韩国小麦品种中烷基间苯二酚、植物甾醇、类胡萝卜素和维生素E含量的分析 何慧珍（Huijin Heo）、 洪圣华（Seonghwa Hong）、 朴珍熙（Jinhee Park）、 金庆勋（Kyeong-Hoon Kim）、 郑贤相（Heon-Sang Jeong）、 李哈娜（Hana Lee）和 李俊秀（Junsoo Lee）

《Foods》：Analysis of Alkylresorcinol, Phytosterol, Carotenoid, and Vitamin E Contents in Korean Wheat Cultivars Huijin Heo, Seonghwa Hong, Jinhee Park, Kyeong-Hoon Kim, Heon-Sang Jeong, Hana Lee and Junsoo Lee

　　摘要：本研究调查了2019年和2020年连续两年收获的41个韩国小麦品种的植物化学成分谱，重点关注烷基间苯二酚（ARs）、植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素。经过验证的色谱分析显示，不同品种之间存在显著差异。特别是十一烷基间苯二酚的含量在不同年份间表现出相对一致的模式，而植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素的浓度则变化更为明显，这可能与其生长环境条件有关。层次聚类分析根据这些品种的整体植物化学成分谱将其分为五组。“Dajoong”和“Shinmichal”品种的AR含量最高；“Hanbaek”、“Goso”和“Joah”富含β-谷甾醇；“Eunpa”和“Namhae”含有较高的β-生育三烯酚；“Uri”和“Chungkye”则以高浓度的叶黄素著称。“Saekeumkang”在所有植物化学成分类别中都表现出平衡的分布。这些发现为韩国小麦品种间的植物化学成分变异提供了基础数据，并有助于理解其多样性差异。

1. 引言
小麦（Triticum aestivum L.）是全球产量最大的作物之一，根据粮农组织（FAO）的数据，近年来年产量超过7.8亿吨[1]。长期以来，小麦被视为重要的食物来源，不仅提供碳水化合物，还含有多种对人体健康有益的生物活性化合物[2]。全麦谷物，包括麸皮和胚芽，富含促进健康的植物化学物质，如酚酸、黄酮类、烷基间苯二酚（ARs）和植物甾醇[3]。食用全麦与多种健康益处相关，包括改善消化健康以及降低心脏病、肥胖症和2型糖尿病等慢性疾病的风险[4,5]。随着人们对功能性食品和植物性饮食的兴趣日益增加，研究也越来越多地关注全谷物的营养价值。全麦是烷基间苯二酚、植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素等植物化学物质的丰富来源，这些成分赋予了全麦抗氧化、抗炎和预防慢性疾病的作用[6]。烷基间苯二酚（ARs），也称为间苯二酚脂质，是一类具有奇数个饱和烷基侧链和间苯二酚型酚环的酚类脂质。ARs通常具有含有17、19、21、23或25个碳原子的饱和烷基侧链[3,7]。它们具有多种生物活性，包括抗菌作用、神经保护作用和促进伤口愈合的效果，并显示出预防肌肉萎缩、改善代谢健康和降低癌症风险的潜力[8]。植物甾醇如菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇存在于小麦籽粒的胚芽和麸皮层中，已知可以干扰小肠中对膳食胆固醇和胆汁胆固醇的吸收[9]。全麦也是维生素E的丰富来源，其中包含四种生育酚（α-、β-、γ-和δ-生育酚）及其相应的生育三烯酚（α-、β-、γ-和δ-生育三烯酚），这些成分都具有抗氧化作用[10]。类胡萝卜素是小麦中的天然色素，赋予其金黄色并保护细胞免受氧化损伤[11]。这些化合物提供初级保护作用，并在细胞膜中表现出协同效应。鉴于这些化合物广泛的生理益处，通过日常食物增加植物化学物质摄入的策略受到了越来越多的关注。这些努力包括开发和消费旨在通过面包、意大利面和早餐谷物等主食传递健康促进化合物的全谷物产品。然而，这些化合物的浓度和分布在不同小麦品种间存在显著差异，并受到基因型、生长条件和环境压力等多种因素的影响[12]。先前的研究报告称，175个小麦基因型的总AR含量在19.4至74.1毫克/100克干物质之间变化[13]。195个小麦品种的植物甾醇含量范围为6.7至11.87毫克/100克干重[14]。主要类胡萝卜素（叶黄素）在8个小麦品种中的含量在82至114微克/100克干重之间，而α-生育三烯酚在所有小麦籽粒中的含量在0.34至1.01毫克/100克干重之间[15]。以往关于韩国小麦品种的研究主要集中在全麦面粉的总体化学组成上，包括灰分、脂质、蛋白质和碳水化合物含量，并报告了基因型间的显著差异[16]。这些研究共同表明，小麦中主要植物化学物质的浓度会因基因背景的不同而大相径庭。尽管已有报道指出小麦基因型间植物化学成分存在较大变异性，但对韩国小麦品种中这些成分的系统性多年评估仍较为有限。因此，本研究的主要目的是系统地评估和比较41个主要韩国小麦品种全谷物中ARs、植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素的含量。通过分析2019年和2020年连续两年收获的样本，本研究还旨在探讨植物化学成分浓度可能的年际变化，从而初步了解环境条件对植物化学成分谱的影响。

