脑源性神经营养因子Val66met与压力下性别特异性的认知灵活性受损有关：在大鼠模型中的逆向学习搜索策略分析

《Neurobiology of Learning and Memory》：Brain-Derived neurotrophic factor Val66met is associated with sex-specific impairment of cognitive flexibility under stress: A reversal learning search strategy analysis in a rat model

　　米歇尔·科罗内（Michelle Corrone）| 艾米丽·雅恩（Emily Jaehne）| 马特·泽尔科（Matt Zelko）| 凯里·范登布塞（Kerry Fanson）| 布拉德利·J·赖特（Bradley J. Wright）| 马滕·范登布塞（Maarten van den Buuse）
澳大利亚维多利亚州墨尔本拉筹伯大学心理学与公共卫生学院

**摘要**
认知灵活性是一种核心的执行功能，对于适应新信息和调整行为至关重要。脑源性神经营养因子（BDNF）的单核苷酸多态性val66met被认为可以调节认知灵活性，但压力和性别等混杂变量如何影响这种关系仍不清楚。环境丰富化（EE）可能有助于抵御压力带来的负面影响。本研究的目的是测试在压力水迷宫条件下，BDNF val66met是否会影响逆向学习能力——这是认知灵活性的一个关键组成部分。我们使用了Sprague Dawley val66met大鼠模型，将携带val/met基因型的雌性大鼠分别置于低环境丰富化或高环境丰富化的环境中。雌性大鼠及其后代在这些环境中生活直到断奶，之后将后代转移到标准的中等丰富化环境中。成年后的雄性和雌性val/val、val/met以及met/met后代接受了水迷宫逆向学习测试。所有组别都迅速学会了新平台的位置。中介分析表明，val66met与认知灵活性之间的关系是通过空间策略的差异来调节的。序列聚类分析显示，val66met与性别的相互作用导致met/met雄性和val/met雌性的认知灵活性表现较差。环境丰富化并未显著促进认知灵活性。水迷宫测试增加了皮质酮水平，证实了测试的压力性质。本研究强调了在探讨BDNF val66met对认知灵活性影响时考虑压力和性别的必要性。

**1. 引言**
执行功能对日常活动至关重要，并且容易受到身体和环境变化的影响（Gatt等人，2009；Merritt等人，2020；Rogerson等人，2024）。认知灵活性（通过逆向学习或注意力转换来衡量）是一种核心执行功能，负责适应环境中的新信息和规则（Diamond，2013）。神经影像学证据表明，认知灵活性依赖于前额叶皮层的活动及其与皮下结构的连接（Assem等人，2024）。具体来说，抑制前扣带回皮层（ACC）对于忽略无关刺激以建立新规则是必要的（Hajnal等人，2024），而抑制ACC会导致任务转换时的认知灵活性显著下降，但在维持类别规则时则不会（Yildirim等人，2024）。BDNF是一种蛋白质，能与原肌球蛋白受体激酶B（Trk-B）结合，促进神经元增殖和分化（M. Notaras等人，2017；Notaras等人，2015），BDNF的紊乱与执行功能的变化有关（Costa等人，2015；Papaleo等人，2011；Sakata等人，2013；Williams等人，2008）。BDNF与认知灵活性之间的具体关系研究较少，但有证据表明，脑内注射BDNF可以提高认知灵活性（D'Amore等人，2013），而杂合子BDNF小鼠的认知灵活性低于野生型小鼠（Harb等人，2021）。Val66met是BDNF基因的一个单核苷酸多态性，与BDNF信号传导紊乱有关（Notaras等人，2015；Notaras和van den Buuse，2019），单等位基因替换（val/met）会导致BDNF活性依赖性释放平均减少18%，双等位基因替换（met/met）会导致平均减少29%（Chen等人，2006；Egan等人，2003）。Val66met与ACC中的多种神经化学差异相关，例如met携带者（val/met和met/met组合）的N-乙酰天冬氨酸（NAA）和NAA-肌酸比率较高（Gallinat等人，2010；Scotti-Muzzi等人，2023）。此外，met携带者在面对恐惧刺激时ACC过度激活，且ACC与海马体的功能连接减弱（Mukherjee等人，2011）。尽管存在这些与val66met相关的差异，但关于val66met与认知灵活性之间关系的证据尚不明确。在健康人群和临床人群中，有大量证据支持携带met等位基因具有积极影响，如更快的或更准确的认知灵活性（Bolat等人，2022；Boots等人，2017；Brooks等人，2014；Erickson等人，2008；Nikola?evi?等人，2022；Rybakowski等人，2003；Tramontina等人，2009；Tükel等人，2012）。然而，也有一些证据表明其具有负面影响（Gabrys等人，2019；Marqués-Iturria等人，2014；Nagel等人，2008），还有一些研究未发现val66met与认知灵活性之间的关联（Cerasa等人，2010；Egan等人，2003；Erickson等人，2013；Gajewski等人，2011；Gatt等人，2009；Gong等人，2009；Jiang等人，2018；Kim等人，2016；Treble-Barna等人，2023；Ward等人，2015）。可能需要结合其他因素（如压力、认知负荷和情绪状态）来研究val66met对认知灵活性的影响，因为这些因素可能会影响研究结果。

压力被认为会干扰执行功能，因为前额叶皮层中含有高水平的糖皮质激素受体（Patel等人，2000；Perlman等人，2007）。大多数研究表明，经历压力或童年虐待后认知灵活性会下降（Paredes等人，2022；Prunell-Casta?é等人，2024；Yanzeng等人，2024）。压力暴露与ACC的变化有关，如活动减少（Lewis等人，2024）以及糖皮质激素和Trk-B受体表达增加（Azogu & Plamondon，2017）。糖皮质激素直接和间接影响BDNF的信号传导和表达（Gourley等人，2009；Jeanneteau等人，2008；Smith等人，1995）。反过来，BDNF通过调节促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）基因表达来调节应激反应（Jeanneteau等人，2012）。Trk-B的激活可以防止压力引起的执行功能缺陷（Barfield & Gourley，2017），而Trk-B的拮抗作用则会损害压力后的皮质可塑性（Arango-Lievano等人，2015）。有证据表明val66met可能调节压力与ACC功能之间的关系，但具体方向尚不清楚（Gerritsen等人，2012；van Velzen等人，2016）。唯一关于val66met、认知灵活性和压力之间直接关系的证据表明，童年创伤频率较高与met携带者的认知灵活性较差有关，而与val/val携带者无关（Gabrys等人，2017）。因此，压力可能是val66met与认知灵活性之间关系的混杂因素。

