间的距离在86-800米之间。有一个地点（西摩的干燥地点）在整个研究期间都没有发现P. bibronii。这些地点的植被主要是干燥的桉树林，包括箱铁皮桉树林、山谷草本森林、草本干燥森林和石南干燥森林。根据澳大利亚维多利亚州Heathcote气象站（BOM，2025年）的数据，过去100年、50年和20年的年平均降雨量分别为579毫米（标准差=163毫米）、573毫米（标准差=163毫米）和558毫米（标准差=175毫米）。2022年的降雨量远高于平均水平（894毫米），而2023年的降雨量仅略高于平均水平（589毫米）。

图1：澳大利亚维多利亚州中部的研究地点。卫星图像插图中，白色圆圈代表干燥地点；绿色方块代表有环境水源的地点。我们使用Landsat/Copernicus和Airbus提供的Google Earth卫星图像。在每个地点，我们放置了20对屋顶作为人工避难所，每对屋顶中的一个叠放在另一个上面以增加保温效果。屋顶均匀分布在距离临时水池20米半径范围内的区域。湿润地点配备了5000升的塑料水箱和滴灌系统，通过低流量滴头将水分配到屋顶。这些水来自当地供应商，符合饮用水标准。我们还在每个地点的自然避难所下监测青蛙，包括木头、岩石和草丛下的青蛙。湿润地点与干燥地点之间的自然避难所差异反映了随机因素，因为湿润地点的自然避难所没有得到补水。2022年3月至7月和2023年4月至7月期间，我们每月对这些地点进行调查。为了减少疾病在地点间的传播风险，我们在不同地点之间使用Kobalt医院级消毒剂对鞋类进行消毒。每只青蛙使用一次性乳胶手套处理，青蛙暂时用一次性塑料袋存放。天黑前，我们会小心翻转屋顶避难所，并捕获任何青蛙进行处理后再放回原处。天黑后，我们在自然避难所中继续搜寻青蛙。搜寻至少持续1小时，但如果青蛙在自然避难所中发出叫声，搜寻时间可能会更长。对于每个避难所，我们记录了卵块的数量、pH值、湿度和土壤温度。捕获的青蛙用一次性无菌棉签从身体各部位擦拭三次。擦拭前会清除多余的污垢以避免污染DNA样本。我们以毫米为单位精确测量吻肛长度（SVL），称量青蛙的体重精确到0.01克，并拍摄腹部图案以进行个体识别（附录S1：图S1）。通过手动比较地点内的照片来识别被捕获的青蛙。身体状况通过基于体长、体重和缩放因子（Peig & Green，2009）计算出的缩放质量指数（SMI）来评估。缩放因子b描述了体重与SVL之间的关系，通过幂函数回归估计得出，以创建一个与动物大小无关的身体状况指数（Brodeur等人，2020年；Peig & Green，2009年）。使用smatr包的sma函数（Warton等人，2012年）对不同地点的b进行成对比较，并通过Sidak调整进行多重检验，结果没有显示出b在不同地点之间存在显著差异（平均p值=0.92，标准差=0.23）。这些调整后的成对检验中最低的p值为0.06，适用于样本量较小的两个地点（FTD1，n=14；SBW，n=24）。因此，我们在所有地点使用相同的缩放因子来计算SMI。样本在4°C下保存，直到每个野外季节结束，然后由EnviroDNA–Cesar Australia进行处理。他们提供了游动孢子计数（Boyle等人，2004年）以及感染状态（阳性、阴性或不确定），其中不确定的结果是指TaqMan检测中有一个或两个阳性孔（Hyatt等人，2007年）。

