叶片经济学与局部适应：地中海一年生植物对宏观和微观气候干旱梯度的遗传与可塑性响应

《Ecology and Evolution》：Leaf Economics and Local Adaptation: Genetic and Plastic Responses Within Mediterranean Annual Species to Macro- and Microclimatic Aridity Gradients

　　**摘要**

理解植物如何适应降雨变化和加剧的干旱至关重要，尤其是在地中海地区。叶片经济谱（Leaf Economics Spectrum, LES）框架将具有高比叶面积（specific leaf area, SLA）和低叶片干物质含量（leaf dry matter content, LDMC）的快速生长植物与具有相反特征的节俭资源植物区分开来。在较干燥的环境中，可以预期植物会表现出较低的SLA和较高的LDMC，以减少水分损失并增强抗旱能力。然而，尚不清楚这种预期是否在本地适应的物种内部成立，以及它如何受到干旱和竞争的塑性调节。本研究调查了五种地中海一年生植物在宏观气候降雨梯度（年降雨量89–926毫米）和对比鲜明的微气候条件下的SLA和LDMC变化：北部较湿润和南部较干旱的区域。在这些梯度上的15个地点收集了种子，并在受控温室条件下种植植物，设置了三种实验处理：对照组、干旱处理和竞争处理。与LES的预期相反，来自较干燥宏观气候的植物大多演化出了较高的SLA和较低的LDMC，这表明通过快速生长和早期繁殖来逃避干旱的策略比保守利用资源更为有利。尽管在两种物种中微气候下的叶片特征变化小于宏观气候下的变化，但南部暴露的植物显示出较低的SLA和/或较高的LDMC。对干旱的塑性反应一致地降低了SLA并增加了LDMC，而在竞争条件下则相反，从而抵消了基于遗传的宏观气候模式。有趣的是，湿润地区的种群表现出更强的对竞争的塑性变化。我们的结果表明，在较干燥的地区，进化倾向于选择具有获取性特征的叶片，而在干旱压力和竞争条件下，可塑性则使叶片特征朝相反方向变化。这些发现说明了进化反应和塑性反应之间的相互作用，强调了在评估一年生植物对未来气候变化的响应时考虑遗传分化和可塑性的重要性。