在考虑压力时，分析性别差异和性激素的作用也很重要（Acevedo-Rodriguez等人，2018）。尽管在主观压力评分中性别差异可能不明显，但背内侧和腹内侧PFC以及海马体在应对压力时的活动存在差异（Goldfarb等人，2019）。先前的研究还表明，val66met与认知灵活性之间的关系可能具有性别特异性（Islas-Preciado等人，2023；Kim等人，2016）。由于前额叶活动对认知灵活性很重要，而海马体活动对空间认知很重要，且本研究使用空间任务进行认知测试，因此将性别作为独立变量纳入研究。

最后，为了建立val66met、认知灵活性和压力之间的关系，本研究还使用了环境丰富化（EE）作为保护认知灵活性免受压力影响的手段。环境复杂度可以作为社会经济地位（SES）的模型，因为低SES通常意味着家庭和学校的丰富化程度较低，而高SES家庭则可能在家庭和学校环境中提供更多丰富化措施（Christensen等人，2014；Crosnoe等人，2010）。高丰富化环境与更好的执行功能相关（Aykan等人，2024；Martínez-Canabal等人，2023；Terrier等人，2024）。此外，EE已被证明可以减轻压力，这通过生理和心理指标得到证实（Ismail等人，2024；Raymond等人，2024；Segovia等人，2008），这可以解释为什么EE似乎能保护执行功能免受压力引起的缺陷（Ismail等人，2024；Menezes等人，2020；Segovia等人，2008）。有证据表明EE与BDNF功能的多项变化有关，如前额叶皮层中BDNF mRNA和成熟BDNF水平降低，以及Trk-B减少（Aldhshan & Mizuno，2022）。EE还与压力下海马体BDNF表达增加有关（Ismail等人，2024），并可以逆转母体分离引起的海马体BDNF蛋白水平下降。最后，EE已被证明可以恢复与BDNF杂合性相关的认知灵活性缺陷（Harb等人，2021）。因此，EE可能是保护认知灵活性免受压力挑战的合适手段，尤其是对于met携带者。

在这里，我们使用水迷宫逆向学习协议（Vorhees & Williams，2006）在压力条件下测量认知灵活性。水迷宫测试会引发应激反应，因为它与测试后ACTH和皮质酮水平升高有关（Engelmann等人，2006）。由于该水迷宫协议是一种空间认知灵活性测量方法，因此需要考虑val66met与海马体的多种差异，包括异常的双侧激活（Egan等人，2003；Jasińska等人，2016；Wang等人，2012；Wei等人，2012）、神经元存活率和细胞内代谢（Gallinat等人，2010）、与ACC的功能连接（Mukherjee等人，2011；Yin等人，2015）、形态学（Bird等人，2020；Jasińska等人，2017）、Trk-B受体表达（M. Notaras等人，2017）以及神经元密度（Hill等人，2020）。因此，val66met与空间导航能力有关，尽管既有正面影响（Gong等人，2009；West等人，2021），也有负面影响（Laczó等人，2020；Wang等人，2014）的报道。鉴于val66met基因型之间的空间导航能力差异可能影响逆向学习表现，我们评估了测试过程中使用的空间策略。

本研究的目的是更好地理解BDNF在认知灵活性中的作用。具体来说，我们评估了val66met在压力条件下对逆向学习的潜在调节作用，并考虑了性别差异。我们还希望通过在产前和新生儿期使用EE来促进认知韧性。我们分析了粪便中的皮质酮代谢物（FCM），以确保水迷宫程序引发了应激反应，并确定EE是否降低了皮质酮水平（Fanson等人，2017；Touma等人，2004）。研究结果强调了在探讨val66met与认知灵活性关系时考虑压力和性别的必要性。

**2. 方法**
**2.1. 动物**
我们使用了携带val68met基因型的Sprague Dawley雄性和雌性大鼠，这是一种已建立的BDNF val66met变异体大鼠模型（Jaehne等人，2022；Mercado等人，2021）。这些大鼠来自位于西澳大利亚珀斯的Animal Resources Centre的繁殖群体。在标准单独通风笼（IVC；补充表1）中适应一周后，每晚将雌性大鼠与同一雄性大鼠配对，最多持续4晚。每天早上检查大鼠及其笼子是否有交配栓，并将雌性大鼠放入实验笼中。如果发现交配栓，则立即将其放入实验笼中。雌性大鼠在整个妊娠期和新生儿期都留在实验笼中，直到断奶。如果四天的交配期后未发现交配栓，则将雌性大鼠移至实验笼中，只有在确认未怀孕的情况下才将其从研究中移除。后代大鼠与雌性大鼠和同窝幼崽一起在实验环境中饲养，直到PND21日断奶（图1）。我们共生成了28窝后代，每窝数量在9到19只之间。实验组之间的平均窝数没有差异，且每组每基因型最多使用2只幼崽。PND14日时，对后代大鼠进行耳剪标记，并由Transnetyx（美国田纳西州）进行基因型鉴定（Jaehne等人，2022；Mercado等人，2021；见表1）。断奶后，后代大鼠被转移到标准IVC环境中（补充表1）。整个实验期间提供标准大鼠饲料颗粒和水。每周测量体重（见表1中的3周和7周龄数据）。大鼠被安置在一个气候控制室中，室内温度保持在22±2°C，湿度为40±15%，光照周期为12小时亮12小时暗。所有实验程序均获得了拉筹伯动物伦理委员会（AEC20006）的批准。下载：下载高分辨率图像（216KB）下载：下载全尺寸图像