2. 材料与方法
2.1 材料
本研究调查了由韩国农村发展厅（RDA）提供的41个韩国小麦品种，这些品种在2019年和2020年进行了种植。这41个品种是韩国当前种植小麦品种评估项目的一部分。每年都在RDA国家作物科学研究所的高地作物试验田的相同地块上进行种植。播种前施用了9.1:7.4:3.9千克/10英亩（氮：磷：钾）的肥料。生长期间实施了严格的病虫害管理，未进行额外灌溉。播种时间为10月，收获时间在次年的6月5日至10日之间。由于谷物在完全成熟时收获，其最终水分含量约为12%至14%。实验采用随机完全区组设计，每个品种每年重复三次。收获后，每个重复组的谷物分别使用强制风干机进行干燥。为了确保质量评估的一致性并减少重复组内的变异，将三次生物重复实验得到的干燥谷物合并成每个品种在特定年份的单一复合样本。每个复合样本进行了两次成分分析。本研究评估的小麦品种信息见表1和表S1。

2.2 前处理
2.2.1 类胡萝卜素、维生素E和植物甾醇分析
从41个小麦品种中取100克全麦样本，使用Wiswell研磨机（型号SP-7426；Supreme Electric Manufacturing Co., Ltd.，广州，中国）研磨，并通过30目筛子以确保颗粒大小均匀，然后进行提取。植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素的分析采用皂化法作为前处理方法[17]。具体步骤为：2克全麦粉与20毫升6%的焦性没食子酚乙醇溶液皂化，随后加入8毫升60%（w/v）的氢氧化钾溶液。混合物在水浴中（NTS-1300；Eyela，东京，日本）加热至75±1°C并回流50分钟。加热后迅速在冰浴中冷却。接着加入30毫升2%的氯化钠溶液和20毫升含有0.01%丁基羟基甲苯的己烷进行提取。混合物涡旋2分钟后静置分层，收集含有目标植物化学物质的己烷层至50毫升容量瓶中。己烷提取物通过0.45微米聚四氟乙烯（PTFE）膜过滤器过滤后，注入高效液相色谱（HPLC）系统进行分析。对于植物甾醇的测定，己烷提取物在氮气下蒸发，然后加入100微升吡啶和N-甲基-N-三甲硅基氟乙酰胺制备植物甾醇的三甲硅基衍生物。试管振荡使样品溶解在试剂中，然后在60°C下加热20分钟。随后在氮气下去除过量试剂。向剩余残渣中加入1毫升二甲基甲酰胺，样品通过0.45微米PTFE过滤器过滤后注入气相色谱（GC）系统进行分析。

2.2.2 烷基间苯二酚分析
每个研磨后的全麦谷物样本（1.0克）加入0.5毫克/毫升的甲基苯甲酸酯作为内标（ISTD）用于GC定量。全麦粉在室温下用40毫升乙酸乙酯提取24小时。收集有机相并调整体积至50毫升，得到含有ARs的溶液。分析时，将4毫升提取液在氮气流下蒸发。通过加入100微升BSTFA + TMCS + TMSI硅化试剂将ARs衍生为三甲硅基醚形式。样品在65°C下振荡和加热30分钟后，去除过量试剂。过滤后，样品准备好注入GC系统。