**1 引言**

叶片经济谱（LES）为理解从快速生长、资源获取型植物到缓慢生长、资源节约型植物的功能策略提供了一个基础框架（Reich 2014; Wright et al. 2004）。LES的关键特征包括比叶面积（SLA，单位干质量的叶面积）和叶片干物质含量（LDMC，单位鲜质量的干质量）。在高SLA的植物中，光合作用速率较高，且在有利条件下生长迅速（Shipley et al. 2005; Wright et al. 2004），而高LDMC则表明投资于耐旱的结构（Smart et al. 2017）。SLA和LDMC的变化可能反映了在资源丰富条件下最大化生长与增强耐旱能力之间的权衡（高SLA，低LDMC）与在干旱条件下增强耐旱能力之间的权衡（低SLA，高LDMC），这与竞争和压力作为许多环境梯度上的关键驱动因素的拮抗关系相呼应（Bongers et al. 2017; Janíková et al. 2024; Lorts and Lasky 2020）。全球分析一致显示，在干旱和营养贫乏的环境中，低SLA和高LDMC的植物占主导地位，这支持了在压力下提高生存能力的保守策略（Han et al. 2025; Liu et al. 2023; Radford-Smith and Dwyer 2025）。这些模式通常归因于物种更替（Wright et al. 2004）。然而，由可塑性或基于遗传的局部适应驱动的种内特征变异越来越被认为会影响特征响应（Fajardo and Siefert 2018; Navarro et al. 2022; Pichon et al. 2022）。尽管如此，可塑性与局部适应在塑造SLA和LDMC方面的机制作用仍很少被区分开来。局部适应涉及基于遗传的、可遗传的特征分化，这增强了在局部环境中的适应性（Kawecki and Ebert 2004; de Vries et al. 2024）。沿着干旱梯度，选择应倾向于在较干燥的地区选择保守特征，如低SLA和高LDMC，因为它们具有节水性和结构优势；而在湿润地区可能选择支持快速生长的获取性特征（Baruch et al. 2017; Dwyer et al. 2014; Grime 1974, 1977; Radford-Smith and Dwyer 2025; Reich 2014）。实际上，来自干旱地区的多年生植物通常表现出较低的SLA和较高的LDMC（Baruch et al. 2017; Carlson et al. 2016; Ramírez-Valiente et al. 2010），这与LES的预测一致。然而，一年生植物往往偏离这些模式。来自较干燥地区的植物在Chamaecrista fasciculata（Etterson 2004）和Arabidopsis thaliana（Fletcher et al. 2022）中倾向于具有较低的SLA，在Plantago patagonica（Christie et al. 2022）中具有较高的SLA，在几种地中海一年生植物中则没有明显趋势（Bergholz et al. 2017; Kurze et al. 2017）。这些例子表明，一年生植物的快速生活史和干旱逃避策略可能导致特征综合征与LES的预测不同（Franks et al. 2007; Kooyers 2015），使得沿干旱梯度的叶片特征变化在一年生植物中理解较少，需要更多的研究。虽然大多数关于局部适应的研究集中在广泛的宏观气候梯度上，但暴露方向可以在短距离内创造明显的微气候对比，反映大规模气候模式（Saeidi et al. 2023）。在北半球，由于太阳辐射较大，南向坡度通常更温暖和干燥，植被稀疏，干旱适应物种的丰富度高于北向坡度（Blanco-Sánchez et al. 2022; Kutiel and Lavee 1999; Nevo 2012; Pan et al. 2023）。这些条件可能促进局部特征分化，并作为研究微气候适应的天然实验室（Estevo et al. 2022; Nevo 2012）。实际上，来自北向坡度的同种个体在15个地点表现出更强的竞争能力，而来自南向坡度的个体在应对干旱方面表现稍好（Gade and Metz 2024）。此外，来自单一地点的研究报告了北向和南向同种个体之间的一些基因型或表型差异（Nevo 2012; Qian et al. 2018; Wang et al. 2023）。然而，尚不清楚来自相反暴露方向的同种个体是否演化出了不同的SLA和LDMC，从而促进了微气候的局部适应。虽然西藏的高山草甸群落在南向暴露下表现出更保守的叶片特征（低SLA，高LDMC）（Pan et al. 2023），但在两种地中海灌木中，选择倾向于在两种暴露方向上都选择获取性叶片特征，这与LES的预期相反（Blanco-Sánchez et al. 2022; Carlucci et al. 2015）。唯一一项报告微气候局部适应的叶片特征的研究发现，一年生植物Brachypodium hybridum在北向和南向暴露下的SLA和LDMC没有差异（Kurze et al. 2017）。表型可塑性，即基因型在不发生遗传变化的情况下根据环境条件修改特征的能力，是应对水资源等变量变化的关键机制（Sommer 2020; Stamp and Hadfield 2020）。通过控制浇水或互惠移植设计的实验研究通常发现，干旱会降低SLA并增加LDMC，有利于限制水分损失并延长叶片寿命的保守特征（Etterson 2004; Kramp et al. 2022; Oyanoghafo et al. 2023; Ramos-Mu?oz et al. 2024）。类似地，草原物种在干旱年份会降低SLA并增加LDMC，反映了表型可塑性对年际水资源变化的响应（Wheeler et al. 2023）。然而，一些研究报告了相反的模式。O'Hara等人（2016）发现，在Brassica rapa中，干旱条件下SLA增加，无论是在温室实验中还是通过七代的进化实验中都是如此。竞争也可能塑性地改变SLA和LDMC，但实证证据仍然稀缺且不均匀。较高的物种丰富度（可能增加光照竞争）在温带草本植物中增加了SLA（Lipowsky et al. 2015）。在亚热带树苗中，种间竞争同样增加了SLA以捕获更多光线，但也增加了LDMC，使叶片更加坚韧（Yang et al. 2021）。在温带Carex物种中，竞争降低了SLA并增加了LDMC，从而有利于保守叶片（Janíková et al. 2024）。季节动态可以进一步调节叶片可塑性，以及干旱和竞争的相互作用（Hao et al. 2023; Janíková et al. 2024; Lorts and Lasky 2020），这突显了需要进一步研究干旱和竞争下的可塑性。本研究通过分离SLA和LDMC的遗传变异，进一步评估了对干旱和竞争的塑性响应，研究了沿宏观和微气候干旱梯度的局部适应。选择了五种地中海一年生植物，包括两种草本植物（Brachypodium hybridum, Avena sterilis）和三种草本植物（Hedypnois rhagadioloides, Hippocrepis unisiliquosa, Anagallis arvensis），这些植物在以色列的自然宏观气候降雨梯度上采样，年降雨量范围为89至926毫米。在每个地点的北向和南向暴露处都收集了种子，以捕捉微气候变化。后代在共同的温室条件下培养，以分离遗传对叶片特征的影响。对于两种重点物种（Brachypodium hybridum, Hedypnois rhagadioloides），评估了对干旱和竞争处理的塑性响应。我们测试了来自干旱地区和南向暴露的植物是否演化出了较低的SLA和较高的LDMC，反映了保守的叶片策略。我们进一步测试了相应的塑性响应，即干旱条件下SLA是否降低而LDMC是否增加，但在竞争条件下是否相反，以及这些响应是否取决于宏观和微气候的起源。