分析

治疗效果对Bd感染的影响

我们使用二项广义线性混合模型（GLMMs）来测试主要处理措施对Bd感染的影响，同时考虑了年份间和年份内两个时期间Bd感染量的变化。我们将Bd感染（两个水平：个体青蛙阳性或阴性[包括不确定]）作为响应变量，以及两个交互项的加性效应。第一个交互项是site_type（两个水平：湿润的、有水源的屋顶；干燥的、无水源的屋顶）与refuge_type（两个水平：自然避难所包括草垫、木头和岩石；屋顶包括两个陶瓷屋顶，一个叠在另一个上面）的相互作用。第二个交互项是年份（两个水平：2022年、2023年）与时间（两个水平：早期=3月或4月；晚期=5月至7月）的交互作用。将站点分为四个区域的“区块”（见图1）被作为随机效应进行拟合。我们还尝试将站点ID作为随机效应进行拟合，无论是否包含区块，但这些模型的修正Akaike信息量准则（AICc）值分别比仅包含区块的模型高2.1和2.9，而当包含区块随机效应时，站点随机效应的值为零。我们还尝试将个体ID和避难所ID作为随机效应进行拟合，但这些因素解释的变异量几乎为零，因此被省略了。最终模型公式为：chytridpos ~ season × time + refuge_type × site_type + (1|block)，其中season = year，使用lme4包（Bates等人，2015年）的glmer函数进行拟合。所有可能的模型子集都使用MuMIn的dredge函数（Barton，2020年）根据AICc进行排序。由于MuMIn的限制，即在模型平均后无法对因素的水平进行平均，我们最终使用了最佳模型的预测值。我们进一步分析了在最佳模型AICc值上下两个delta范围内排名较低的模型，以识别那些虽然不在最佳模型中但仍然具有显著效应（p < 0.1）的变量。我们按照Muff等人（2022年）的建议解释P值。我们没有发现任何额外的显著效应，因此仅展示了最佳模型的预测效应及其95%置信区间。

我们的第二个分析旨在了解Bd负荷是否影响未来被重新捕获的概率。我们将个体是否在当前捕获后再次被捕获（0 = 当前捕获后未被捕获，1 = 当前捕获后被捕获）作为Bd负荷（经过log + 1变换）的函数进行建模。其他固定效应包括避难所类型、站点类型及其交互作用，以及年份、时间及其交互作用。站点被作为随机效应。我们尝试将区块作为随机效应，但它没有解释任何变异，因此没有被使用。我们还尝试将Bd感染作为随机效应进行建模，但最佳模型的AICc值比仅考虑Bd负荷的模型更高，所以我们只报告了Bd负荷模型。最终模型为：recap_later ~ chytridlog + refuge_type × site_type + season × time + (1|site_id)，所有模型组合均使用MuMIn的dredge函数根据AICc进行排序。

为了了解我们的浇水处理是否影响生存率，我们使用marked包（Laake等人，2013年）拟合了生存和检测模型。我们将站点类型、避难所类型及其交互作用的所有可能组合作为生存协变量和检测协变量进行拟合，同时也拟合了没有协变量的空模型。在所有模型中，我们将时间间隔设置为每月一次，年份之间相隔9个月（即time.intervals = c(1,1,1,1,9,1,1,1)）。我们特别关注站点类型与避难所类型之间的交互作用对生存率的影响，因此在出现这种交互作用的最高排名模型中进行了检验。模型根据AICc进行排序。我们还研究了壶菌感染对生存率和检测率的影响。我们没有将壶菌感染与之前的模型组合一起拟合，因为壶菌本身受到那些模型中解释变量的影响。最终模型包括将壶菌感染（是/否）作为随时间变化的生存协变量，以及壶菌感染与站点类型和避难所类型的交互作用作为检测协变量。为了进一步评估感兴趣模型的统计支持，我们使用基于卡方分布的似然比测试获得了总体p值。对于模型的生存部分，我们将测试模型与没有生存协变量但保留了检测协变量的模型进行了比较；反之亦然，以测试检测协变量。因此，低p值（<0.1）表明添加检测协变量或生存协变量可以解释数据中的显著额外变异。