图1. 实验时间线。母鼠和后代分别被安置在低丰富度或高丰富度的环境中。断奶后，后代被转移到标准的IVC笼子中。时间线以周为单位显示，代表母鼠的年龄；相反，以产后天数（PND）显示的代表后代的年龄。

表1. 3周龄和7周龄大鼠的体重，按笼子条件、性别和基因型划分。括号中的数字分别表示在水迷宫测试前后分析的粪便样本中皮质酮代谢物的数量。

| 笼子条件 | 性别 | 基因型 | 3周龄 | 7周龄 |
|---------|------|------|------|------|
| 低丰富度 | 雄性 | Val/val | 52±3 | 272±15 | 7 (4.3) |
| | Val/met | 55±3 | 280±8 | 10 (8.7) |
| | Met/met | 57±4 | 297±14 | 9 (8.5) |
| 高丰富度 | 雄性 | Val/val | 61±3* | 310±9* | 8 (6.6) |
| | Val/met | 61±4 | 318±11* | 11 (6.6) |
| | Met/met | 56±4 | 309±12 | 7 (3.4) |
| | 雌性 | Val/val | 61±2* | 232±6* | 8 (7.7) |
| | Val/met | 59±2 | 215±7* | 11 (8.8) |
| | Met/met | 57±4 | 203±9 | 7 (3.4) |

* = 根据ANOVA分析，与低丰富度大鼠相比差异显著（p<0.05）。更多比较见第3.1.2节。

2.3. 住房条件
在怀孕和新生儿期，母鼠和后代被安置在低丰富度（LE）或高丰富度（HE）环境中（见补充图1）。低丰富度环境是较小的单层开放式笼子，而高丰富度环境是较大的双层IVC笼子。低丰富度笼子仅提供标准碎纸作为装饰材料，而高丰富度笼子还配备了额外的玩具，如木制梯子、鸟类玩具、天然纤维球等，并通过添加葵花籽来丰富饮食（详见补充表1）。当使用天然纤维球时，会在球中加入葵花籽以鼓励大鼠觅食。为了增加新鲜感，每个笼子每周更换两次装饰材料。

2.4. 水迷宫逆转学习
大鼠在产后第56天左右（图1）进行了行为测试，这相当于人类的青春期/成年早期（Sengupta, 2013）。选择这个年龄是为了与我们其他研究中的青少年/成年早期参与者相对应（Corrone et al., 2021; 2023）。通过逆转学习水迷宫协议（Webster et al., 2015）评估大鼠在压力下的认知灵活性。由于没有不会引起压力反应的水迷宫实验设计，因此本研究无法设置“无压力”对照组；此外，我们的研究重点是比较不同基因型和饲养环境下的差异。各组动物数量见表1。

一个直径为150厘米的泳池中装有温水（28±2°C），放置在房间中央。房间的每面墙上都有一个大的标记，帮助大鼠进行空间定位。水中加入了无毒的黑色颜料以增加水与白色大鼠之间的对比度。一个直径为10厘米的透明亚克力平台，表面贴有防滑胶带，放置在水面下2厘米处。该平台被放置在迷宫的四个象限之一：NW、SW、SE、NE。每个大鼠的位置都是伪随机分配的，以确保数据中没有空间偏差。

第一天，大鼠进行了10次学习试验，每次试验之间间隔10分钟。大鼠被放入水中，面对泳池墙壁。它们的起始位置可以是泳池周围的任何位置：N、NE、E、SE、S、SW、W或NW。每次试验的位置都是伪随机分配的，以避免空间偏差。但是，平台周围的位置被排除在外，例如如果平台位于NE象限，大鼠就不会从N、NE或E位置开始试验。大鼠有60秒的时间来找到平台。如果大鼠在60秒内找到了平台，试验就结束，并将大鼠取出来擦干。如果大鼠在60秒内没有找到平台，实验者会进入房间用手引导大鼠找到平台。大鼠在平台上停留15秒以观察周围环境。如果大鼠在观察过程中掉下平台，计时器会停止，并在计时器重新开始前将大鼠放回平台上。每次试验结束后，大鼠会被用毛巾擦干，并与笼子里的同伴一起转移到保暖垫上的笼子里。在开始下一次试验之前，会撇去水中的粪便和杂物。只有那些在10次试验结束后能够独立找到平台的大鼠才会被纳入逆转学习试验，没有大鼠因这一标准而被排除。

第二天，大鼠进行了10次逆转学习试验。这些试验遵循与学习试验相同的协议，只是平台的位置被移到了相反的象限。例如，如果学习试验中平台位于NE象限，那么在逆转学习试验中平台就会移到SW象限。

大鼠的游泳路径通过Noldus Ethovision 11软件记录和追踪。然而，由于水面的反光，追踪数据不可靠，因此使用Tracker v.6.0.10（Brown, 2008）软件手动编码路径。Tracker是一款开源物理软件，允许用户通过选择视频中的每个帧来追踪物体的移动（ww.physlets.org/tracker）。追踪环境经过校准，以准确显示点之间的距离。所有逆转学习试验中，大鼠的鼻尖位置每秒被追踪5帧，XY坐标被导出用于进一步分析。总游动距离、到达平台的潜伏时间以及在目标象限和学习象限所花费的时间在R语言中计算（R Core团队, 2021）。

2.5. 搜索策略分析
为了识别每次试验中使用的搜索策略，我们在MATLAB R2022b中构建了一个算法（补充材料1），该算法使用XY坐标来计算标准并分类游泳路径（Curdt et al., 2022, Garthe et al., 2009, Gehring et al., 2015, Graziano et al., 2003, Pereira and Burwell, 2015, Rogers et al., 2017）。路径被分为八种潜在的搜索策略（图2）：直接游动、焦点搜索、定向搜索、自我定位、链式搜索、扫描、坚持性、触觉趋向性和随机搜索。分类按照图2A中概述的顺序进行，先评估更具体的策略，再评估不太具体的策略。例如，首先检查直接游动的标准，如果路径不符合这些标准，再检查焦点搜索的标准，依此类推，直到确定搜索策略。如果无法确定搜索策略，则将路径归类为“未识别的策略”。