**2 材料与方法**

**2.1 采样地点**

研究在以色列的宏观气候干旱梯度上进行，从北到南大约覆盖250公里（图1）。我们使用了Gade和Metz（2024）描述的相同15个采样地点，这些地点的年降雨量范围为89至926毫米（详见附录表S1）。所有地点都具有相似的石灰岩基岩和年平均温度（17.8°C–19.8°C）。在较湿润的地点，植被更密集（Golodets et al. 2013; Tielb?rger et al. 2014; 图1），导致竞争比在较干燥的地点更激烈（Metz and Tielb?rger 2016; Schiffers and Tielb?rger 2006）。在每个地点，由小干谷分隔的北向和南向暴露形成了微气候对比，南向暴露更干燥且植被更稀疏（图1；附录表S1）。

**2.2 研究物种**

我们研究了五种冬季一年生植物，它们跨越了四个被子植物科：两种草本植物Brachypodium hybridum和Avena sterilis（都属于Poaceae科），以及三种草本植物Hedypnois rhagadioloides（Asteraceae科）、Hippocrepis unisiliquosa（Fabaceae科）和Anagallis arvensis（Primulaceae科）（图2）。这些物种在我们的研究区域的灌木丛和林地草本层中频繁出现（Feinbrun-Dothan et al. 1998），并且主要是自交的，这有利于通过减少基因流来促进局部生态型分化（Boaz et al. 1990）。