我们的第二个分析旨在了解Bd负荷是否影响未来被重新捕获的概率。我们将个体是否在当前捕获后再次被捕获（0 = 当前捕获后未被捕获，1 = 当前捕获后被捕获）作为Bd负荷（经过log + 1变换）的函数进行建模。其他固定效应包括避难所类型、站点类型及其交互作用，以及年份、时间及其交互作用。站点被作为随机效应。我们尝试将区块作为随机效应，但它没有解释任何变异，因此没有被使用。我们还尝试将Bd感染而不是Bd负荷作为随机效应进行建模，但最佳模型的AICc值比仅考虑Bd感染的模型更高，所以我们只报告了Bd负荷模型。最终模型为：recap_later ~ chytridlog + refuge_type × site_type + season × time + (1|site_id)，所有模型组合均使用MuMIn的dredge函数根据AICc进行排序。

为了了解我们的浇水处理是否影响生存率，我们使用marked包（Laake等人，2013年）拟合了生存和检测模型。我们将站点类型、避难所类型及其交互作用的所有可能组合作为生存协变量和检测协变量进行拟合，同时也拟合了没有协变量的空模型。在所有模型中，我们将时间间隔设置为每月一次，年份之间相隔9个月（即time.intervals = c(1,1,1,1,9,1,1,1)）。我们特别关注站点类型与避难所类型之间的交互作用对生存率的影响，因此在出现这种交互作用的最高排名模型中进行了检验。模型根据AICc进行排序。我们还研究了壶菌感染对生存率和检测率的影响。我们没有将壶菌感染与之前的模型组合一起拟合，因为壶菌本身受到那些模型中解释变量的影响。最终模型包括将壶菌感染（是/否）作为随时间变化的生存协变量，以及壶菌感染与站点类型和避难所类型的交互作用作为检测协变量。为了进一步评估感兴趣模型的统计支持，我们使用基于卡方分布的似然比测试获得了总体p值。对于模型的生存部分，我们将测试模型与没有生存协变量但保留了检测协变量的模型进行了比较；反之亦然，以测试检测协变量。因此，低p值（<0.1）表明添加检测协变量或生存协变量可以解释数据中的显著额外变异。

我们使用二项式广义线性混合模型（GLMM）来研究三个环境协变量：温度、湿度和pH值对Bd感染概率的影响。我们还旨在评估青蛙体况（SMI）与Bd感染之间的关系。在这些模型中，站点被作为随机效应。我们尝试将区块和区块+站点作为随机效应，但这些模型的AICc值（最佳模型分别高4.3和2）高于仅将站点作为随机效应的模型。大多数协变量之间的相关性小于|0.7|，除了土壤pH值与年份呈负相关（Pearson R2 = ?0.85），这意味着这些变量不能在同一模型中使用。因此，在测试土壤湿度、温度和体况对Bd感染影响的模型中，我们包括了年份与时间的固定效应，以考虑这些变异来源。最终模型为：chytridpos ~ season × time + scale(soil_moisture) + scale(temperature) + smi + (1|site_id)，使用MuMIn的dredge函数根据AICc对所有模型组合进行排序。为了测试不同巢穴站点之间的pH值差异，我们通过选择一年的数据并拟合Bd感染与土壤pH值和时间的函数来研究年内的效应，以考虑这一变异来源。对于2022年的数据，区块作为随机效应得到了最佳模型，而站点或站点+区块的AICc值分别比单独使用区块高0.7和2。因此，最终模型为：chytridpos ~ time + scale(soil_ph) + (1|block)。对于2023年，站点作为随机效应得到了最佳模型（区块和区块+站点的AICc值分别高2.1），因此使用site_id作为随机效应。所有模型组合均使用MuMIn的dredge函数根据AICc进行排序。土壤湿度、pH值和温度在分析前进行了中心化和标准化处理，然后使用effects包（Fox & Weisberg，2019年）进行反变换以供展示。由于体况较差的青蛙可能更容易感染Bd，或者Bd可能导致体况变差，我们进行了两项补充分析。使用首次捕获时未被感染且再次捕获时仍无Bd的青蛙数据子集，我们通过拟合初始捕获时体况与再次捕获时Bd感染状态的线性模型来测试体况较差是否使青蛙容易感染Bd。为了测试Bd感染是否导致体况下降，我们使用相同的数据子集，但使用R stats包中的lm函数将体况的变化作为再次捕获时Bd感染状态的函数进行建模。由于这个子集只有43行数据，我们无法拟合更复杂的模型。由于很少有个体可以可靠地被识别为雌性，我们无法进行性别差异的分析。