图2. 水迷宫逆转学习中的搜索策略。StU = 标准单位，等于泳池的半径，即75厘米。A) 策略标准、分类顺序和示例游泳路径。B) 示例游泳路径中的标注区域。C) 目标走廊和起始区域的表示。目标走廊的内角为45°。D) 路径质心的计算方法。

直接游动定义为大鼠从起点直接游向平台。焦点搜索与直接游动不同，是指大鼠在找到平台之前在关键区域内绕平台游动。定向搜索定义为大鼠朝平台的大致方向游动，并且大部分时间都在目标走廊内（图2C）。自我定位有两种定义方式：首先，大鼠进入关键区域但未找到平台，然后游向起始区域或中心区域，再重新定向到平台；或者，自我定位可以定义为大鼠在直接游向平台之前先在起点附近停留以进行定位。链式搜索发生在大鼠以大致正确的距离靠近墙壁但未能找到平台时，而是在环形区域内花费大部分测试时间（图2B）。扫描发生在大鼠在池中心停留较长时间后游向平台。我们认为这段时间用于观察视觉线索以帮助定位。坚持性发生在大鼠直接游向学习平台的位置并搜索其附近区域时。这种策略表明认知灵活性存在坚持性错误，表明之前学习的平台位置产生了干扰（Garthe et al., 2009）。触觉趋向性发生在大鼠主要沿着池壁游动，偶尔稍作偏离以找到平台时。这种行为通常被解释为类似焦虑的行为（Garthe et al., 2009）。随机搜索发生在游泳模式无法区分不同区域时。

为了控制val66met基因型之间的空间导航差异（Gong et al., 2009, West et al., 2021），这些搜索策略进一步被分为空间策略和非空间策略。空间策略包括直接游动、焦点搜索、定向搜索、自我定位和扫描。非空间策略包括链式搜索、坚持性、触觉趋向性和随机搜索（Curdt et al., 2022, Garthe et al., 2009, Gehring et al., 2015, Graziano et al., 2003, Pereira and Burwell, 2015, Rogers et al., 2017）。

2.6. 粪便皮质酮分析
粪便样本（表1）在行为测试前一周（基线；第7周）收集，并在水迷宫逆转学习协议完成后约24小时（测试后；第8周）收集。样本大约在上午11点收集，并放入1.5毫升的微量离心管中，置于干冰上。样本随后储存在-80°C的冷冻柜中直至提取。

提取时，样本解冻、称重并匀浆，将0.1±0.01克的湿样本分装到1.5毫升的微量离心管中。离心后，样本悬浮在1毫升的80%乙醇中，并在平台上过夜（Palme et al., 2013）。第二天，样本在5000 RCF下离心5分钟，上清液倒入另一个试管中。提取的样本在-20°C下储存1-3个月，然后进行检测。

粪便皮质酮代谢物（FCM）的检测使用了一种针对11-oxoetiocholanolone-3-HS的抗体（抗体和相应的生物素标记激素来自奥地利维也纳兽医大学，实验室代码37e（Fanson et al., 2017））。该检测方法之前已在小鼠（Touma et al., 2004）和Sprague Dawley大鼠（Bamberg et al., 2001）中得到验证。所有样本都进行了重复检测，数据以ng/g湿重表示。低质量和高质量样本的批内CV分别为10.34%和12.07%（N=13个样本）。批内CV分别为13.41%和48.43%（N=17个样本）。检测程序遵循之前描述的方法（Fanson et al., 2017, Touma et al., 2004）。平板上涂有山羊抗兔免疫球蛋白G（GARG）。标准品（50 μl）和样本（50 μl）在4°C下与酶标记物（50 μl）和抗体（50 μl）一起在轨道摇床中孵育过夜。孵育后，平板被清洗并吹干。每个孔中加入链霉亲和素过氧化物酶结合物（Roche，产品代码11089153001），然后在轨道摇床上45分钟孵育。平板手动清洗一次，并在自动平板清洗机中清洗四次。每个孔中加入150 μl的四甲基苯二胺溶液（Sigma-Aldrich，产品代码87748），在室温下孵育1.5小时。然后使用硫酸溶液停止酶反应。立即在450 nm波长下使用吸光度计（BMG LABTECH的SPECTROstar Nano）测量吸光度。

2.6. 统计分析
数据使用z分数评估异常值，没有值超过平均值的3个标准差。多变量异常值使用Mahalanobis距离进行评估，但未发现异常值。正态性使用Kolmogorov-Smirnov检验进行评估。多重共线性使用Pearson相关性和方差膨胀因子进行评估。最后，通过将标准化残差与预测值绘制并拟合loess线来评估同方差性和线性。所有FCM数据都进行了对数转换以满足线性的假设，但报告的是未调整的平均值和标准误差。部分eta平方（partial eta squared）表示效应的大小，其中ηp2 = 0.01表示小效应，ηp2 = 0.06表示中等效应，ηp2 = 0.14表示大效应（Richardson，2011）。体重数据通过重复测量的方差分析（ANOVA）进行了分析。为了确保基因型、性别或环境条件在获取学习方面没有差异，进行了调整队列的回归分析，以研究到达平台的潜伏期（见补充表2和补充图2）。由于在反转试验期间，到达平台的潜伏期、总行驶距离和在获取象限中花费的时间高度相关（通过线性回归评估；数据未显示），因此仅保留总行驶距离以减少多重共线性。然后测试了总行驶距离、空间策略的使用和坚持尝试次数与基因型、环境丰富度（EE）和性别的关联（表2）。