2.3 类胡萝卜素分析的高效液相色谱条件
类胡萝卜素的分析使用配备UV-2075紫外检测器、PU-2089泵、AS-2055自动进样器和CO-2060柱 oven（JASCO Corp.，东京，日本）的HPLC系统进行，以及Vydac 201TP54柱（250 × 4.6毫米，5微米；Grace，哥伦比亚，MD，美国）。流动相为含有0.05 M醋酸铵的乙腈：甲醇：1,2-二氯乙烷（65:30:5，v/v）。流速设定为1.0毫升/分钟，柱温保持在25°C。检测波长为450纳米。使用叶黄素和玉米黄质进行外部校准进行定量，校准曲线方程见表S2。

2.4 维生素E分析的高效液相色谱条件
维生素E的分析基于Yu等人（2023年）[18]的方法，使用配备FP-2020荧光检测器、PU-2089泵、AS-2055自动进样器和CO-2060柱 oven（JASCO Corp.）的HPLC系统，以及LiChrosphere Diol 100 HPLC柱（250 × 4毫米，内径5微米；Merck，达姆施塔特，德国）。流动相为己烷：异丙醇（98.7:1.3，v/v），流速为1.0毫升/分钟。柱温保持在25°C。检测波长分别为290纳米和330纳米。使用α-生育酚、β-生育酚、α-生育三烯酚和β-生育三烯酚进行外部校准进行定量，校准曲线方程见表S2。类胡萝卜素峰通过与其标准品的保留时间比较在HPLC色谱图中识别（见图S1）。

2.5 植物甾醇分析的气相色谱条件
植物甾醇的测定使用GC（7890A；Agilent，圣克拉拉，CA，美国）进行，采用SAC-5熔融硅胶毛细管柱（30米 × 0.25毫米 × 0.25微米；Supelco，贝尔方特，PA，美国）。火焰离子化检测器工作温度为285°C，进样器温度设定为300°C。柱温在285°C下保持20分钟。使用高纯度（99.999%）N2作为载气，流速为1.0毫升/分钟。进样量为2微升，分流比为10:1。使用5α-胆甾烷作为ISTD进行定量，相对响应因子（RRF）的计算公式为：浓度 = （样品面积 ÷ ISTD面积）× ISTD浓度 × RRF × 稀释因子。类胡萝卜素峰通过与其标准品的保留时间比较在GC色谱图中识别（见图S3）。