为了进一步了解我们的浇水处理如何影响Bd感染风险，我们使用GLMM来评估三个环境协变量：温度、湿度和pH值对Bd感染概率的影响。我们还旨在评估青蛙体况（SMI）与Bd感染之间的关系。在这些模型中，站点被作为随机效应。我们尝试将区块和区块+站点作为随机效应，但这些模型的AICc值（最佳模型分别高4.3和2）高于仅将站点作为随机效应的模型。大多数协变量之间的相关性小于|0.7|，除了土壤pH值与年份呈负相关（Pearson R2 = ?0.85），这意味着这些变量不能在同一模型中使用。因此，在测试土壤湿度、温度和体况对Bd感染影响的模型中，我们包括了年份与时间的固定效应，以考虑这些变异来源。最终模型为：chytridpos ~ season × time + scale(soil_moisture) + scale(temperature) + smi + (1|site_id)，使用MuMIn的dredge函数根据AICc对所有模型组合进行排序。为了测试不同巢穴站点之间的pH值差异，我们通过选择一年的数据并拟合Bd感染与土壤pH值和时间的函数来研究年内的效应。对于2022年的数据，区块作为随机效应得到了最佳模型，而站点或站点+区块的AICc值分别比单独使用区块高0.7和2。因此，最终模型为：chytridpos ~ time + scale(soil_ph) + (1|block)。对于2023年，站点作为随机效应得到了最佳模型（区块和区块+站点的AICc值分别高2.1），因此使用site_id作为随机效应。所有模型组合均使用MuMIn的dredge根据AICc进行排序。土壤湿度、pH值和温度在分析前进行了中心化和标准化处理，然后使用effects包（Fox & Weisberg，2019年）进行反变换以供展示。由于体况较差的青蛙可能更容易感染Bd，或者Bd可能导致体况变差，我们进行了两项补充分析。使用首次捕获时未被感染且再次捕获时仍无Bd的青蛙数据子集，我们通过拟合初始捕获时体况与再次捕获时Bd感染状态的线性模型来测试体况较差是否使青蛙容易感染Bd。为了测试Bd感染是否导致体况下降，我们使用相同的数据子集，但使用R stats包中的lm函数将体况的变化作为再次捕获时Bd感染状态的函数进行建模。由于这个子集只有43行数据，我们无法拟合更复杂的模型。由于很少有个体可以可靠地被识别为雌性，我们无法进行性别差异的分析。

为了进一步了解我们的浇水处理如何影响Bd感染风险，我们使用GLMM来评估湿润站点下瓷砖下的土壤湿度与未浇水的避难所（包括湿润和干燥站点中的自然避难所以及干燥站点中的瓷砖）之间的差异。由于年间的降雨量差异很大，我们拟合了站点类型、避难所类型和年份（2022年、2023年）的三因素交互作用。我们使用AICc来确定最佳排序的随机效应模型，将站点、区块和站点+区块作为三个最大模型中的选项。我们使用lme4包（Bates等人，2015年）的lmer函数进行模型拟合，并使用MuMIn的dredge函数（Barton，2020年）根据AICc对所有模型组合进行排序。我们展示了以区块作为随机效应的模型结果，因为最佳排序的模型具有最低的AICc（站点和站点+区块的AICc值分别高3.74和2.15）。最终模型公式为：soil_moisture ~ refuge_type × site_type × season + (1|block)。所有分析均使用R 4.4.1（R Core Team，2024年）和R Studio 2024.04.01（Posit Team，2024年）完成。