表2. 独立组之间、反转学习表现和粪便皮质酮代谢物（FCM）水平之间的相关性。

空单元格
条件 性别 预测试体重 队列 总距离 潜伏期 获取持续时间 反转持续时间 空间策略 坚持尝试次数 预FCM 后FCM
基因型 -0.04 -0.01 0.02 0.04 -0.08 -0.09 -0.07 -0.07 0.22* -0.16 0.05 -0.07
条件 ---------- 0.05 0.20* -0.02 -0.21* -0.22* -0.22* -0.18 0.10 -0.07 -0.29* -0.21
性别 --------- ---------- -0.83** 0.00 0.19 0.14 0.23* 0.00 -0.16 0.01 -0.56** -0.36**
预测试体重 --------- ---------- ---------- -0.25* -0.23* -0.18 -0.29** -0.04 0.17 -0.05 0.46** 0.32*
队列 --------- ---------- ---------- ---------- -0.32** 0.29** 0.23* 0.29** -0.31** 0.03 -0.22 -0.05

总距离 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ 0.94** 0.89** 0.78** -0.77** 0.18 -0.24* 0.17
潜伏期 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- 0.90** 0.84** -0.76** 0.23* -0.22 0.16
获取持续时间 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- ----------------- 0.64** -0.73** 0.24* -0.24* 0.12
反转持续时间 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- ----------------- ------------- -0.55** 0.01 -0.16 0.05
空间策略 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- ----------------- ------------- -------------- -0.30** 0.27* -0.28*
坚持尝试次数 --------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- ----------------- ------------- -------------- ---------- 0.01 0.12

预FCM ---------- ---------- ---------- ---------- ------------ ---------- ----------------- ------------- -------------- ---------- ---------- 0.44
*** = p < 0.05, ** = p < 0.01
预测试体重 = 水迷宫反转学习前的体重；预FCM/后FCM = 水迷宫反转学习前后的粪便皮质酮代谢物水平；坚持尝试次数 = 坚持尝试的次数
基因型：val/val = 1，val/met = 2，met/met = 3；条件：对照 = 1，富集 = 2；性别：雄性 = 1，雌性 = 2

为了探究基因型、水迷宫反转学习前的FCM水平、坚持尝试次数和空间策略使用之间的关系，使用了PROCESS宏和自助法（N = 5000次重采样）进行了中介分析（Coutts和Hayes，2023；Hayes和Preacher，2014）。最后，使用R中的TraMineR序列分析（Gabadinho等人，2011）比较了每次反转学习中使用的搜索策略序列。层次聚类用于确定数据集中的最佳类别数量（见补充图3），这些类别被确定为低灵活性和高灵活性的指标（见图7）。然后将独立变量（基因型、条件和性别）回归到这些类别上，以确定哪些组更可能属于每个类别。

3. 结果
3.1. 数据管理和初步分析
正如预期的那样，体重（表1）随年龄增长而增加 [F(1,89) = 6263.5, p < 0.001, ηp2 = 0.986]，并且雄性比雌性更重 [性别的主效应，F(1,89) = 189.2, p < 0.001, ηp2 = 0.989；性别×年龄的交互作用，F(1,89) = 343.5, p < 0.001, ηp2 = 0.794]。在HE环境中饲养的大鼠比在LE环境中饲养的大鼠体重更高 [条件的主效应，F(1,89) = 23.2, p < 0.001, ηp2 = 0.206；条件×年龄的交互作用，F(1,89) = 17.8, p < 0.001, ηp2 = 0.167]。这似乎与基因型有关 [年龄×条件的交互作用，F(2,89) = 3.63, p = 0.030, ηp2 = 0.075；年龄×基因型×条件的交互作用，F(2,89) = 3.29, p = 0.042, ηp2 = 0.69]。因此，进一步的ANOVA按年龄和基因型进行了分组。与LE条件相比，在7周龄时，HE条件下饲养的Val/val大鼠和Val/met大鼠的体重显著更高；在3周龄时，Val/val大鼠的体重更高（详细信息未显示，见表1）。

为了评估线性回归的适用性并探索关键变量之间的关系，对独立变量（基因型、条件、性别、队列和预测试体重）、标准水迷宫指标（总行驶距离、到达平台的平均潜伏期、在获取象限中平均花费的时间、在反转象限中平均花费的时间）、空间策略使用的频率、坚持尝试的频率以及所有时间点的FCM浓度进行了皮尔逊相关性分析（表2）。虽然满足了多重共线性的假设，但发现了队列之间的差异，因此将队列添加到回归模型中以校正协方差。

水迷宫反转学习前的FCM（Pre-FCM）与总行驶距离相关（r = -0.24, p = 0.050），并与空间策略的使用呈正相关（r = 0.27, p = 0.026）。然而，水迷宫后的FCM与空间策略的使用呈负相关（r = -0.28, p = 0.030）。也就是说，在MWM测试前一周较高的FCM浓度与使用更多的空间策略相关，而更多的空间策略使用又与测试后24小时的较低FCM浓度相关。此外，空间策略的使用与坚持尝试的次数相关（r = -0.30, p = 0.003）。最后，为了确保MWM在压力下测量认知能力，配对样本t检验确认MWM与HPA活动的变化相关，因为FCM浓度在测试后（3075.0 ± 283.9）高于测试前（2367.0 ± 240.8），t(48) = -2.76, p = 0.008。

3.2. 反转学习总表现取决于基因型、性别和饲养条件
为了确定10次试验中的总反转学习表现是否与基因型或环境条件相关，使用了独立组（基因型、条件和性别）并考虑了队列和预测试体重进行了三次线性回归。总反转学习表现通过总行驶距离、使用的空间策略比例和坚持尝试的次数来衡量（表3）。