**2.3 种子采集和植物栽培**

2019年5月，从所有15个地点的北向和南向暴露处收集了种子。对于每个物种，每个暴露区随机采样了大约15个母本个体（以下简称基因型），每个个体之间的最小距离为3米，以减少遗传相关性。由于某些暴露区和地点的物种基因型数量少于15个，最终数量分别为：Brachypodium hybridum 431个基因型，Avena sterilis 384个基因型，Hedypnois rhagadioloides 371个基因型，Hippocrepis unisiliquosa 334个基因型，Anagallis arvensis 330个基因型。在第一次实验中，这些植物在德国Hildesheim大学的共同受控温室条件下从2019年12月培养到2020年5月。野外收集的种子被播种在直径5.7厘米、深度25厘米的400毫升盆中，盆中填充了来自Hildesheim的未施肥粉质粘土，这种土壤类似于研究区域的石灰岩衍生土壤（pH 7.2±0.1，有机碳含量2.9%±0.1%，总氮含量56±16 ppm；Zwikel et al. 2007）。每个盆中种植了5-10个单一基因型的种子，所有物种总共1848个盆。2019年12月19日，每个盆浇水40毫升（相当于16毫米的降雨量）以启动发芽。发芽后，每个盆中保留了一个随机目标个体。除了Anagallis arvensis的发芽率较低外（附录表S1），发芽率总体较高。温室温度在冬季为15°C–20°C（最低10°C），在晚春为20°C–30°C（最高35°C），以模拟田间条件。光照周期通过LED温室灯补充，从12月的10小时开始，每周增加15分钟，以模拟以色列的自然日长变化（Aronson et al. 1992）。盆在物种内部随机排列，并每3周重新随机排列，以减少位置效应。所有植物大约每周浇水40毫升，以提供均匀、良好的生长条件。为了获得每个基因型的全同胞种子，防止了基因型之间的交叉授粉（如Metz et al. 2020所述）。2020年5月收获前2周停止了灌溉。

**2.4 Brachypodium hybridum和Hedypnois rhagadioloides的实验处理**

在接下来的冬季季节（2020年11月–2021年5月）进行的第二次实验中，仅对两种植物（一种草本植物Brachypodium hybridum和一种草本植物Hedypnois rhagadioloides）评估了对干旱和竞争的塑性响应。这些物种被选中是因为它们代表了不同的功能类型，在温室条件下发芽良好，并且分别为草本植物和杂草提供了最高的基因型重复率（详细信息见Gade和Metz 2024年的研究）。每个基因型有三个重复的盆栽，被分配到三种处理组中：对照组、干旱组或竞争组，因此Brachypodium hybridum共有1269个盆栽，Hedypnois rhagadioloides共有948个盆栽。每个盆栽都填充了之前使用过的相同土壤，并种植了五个单一基因型的完整种子，这些种子材料来自在相同条件下的第一次实验。为了便于操作，这两种植物被种植在不同的温室桌子上。盆栽在物种内部随机排列，并且每3周重新随机化一次。实验始于2020年11月19日，所有盆栽都浇了40毫升的水，然后在12月9日和12月20日又各浇了40毫升的水，以确保种子发芽和幼苗建立。到2021年1月中旬，每个盆栽中的幼苗被稀疏到每个目标位置一个。对照组在整个实验期间大约每周浇40毫升的水，模拟了良好的生长条件。干旱处理模拟了干旱地区的典型降雨量低的情况：盆栽在与对照组相同的日期浇水，但在12月29日至2月17日期间只浇了10毫升的水，之后逐渐增加水量以反映生长过程中的水分需求。在浇水之前，植物出现了明显的萎蔫现象，证实了水分限制的存在。竞争处理组的浇水方式与对照组相同（在相同的日期浇40毫升的水），但每个盆栽中还增加了两株竞争植物：一株Plantago afra L.（车前科）和一株Avena sterilis L.（禾本科），这些植物代表了采样地点中的常见邻居。竞争植物的种子来自降雨量中等的地区（MA, BJ）。每个盆栽中播种了六颗Plantago afra的种子和三颗Avena sterilis的种子，最后每种植物都稀疏到一株。与对照组相比，干旱处理使两种植物的适应性降低了大约50%，竞争处理使适应性降低了大约70%，这证实了这些实验处理有效地挑战了植物的适应性（Gade和Metz 2024）。