我们的数据集包括317次P. bibronii的捕获记录，代表259只个体青蛙，大多数捕获发生在4月（2022年112次，2023年73次）或5月（2022年26次，2023年38次）。两年中每个月都观察到了Bd感染，平均感染率为28.6%（标准差=0.14）。对于多次被捕获的个体，22只保持无Bd状态，20只在最后一次捕获时感染了Bd，7只在最后一次捕获时感染了Bd但随后无Bd。有四个排名较高的模型研究了Bd感染与年份、时间、避难所类型和站点类型之间的关系（附录S1：表S1）。我们发现2023年的Bd感染概率低于2022年（图2a），并且感染概率从季节早期到晚期大约翻了一番（图2b）。避难所类型与站点类型的交互作用显著，其中在湿润站点下屋顶瓷砖下捕获的青蛙感染概率最高（图2c）。年份和时间的交互作用出现在其中一个排名较高的模型中，但没有统计支持（p > 0.1）。

（a–c, h–j）Bd感染概率，（d）再次捕获概率，（e）检测概率，（f, g）Pseudophryne bibronii的月度生存率，以及（k）青蛙避难所中的土壤湿度。Bd感染概率取决于（a）年份；（b）季节时间：早期（3月–4月）或晚期（5月–7月），以及（c）实验设计，比较湿润或干燥站点中的自然避难所和屋顶避难所。（d）未来被再次捕获的概率取决于首次捕获时的Bd负荷，（e）检测取决于避难所类型（自然避难所与屋顶避难所），生存率取决于（f）实验设计和（g）Bd感染。其他影响Bd感染的协变量包括（h）土壤湿度（百分比）；（i）第二年的土壤pH值；以及（j）体况。（k）青蛙被捕获时的土壤湿度取决于实验设计和年份。误差条和带状区域表示95%置信区间；在（i）中为了确保y轴范围一致而进行了截断。d、h、i和j的x轴上的刻度表示数据分布。我们发现随着Bd负荷的增加，再次捕获概率略有下降（图2d）。尽管避难所类型、站点类型、年份和时间出现在九个最佳模型中的一个或多个中（附录S1：表S2），但它们几乎没有统计支持（p > 0.1）。排名最高的模型显示，在自然避难所中青蛙的检测概率显著低于屋顶避难所（图2e；附录S1：表S3和S4）。包括站点类型和避难所类型交互作用的排名最高的模型（第五名，ΔAIC = 2.83）没有显著的个体系数（附录S1：表S4）。然而，将所有生存协变量包括在模型中的效应具有中等统计支持（p = 0.04；图2f）。在干燥站点下的屋顶避难所和自然避难所中，生存率相似。相比之下，在提供水的湿润站点下，屋顶避难所下的平均生存率几乎减半（图2f）。感染壶菌也使生存率大约减半（图2g）。在预测检测的模型中，最佳模型包括了与图2e中相似的避难所类型效应，以及非显著的壶菌感染效应（附录S1：表S5和S6）。在测试温度、湿度和体况效应时，有三个排名较高的模型（附录S1：表S7a–c）。我们发现随着土壤湿度的增加，Bd感染率增加（图2h）。在第一年，没有证据表明土壤pH值影响Bd感染，而在第二年有微弱的正相关证据（图2i）。尽管温度在最佳模型中，但几乎没有统计支持（p = 0.128）。随着体况的改善，Bd感染率下降（图2j）。我们的补充分析发现，首次捕获时的体况不影响再次捕获时的感染概率（F1,41 = 0.66，p = 0.42）。另一方面，再次捕获时感染Bd的青蛙与未感染青蛙相比，体况变化为?0.19（标准误=0.11），但这只有微弱的统计支持（F1,41 = 2.885，p = 0.097）。土壤湿度与站点类型、避难所类型和季节的三因素交互作用显著相关（图2k；附录S1：表S8）。在2022年这个降雨量较大的年份，浇水处理的瓷砖比自然避难所的瓷砖稍微更湿润，而这种轻微的趋势在未浇水的干燥区域并未观察到。在降雨量接近平均水平的年份，浇水处理的瓷砖与自然避难所相比也表现出更高的湿度。然而，在干燥区域，瓷砖的湿度水平明显低于自然避难所（图2k）。