表3. 水迷宫总行驶距离、使用的空间策略频率和反转学习期间坚持尝试次数的线性回归模型。
预测因子 总行驶距离 空单元格 空单元格 空间策略 空单元格 坚持尝试次数 空单元格 β rsrp 空单元格 β rsrp 空单元格 β rsrp
基因型 -0.10 -0.08 -0.10 0.26 10.23 0.22 0.23 0.014 -0.09 -0.16 -0.09 0.370
条件 -0.22 -0.21 -0.22 0.019 0.11 0.10 0.11 0.219 -0.04 -0.07 -0.04 0.689
性别 0.21 0.19 0.21 0.024 -0.16 -0.16 -0.16 0.082 -0.03 0.01 -0.03 0.736
队列 0.33 0.32 0.33 <0.001 -0.32 -0.31 -0.32 <0.001 -0.06 0.03 -0.06 0.544
基线体重 0.33 -0.23 0.15 0.113 - - - - - - - -
空间策略 - - - - - - - - - -0.30 -0.30 -0.27 0.007

性别：雄性 = 1，雌性 = 2；基因型：val/val = 1，val/met = 2，met/met = 3；条件：低富集 = 1，高富集 = 2
总行驶距离模型：R2 = 0.20, F(4,95) = 5.98, p < 0.001；总空间策略模型：R2 = 0.14, F(4,96) = 0.43, p = 0.001；总坚持模型：R2 = 0.10, F(5,95) = 2.17, p = 0.064

3.2.1. Val66met与总行驶距离无关
产前/新生儿环境丰富度（Prenatal/neonatal EE）是总行驶距离的最强预测因子（β = -0.22, p = 0.019；图3），其次是性别（β = 0.21, p = 0.024）。具体来说，HE环境（平均值±标准误差 = 4753.5 ± 233.2）下的总行驶距离比LE环境（平均值±标准误差 = 5577.1 ± 328.2）少，雄性（平均值±标准误差 = 4768.7 ± 243.4）的行驶距离比雌性（平均值±标准误差 = 5543.5 ± 317.6）少。基因型不是总行驶距离的显著预测因子（p = 0.261；表3）。

下载：下载高分辨率图像（73KB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 不同环境丰富度下的总行驶距离（单位：厘米）。误差条代表标准误差。LE = 低富集，HE = 高富集。* = p < 0.05。
下载：下载高分辨率图像（63KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 基因型、水迷宫反转学习前的FCM、空间策略使用和坚持尝试之间的中介分析。FCM = 粪便皮质酮代谢物。

3.2.2. Met/met大鼠与最高的空间策略使用率相关
基因型是空间策略使用的最佳预测因子（β = 0.23, p = 0.014）。使用Fisher的LSD进行的事后检验表明，met/met大鼠使用的空间策略比例高于val/val大鼠（平均值±标准误差 = 76.61 ± 3.87；图5），但val/met大鼠（平均值±标准误差 = 66.26 ± 3.44）与val/val大鼠（p = 0.683）或met/met大鼠（p = 0.057）之间没有差异。EE（p = 0.219）和性别（p = 0.082）都不是空间策略使用的预测因子（表3）。

下载：下载高分辨率图像（156KB）
下载：下载全尺寸图像
图5. 10次试验中每种基因型的空间策略和坚持尝试频率。序列之间的差异显著（R2 = 0.03, p = 0.033），详见补充图5了解每种基因型的完整模态状态序列。

3.2.3. Val66met与坚持尝试次数无关
空间策略的使用预测了坚持程度，更多的空间策略与较少的坚持尝试次数相关（r = -0.30, p = 0.007）。基因型、EE和性别都不是显著预测因子（基因型：p = 0.370；EE：p = 0.689；性别：p = 0.736）（表3）。

3.2.4. Val66met与压力下的认知灵活性之间的关系通过空间策略的使用进行中介
鉴于基因型、水迷宫反转学习前的FCM、空间策略使用和坚持尝试之间的关联，进行了中介分析，以确定空间策略的使用是否中介了其他因素之间的关系（图4）。研究发现，基因型（B = 6.31, p = 0.030）和预测试FCM（B = 15.57, p = 0.026）与坚持尝试之间的关系是通过空间策略的使用进行中介的（B = -0.018, p = 0.004）。空间策略的使用是双向的，坚持尝试也预测了空间策略的使用（B = -5.26, p = 0.006）。然而，没有发现基因型和预测试FCM与坚持尝试之间的直接关系，也没有发现基因型和预测试FCM之间的交互作用。

3.3. 通过策略序列测量反转学习
在测试过程中，观察到大鼠通常在最初的几次试验中就学会了平台的反转位置。这一观察结果，加上传统的水迷宫反转学习测量方法可能无法最好地衡量认知表现的证据（Gehring等人，2015；Lindner，1997），促使了对搜索策略进行了序列分析。

3.3.1. 策略选择的变化率在最初的几次试验中最高
为了确认大鼠是通过序列搜索策略学会平台的反转位置的，我们建立了每种搜索策略之间的转换可能性（补充表3）以及所有大鼠每次试验中搜索策略的频率（补充图4A）。典型的搜索策略序列是通过选择每次试验中最常用的策略计算得出的（补充图4B）。这些发现共同表明，大鼠通常首先使用触觉导航，然后转换为自我定向，最后在整个试验过程中采用直接游泳。此外，熵趋势线显示，第二和第三次试验的变化率最高，随后在其余试验中变化率下降。这表明在非空间策略和空间策略之间的转换期间，大鼠在搜索行为序列上差异最大。

3.3.2. Val/met大鼠表现出最高的坚持程度
为了确定策略选择的变化是否在基因型、条件和性别之间有所不同，分析了序列之间的差异。发现10次试验中的序列在基因型之间有所不同（补充图5；R2 = 0.03, p = 0.033），但在条件或性别之间没有差异，val/met大鼠在转换为空间策略之前表现出更强的坚持倾向。此外，还发现了基因型与性别的交互作用效应（R2 = 0.03, p = 0.020）。雄性val/val大鼠从触觉导航转换为直接游泳所需的试验次数最少（补充图6），而雄性val/met大鼠的坚持程度最高（图6）。