2.5 叶片特征的测量

评估了两个功能性叶片特征：SLA（比叶面积）和LDMC（干物质质量比），按照标准协议计算（Pérez-Harguindeguy等人2013年）。完全展开的健康叶片被收获后立即称重（鲜重），使用ImageJ软件测量面积，然后在60°C的烤箱中干燥24小时以确定干重。叶片采样大约在每个物种的开花期进行。在第一次实验中，Brachypodium hybridum的采样时间为2020年2月26日至3月9日，Avena sterilis为2020年3月10日至19日，Hedypnois rhagadioloides为2020年3月23日至26日，Hippocrepis unisiliquosa为2020年3月30日至4月2日。最后，Anagallis arvensis的采样时间为2020年4月6日至7日。在第二次实验中，Brachypodium hybridum的采样时间为2021年2月8日至19日，Hedypnois rhagadioloides为2021年3月1日至12日。

2.6 统计分析

对于第一次实验，我们分别测试了所有五个物种和两个特征是否因植物在宏观和微气候干旱梯度上的不同位置而有所变化。使用R 4.2.2（R Core Team 2024）和lme4包（Bates等人2015）拟合了线性混合效应模型，固定效应包括年平均降雨量（连续变量）和暴露方向（北 vs. 南），以及它们的交互作用。地点作为随机效应，以解释同一地点的个体之间的非独立性。固定效应使用Type II Wald F检验进行测试，自由度通过car包（Fox和Weisberg 2019）近似计算。对于第二次实验，包括Brachypodium hybridum和Hedypnois rhagadioloides的实验处理，SLA和LDMC使用类似的混合效应模型进行分析。固定效应包括降雨量（连续变量）、暴露方向（分类变量）和处理方式（分类变量：对照组、干旱组、竞争组），以及它们的交互作用。基因型嵌套在地点中作为随机效应，以反映每个基因型有三个重复的实验设计。事后比较使用emmeans包（Lenth 2023）进行，emmeans()函数用于处理组间的比较，emtrends()用于涉及降雨量和处理方式的交互作用。

3 结果

3.1 降雨量和暴露对叶片特征的影响

我们的研究物种的叶片特征差异很大（表1；图3和图4），其中包括两种草本植物（Brachypodium hybridum, Avena sterilis）和三种杂草（Hedypnois rhagadioloides, Hippocrepis unisiliquosa, Anagallis arvensis）。SLA在Brachypodium hybridum中最高（平均约44 mm2/mg），其次是Hedypnois rhagadioloides（平均约31），Avena sterilis（平均约24），Anagallis arvensis（平均约20），最低的是Hippocrepis unisiliquosa（平均约15）。相比之下，LDMC在Brachypodium hybridum和Hippocrepis unisiliquosa中最高（均为平均约268 mg/g），其次是Avena sterilis（平均约263），Anagallis arvensis（平均约244），最低的是Hedypnois rhagadioloides（平均约152）。在物种中，Hedypnois rhagadioloides的叶片最具适应性（SLA高，LDMC低），Hippocrepis unisiliquosa的叶片最为保守（SLA低，LDMC高）。尽管不同物种之间的特征值有所差异，但作为功能组的草本植物和杂草之间没有明显差异，表明这些差异主要是物种特异性的。

表1. 线性混合模型测试了SLA对起源地宏观气候梯度（降雨量）和暴露方向（北 vs. 南）的响应结果。自由度（df）通过Kenward–Roger方法近似计算。粗体表示显著的p值（p < 0.05）。

图3. 来自不同宏观气候降雨梯度地点的植物（x轴）以及北向（实心圆）或南向（空心圆）暴露方向的五个研究物种（A—E）的比叶面积（SLA）。误差条表示平均值的±标准误差。为了便于解释，显示了降雨量、暴露方向和降雨量×暴露方向交互作用的显著性水平：***p ≤ 0.001；**p ≤ 0.01；*p ≤ 0.05；ns表示不显著；见表1。

图4. 来自不同宏观气候降雨梯度地点的植物（x轴）以及北向（实心圆）或南向（空心圆）暴露方向的五个研究物种（A—E）的叶片干物质含量（LDMC）。误差条表示平均值的±标准误差。为了便于解释，显示了降雨量、暴露方向和降雨量×暴露方向交互作用的显著性水平：***p ≤ 0.001；**p ≤ 0.01；*p ≤ 0.05；ns表示不显著；见表2。在宏观气候梯度上，除了Hippocrepis unisiliquosa外，四个物种的SLA随着降雨量的增加而显著降低（表1；图3），表明来自湿润地点的植物叶片更为保守。Hedypnois rhagadioloides和Brachypodium hybridum在第二次实验中也重复了这一模式（表3；图5），强调了这些变化的遗传基础。LDMC随着降雨量的增加而在Hedypnois rhagadioloides（两个实验中，表2和图4；图4和6）、Avena sterilis（表2；图4）和Brachypodium hybridum（仅在第二次实验中，表2和表4；图4和6）中显著变化。Hippocrepis unisiliquosa和Anagallis arvensis的LDMC随降雨量的变化不显著。

图5. 在三种温室处理条件下生长的两种植物物种的比叶面积（SLA）：对照组（A, D；蓝色），干旱胁迫（B, E；橙色）和竞争（C, F；绿色）。植物来自宏观气候降雨梯度上的不同地点（x轴），以及北向（实心圆）或南向（空心圆）暴露方向。误差条表示平均值的±标准误差。统计结果见表3。

表2. 线性混合模型测试了LDMC对起源地宏观气候梯度（降雨量）和暴露方向（北 vs. 南）的响应结果。自由度（df）通过Kenward–Roger方法近似计算。粗体表示显著的p值（p < 0.05）。

图6. 在三种温室处理条件下生长的两种植物物种的叶片干物质含量（LDMC）：对照组（A, D；蓝色），干旱胁迫（B, E；橙色）和竞争（C, F；绿色）。植物来自宏观气候降雨梯度上的不同地点（x轴），以及北向（实心圆）或南向（空心圆）暴露方向。误差条表示平均值的±标准误差。暴露效应（微气候）通常不如宏观气候降雨效应明显，且当存在时，其方向在不同物种间有所不同。Hedypnois rhagadioloides在来自南向暴露的植物上具有显著更高的LDMC和略低的SLA，尽管它是唯一一个没有降雨量效应的物种（表1和表2；图3D，图4D）。相反，仅在第二次实验中，Hedypnois rhagadioloides的SLA总体较高，而Brachypodium hybridum的LDMC较低（图5和图6），这与它们在宏观气候梯度上的模式一致。降雨量×暴露方向的交互作用在物种间很少显著，表明暴露的微气候效应在宏观气候（降雨量）梯度上大体相似。然而，在Hedypnois rhagadioloides中观察到SLA的弱交互作用（表3），表明存在一些暴露特定的敏感性。

总体而言，宏观气候起源影响了大多数物种（Hippocrepis unisiliquosa除外）的SLA和LDMC，导致来自湿润地点的植物具有更保守的叶片特征（SLA较低，有时LDMC较高）。微气候暴露效应较弱，且仅在三个物种中显著，但在两个物种中与宏观气候模式一致，表明来自南向暴露的植物具有更保守的叶片。宏观气候和微气候起源是否影响SLA或LDMC在草本植物（Brachypodium hybridum, Avena sterilis）和杂草物种（Hedypnois rhagadioloides, Hippocrepis unisiliquas, Anagallis arvensis）中是分散的。

3.2 实验处理对叶片特征的影响

在第二次实验中，杂草Hedypnois rhagadioloides和草本植物Brachypodium hybridum都对实验处理表现出强烈的可塑性，且方式大体相似。SLA在不同处理组间有显著差异，在竞争组中最高（图5F,C），在干旱组中最低（图5E,B），在对照组中处于中间水平（图5D,A）（表3）。LDMC也反映了这一模式，在竞争组中最低（图6F,C），在干旱组中最高（图6E,B），在对照组中处于中间水平（图6D,A；表4）。表4. 线性混合模型测试了LDMC对起源地宏观气候梯度（降雨量）和暴露方向（北 vs. 南）以及处理方式（对照组（c），干旱（d），竞争（cm）的响应结果。Hedypnois rhagadioloides
Brachypodium hybridum