下载：下载高分辨率图像（271KB）
下载：下载全尺寸图像
图6. 10次试验中不同基因型和性别的空间策略（上排）和坚持尝试（下排）的频率，R2 = 0.03, p = 0.02。详见补充图6了解每种基因型按性别的完整模态状态序列。

3.3.3. Val66met与性别之间的交互作用预测了灵活性聚类
为了进一步验证我们的发现，采用了数据驱动的方法来确定聚类模式。使用层次聚类确定了最佳聚类数量（N = 2）（补充图3），并将数据围绕每个聚类中最中心的点（质心）进行划分。由于第一个聚类中坚持尝试的频率很高，第二个聚类中直接从触觉导航转换为直接游泳，这些聚类分别被标记为“低灵活性”和“高灵活性”（图7）。

下载：下载高分辨率图像（108KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. 10次试验中低灵活性和高灵活性聚类的搜索策略模态状态序列。

为了确定独立组之间的聚类成员可能性，将基因型、条件和性别以及基因型与性别的交互作用回归到聚类上（表4）。虽然独立组之间的聚类成员可能性相同，但性别之间的基因型模式不同。在雄性中，met/met大鼠比val/val大鼠更有可能是低灵活性聚类的成员（OR(95% CI) = 2.87(1.01, 8.14), p = 0.047），而val/met大鼠与val/val大鼠的可能性相同。相反，在雌性中，val/met大鼠比val/val大鼠更有可能是低灵活性聚类的成员（OR(95% CI) = 2.74(1.00, 7.51), p = 0.05），而met/met大鼠与val/val大鼠的可能性相同。

表4. 独立组与性别之间的聚类成员可能性及基因型与性别的交互作用。
特征 比值 95%置信区间
基因型与val/val相比 0.89 0.40, 1.96
Val/met 1.30 0.47, 3.62
性别与雄性相比 0.63 0.28, 1.42
条件与LE相比 0.96 0.39, 2.45
性别与基因型与雄性val/val相比 0.38 0.14, 1.03
性别与基因型与雌性val/val相比 0.38 0.14, 1.03
性别与基因型与雌性val/val相比 0.74 1.00, 7.51
性别与基因型与雌性val/val相比 0.53 0.19, 1.49

4. 讨论
我们的目标是研究val66met、压力和认知灵活性之间的关系。主要发现是，val66met基因型在压力下的水迷宫反转学习条件下与认知灵活性有直接和间接的关系。中介分析表明，val66met与认知灵活性之间的关系是通过空间策略的使用进行中介的。搜索策略的序列分析表明，val66met与性别的交互作用预测了认知灵活性表现，表明met/met雄性和val/met雌性的灵活性较低。我们还旨在通过早期生活环境丰富度（EE）来促进压力韧性。尽管环境条件可以预测水迷宫反转试验的表现，但这种关系并未得到序列分析或聚类的支持。

4.1. Val66met对压力下认知灵活性的影响是通过空间策略的使用进行中介的
中介分析表明，基因型可以预测反转试验中寻找隐藏平台时空间策略的使用。与其它基因型相比，met/met携带者更依赖于空间策略。这些发现支持了先前的研究结果，即在健康年轻人中，met/met携带者的空间定向能力优于val/met和val/val携带者（Gong等人，2009年），而在健康老年人中，met携带者比val/val携带者更依赖自我中心导航（West等人，2021年）。更频繁地使用空间策略可以预测更少的坚持错误。空间策略被认为是最有效的搜索策略类型（Rogers等人，2017年），因此使用空间策略能够在基于空间导航的任务中带来更好的表现并不令人惊讶。然而，由于坚持性是结果指标而非总的水迷宫表现，这些结果特别表明val66met基因在认知灵活性中起着重要作用。中介分析还显示了空间策略使用与坚持性之间的双向关系，即更多的坚持错误预示着在寻找反向平台位置时对空间策略的依赖减少。鉴于状态转换反映了非空间策略和空间策略之间的早期切换，这种关系可能表明更有效的反向学习允许更快地在非空间策略和空间策略之间切换。

4.2. val66met基因在压力下的认知灵活性作用具有基因型和性别特异性
对整个水迷宫反向任务序列的顺序分析显示，val66met基因对搜索策略序列有直接影响，val/met大鼠由于坚持性试验的频率较高和空间策略使用的频率较低，因此采用了最无效的序列。这种效应是由val/met雄性大鼠比雌性和val/val及met/met雄性大鼠更倾向于使用最无效的序列所驱动的。此外，层次聚类确定了数据中的低灵活性和高灵活性群体，其成员资格由基因型和性别的交互作用决定。低灵活性群体中更有可能包含met/met雄性和val/met雌性。met/met雌性中没有效应与先前的研究结果一致，这些研究表明val66met多态性可能不遵循严格的基因等位基因剂量关系。例如，我们发现具有val/met基因型的val66met小鼠表现出较弱的预脉冲抑制和对应激激素皮质酮的更高敏感性，而met/met小鼠则没有变化（M. J. Notaras等人，2017年）。在一项关于EEG阿尔法功率的研究中，val/met个体的阿尔法峰值频率低于val/val个体，但met/met个体没有显著变化（Privodnova & Volf，2023年）。这些发现表明，在研究中区分val/met和met/met基因型非常重要，而不是将它们合并（Tsai，2018年；Yang等人，2012年）。如前所述（M. J. Notaras等人，2017年），与val/met基因型相比，met/met基因型相关的活动依赖性BDNF释放减少可能会触发尚未明确的补偿机制，使得这一组在功能上与val/val基因型无法区分。少数研究考察了val66met基因对认知灵活性的性别特异性效应，现有证据表明这种效应在女性中比在男性中更强（Islas-Preciado等人，2023年；Kim等人，2016年）。Kim等人（2016年）发现，女性met/met携带者完成认知灵活性任务的速度比女性val携带者快，而Islas-Preciado等人（2023年）发现女性val/val携带者的认知灵活性优于男性val/val携带者。此外，met/met基因型携带者的认知灵活性较差，且这种效应在女性中比在男性中更明显（Islas-Preciado等人，2023年）。关键的是，我们的研究发现了与这两项研究相反的性别特异性效应。我们的结果可能与以往的研究不同，因为我们是在压力水迷宫条件下测试认知灵活性的，而以往的研究在其分析中没有包括压力操作或压力生物标志物，尽管已知性别在压力反应上存在差异（Acevedo-Rodriguez等人，2018年；Goldfarb等人，2019年）。女性met/met携带者与男性met/met携带者相比没有效应可能是由于压力下海马体、边缘系统和前额叶皮层活动的性别差异。具体来说，女性表现出vmPFC活动与压力调节之间的正相关，以及dmPFC活动与压力反应性之间的正相关。相比之下，男性在这些关系中表现出负相关（Goldfarb等人，2019年）。此外，Islas-Preciado等人（2023年）发现基因型与性别对执行功能有影响，女性在反向学习任务中的表现差异大于男性，而在val/met携带者中没有明显差异。这些基因型与性别的交互作用可能与类固醇激素水平的差异有关，因为无论性别如何，val/val小鼠的血浆雌二醇水平都高于met/met小鼠，而且血浆DHEA与女性val/val小鼠的认知灵活性高度相关，但与其他基因型或男性无关（Islas-Preciado等人，2023年）。因此，类固醇激素活性、BDNF活性和压力反应性之间的微妙交互作用可能是压力下认知灵活性中基因型与性别差异的基础。未来的val66met研究应考虑性别和压力在认知灵活性关系中的作用。