Df, Df res
F
p
Post Hoc
Df, Df res
F
p
Post Hoc

Rain
1, 11.4
14.30
0.00286
1, 13.2
16.31
0.00136

Exposure
1, 250.5
2.14
0.14485
1, 414.1
4.09
0.04386

Treatment
2, 432.6
129.10
d?>?c?>?cm
2, 797.9
47.53
c, d?>?cm

Rain × Exposure
1, 256.8
2.10
0.15751
1, 408.4
2.10
0.14836
Rain × Treatment
2, 440.3
3.60
0.02837
c?>?cm
2, 794.5
5.33
0.00502
c?>?d

Exposure × Treatment
2, 433.1
0.03
0.97387
2, 798.3
0.96
0.38349
Rain × Exposure × Treatment
2, 440.1
0.86
0.42258
2, 794.1
0.13
0.87587

Treatment effects were not uniform across the rainfall gradient, as indicated by significant Rain × Treatment interactions for SLA and LDMC in both species (Tables 3 and 4). Post hoc tests revealed that in the competition treatment compared to control, SLA increased more in mesic than in arid populations in Brachypodium hybridum (Figure 4D,F), and LDMC decreased more in mesic than arid populations in Hedypnois rhagadioloides (Figure 6A,C). In the drought treatment compared to control, SLA decreased more in arid than in mesic populations in Hedypnois rhagadioloides (Figure 5A,B); LDMC increased in arid populations in Brachypodium hybridum (Figure 6D,E). These results suggest that competition-related plasticity toward more acquisitive leaves was stronger in mesic populations, while drought-related plasticity toward more conservative leaves was stronger (for SLA) or exclusively observed (for LDMC) in arid populations.

**Discussion**
4.1 Macroclimatic Trait Divergence and the Prevalence of Acquisitive Strategies in Annual Plants
This study examined how macro (rainfall origin) and microclimatic (exposure aspect) gradients influence two leaf traits—SLA and LDMC—across five annual plant species under common greenhouse conditions, isolating genetic variation among origins. Drought and competition treatments assessed plasticity. Macroclimatic effects and plastic responses were largely consistent among species, whereas microclimatic effects were weak and more species-specific. We detected clear changes across the macroclimatic rainfall gradient: SLA increased with aridity in four of the five species (except Hippocrepis unisiliquosa; Figures 3 and 5), and LDMC decreased in three species (Hedypnois rhagadioloides, Avena sterilis, and Brachypodium hybridum in the second experiment; Figures 4 and 6). These changes persisted in the second generation, confirming their genetic basis. In grass and forb species, more acquisitive leaf traits evolved in drier sites, contrary to global climate models predicting lower SLA and higher LDMC under drought. Annuals in arid environments often favor acquisitive strategies, which may alter their adaptive trajectories.

4.2 Microclimatic Modulation of Leaf Traits: Weak and Species-Specific
Microclimatic variations in SLA and LDMC due to exposure were generally weak and species-specific. In both experiments, exposure effects were often non-significant and dependent on species. In the first experiment, Hippocrepis unisiliquosa showed more conservative, drought-tolerant leaves with lower SLA and higher LDMC in south-facing habitats. In contrast, Hedypnois rhagadioloides and Brachypodium hybridum exhibited opposite responses in the second experiment, possibly due to larger sample sizes and additional treatments. Microclimatic adaptations contributed to their adaptation to different environmental conditions.

4.3 Plasticity and Context-Dependent Trait Shifts
We found strong plastic responses to drought and competition in both species, demonstrating flexibility in leaf trait expression. Drought reduced SLA and increased LDMC, while competition produced the opposite pattern. These responses align with theories suggesting that plants adapt to environmental pressures by adjusting leaf traits. Plasticity varies across environments and depends on genetic and environmental factors.