4.3. 早期生活丰富化并不是压力韧性的强促进因素
虽然产前/新生儿期暴露于高环境（HE）可以预测更好的总水迷宫反向学习表现，但它并不能预测坚持性，这种效应也没有通过搜索策略的顺序分析得到支持。标准的水迷宫反向学习指标（如总行驶距离和逃脱潜伏期）适合衡量总体表现，然而搜索策略的分析已被证明是衡量空间表现的更敏感方法（Curdt等人，2022年）。先前的研究表明，早期生活丰富化（EE）对执行功能有积极影响（Ismail等人，2024年；Sowndharya和Rajan，2024年；Wu等人，2016年；Yildirim等人，2024年），一些研究还表明EE后认知灵活性得到增强（Martínez-Canabal等人，2023年；Menezes等人，2020年；Terrier等人，2024年）。然而，这些研究要么在成年早期（Martínez-Canabal等人，2023年；Terrier等人，2024年），要么在母体剥夺后的新生儿期使用丰富化方案（Menezes等人，2020年）。我们的研究设计也与一些将EE与社会隔离动物进行比较的研究不同（Segovia等人，2008年；Sowndharya和Rajan，2024年），而是比较了无社会隔离的LE和HE环境。关于丰富化对CORT活性影响的先前文献发现，丰富化既没有效果（Aldhshan & Mizuno，2022年），也有研究表明更高的丰富化与较低的血清CORT浓度相关（Ismail等人，2024年）。由于FCM浓度与血清CORT浓度高度相关，并存在时间延迟（Thanos等人，2009年），我们的结果应与血清CORT研究相当。与丰富化与执行功能的关系一样，当前研究中使用的丰富化方案也与以往的研究不同，因为丰富化是在儿童晚期（Aldhshan & Mizuno，2022年）和成年早期（Ismail等人，2024年）进行的。我们的研究支持产前/新生儿期EE对反向学习的影响，表明早期发育的高环境对压力下的认知灵活性具有潜在的保护作用，尽管不能排除其对水迷宫中的空间工作记忆或运动能力的影响。

4.4. 限制
本研究的局限性在于我们没有测量母体行为。母体分离/剥夺模型已经证明母体行为在成年认知发展中起着重要作用（Choy等人，2008年；Joushi等人，2024年；Menezes等人，2024年；Menezes等人，2020年）。此外，EE和丰富化剥夺都与母体行为的差异有关（Dalle Molle等人，2012年；Li等人，2016年）。因此，我们无法确定研究中观察到的丰富化效应是由环境条件的变化还是由母体照顾的差异所驱动的。未来的研究应明确探讨母体行为在塑造后代丰富化与认知灵活性关系中的作用。需要注意的是，LE和HE环境不仅在丰富化物体的数量上有所不同。HE环境使用了IVCs和玉米芯垫料，而LE环境使用了开放式笼子和锯末垫料（补充表1）。这两个因素都与行为结果的差异有关（Guerra等人，2021年；Kemppinen等人，2008年；McClintock，1984年；Villalon Landeros等人，2012年），尽管尚未研究其对认知灵活性的具体影响。未来的研究应标准化笼子大小和垫料类型以确认我们的结果。本研究在测试水迷宫时没有考虑发情周期的作用。先前的研究已经发现发情周期对表现有影响，发情期的水迷宫表现下降最为明显（Snihur等人，2008年）。此外，发情周期可能会影响搜索策略的使用，大鼠在发情期比在发情前期更可能选择以自我为中心的策略（Korol等人，2004年）。然而，这些发情周期效应似乎主要影响任务学习阶段，而不是后续的水迷宫试验（Frye，1995年）。未来使用水迷宫协议的研究应考虑发情周期在规划和/或分析中的作用。

4.5. 结论
本研究探讨了val66met基因在压力条件下的认知灵活性作用以及早期生活丰富化（EE）的潜在保护作用。我们证明了val66met基因以性别特异性的方式影响压力下的认知灵活性效率，并可以通过空间策略减少坚持错误。这项研究还提供了关于EE在产前/新生儿期发育对成年期压力下认知灵活性作用的新见解。了解遗传和环境因素对压力相关执行功能变化的脆弱性有助于对高风险认知功能障碍人群进行早期干预。在这里研究的条件下，EE并不是压力韧性的强促进因素。