2.6 烷基间苯二酚分析的气相色谱条件
烷基间苯二酚的分析条件基于Bordiga等人（2016年）[19]的方法进行略微修改。所有样品通过GC（7890A；Agilent，圣克拉拉，CA，美国）进行测定，使用DB-17HT毛细管柱（30米 × 0.25毫米 × 0.25微米；Agilent）。火焰离子化检测器工作温度为350°C，进样器温度设定为250°C。柱温在285°C下保持2分钟，然后以10°C/分钟的速率升温至320°C并保持7分钟。高纯度（99.999%）的氮气（N2）被用作载气，流速为1.0 mL/min。注射体积为2 μL，分流比为10:1。定量分析使用甲基苯甲酸酯（methyl behenate）作为内标物（ISTD）和相对响应因子（RRF），浓度计算方法依据第2.6节中的公式进行。通过将保留时间与真实标准品的保留时间进行比较，识别出芳烃类化合物（ARs）的峰，如GC色谱图（图S4）所示。2.8 方法验证 本研究使用的所有分析方法均通过评估其精确度（重复性和再现性）和准确性（回收率）进行了验证。重复性通过在同一天对重复样品进行五次独立分析来评估，而再现性则通过在不同天对重复样品进行五次单独分析来确定。精确度结果以平均值、标准偏差（SD）和变异系数（CV）表示。准确性通过使用代表性化合物进行回收实验来评估：对于烷基间苯二酚类化合物使用十七烷基间苯二酚（heptadecylresorcinol），对于植物甾醇类化合物使用β-谷甾醇（β-sitosterol），对于维生素E使用α-生育酚（α-tocopherol），对于类胡萝卜素使用叶黄素（lutein）。回收率（%）的计算公式为：回收率（%）= (Cs ? Cp)/Ca × 100，其中Cs是加标样品中的目标化合物含量，Cp是样品中的目标化合物含量，Ca是添加的目标化合物含量。使用外部标准品通过HPLC确定了校准曲线、决定系数（R2）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）；而通过GC分析的烷基间苯二酚类化合物和植物甾醇类化合物则使用ISTD和RRF进行定量。2.9 统计分析 使用GraphPad Prism（版本8.2.1；GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）构建箱线图（box-whisker plot）。箱线图由一个矩形框组成，表示数据的中间50%（四分位数范围），框内的线表示中位数。箱线从框延伸出来，显示最小值和最大值，代表数据的分布情况。使用欧几里得距离度量和Ward的链接方法（Ward.D2）在RStudio（版本4.2.1）中进行了层次聚类分析，并将结果可视化为热图。在聚类分析之前，使用z分数缩放对植物化学变量进行了标准化，以消除变量之间的尺度差异。通过观察树状图（dendrogram），将品种分为五个簇（A–E），这些簇在保持可解释的簇大小的同时，能够清晰地区分植物化学成分的模式。使用RStudio和Factoextra包（fviz_pca_biplot函数）进行了主成分分析（PCA），以可视化41个小麦品种之间的植物化学成分的整体变化。作为输入变量使用了十三种植物化学化合物，包括烷基间苯二酚类（C17:0, C19:0, C21:0, C23:0）、植物甾醇类（campesterol, stigmasterol, β-sitosterol）、维生素E同系物（α-T, α-T3, β-T, β-T3）和类胡萝卜素（lutein, zeaxanthin）。PCA中的模式基于品种在两个主要成分上的分离情况来解释，这两个成分捕获了总变异的最大比例，从而可以识别出具有相似或不同植物化学特征的品种。使用单因素方差分析（ANOVA）以及Tukey的诚实显著差异（HSD）检验（p < 0.05）来评估品种间的植物化学成分差异。此外，还使用GraphPad Prism进行了双因素方差分析（two-way ANOVA），以评估品种和收获年份对植物化学成分水平的影响，其中品种和年份被视为固定因素。在同一簇组内，使用双尾t检验（p < 0.05）评估不同收获年份之间的植物化学成分差异。植物化学变量的分布特征，包括偏度和峰度，在表2中进行了总结。偏度范围从-0.73到1.30，峰度范围从-1.34到3.12，这些值都在通常接受的正态性范围内（偏度 < |2|，峰度 < |7|）。这些结果表明数据没有显著偏离正态分布。此外，组样本大小是平衡的，在这种情况下，ANOVA对中等程度的正态性偏离和方差同质性具有鲁棒性。每种植物化学化合物都被视为独立的响应变量并分别进行分析；因此，没有对不同植物化学化合物之间的多重检验进行校正。表2. 2019年和2020年收获的41个全麦品种中测量的植物化学成分的描述性统计。3. 结果与讨论 3.1 基于描述性统计的全麦中植物化学成分的变异性 41个小麦品种在两个收获年份中的芳烃类化合物（ARs）、植物甾醇类、维生素E和类胡萝卜素的含量在补充数据（表S3–S6）中呈现。每种化合物的描述性统计信息——包括最小值、最大值、平均值、标准偏差（SD）、变异系数（CV）、偏度和峰度——在表2 [20] 中给出。在本研究中，二十一烷基间苯二酚（heneicosylresorcinol，C21:0）在2019年的平均含量为25.81 mg/100 g，在2020年为24.91 mg/100 g，无论收获年份如何，其含量都是最高的，其次是十九烷基间苯二酚（nonadecylresorcinol，C19:0）、二十三烷基间苯二酚（tricosylresorcinol，C23:0）和十七烷基间苯二酚（heptadecylresorcinol，C17:0）。在芳烃类化合物中，二十一烷基间苯二酚（heneicosylresorcinol，C21:0）的含量最高且变异性最低（2019年和2020年的CV分别为15.86%和13.45%），而十七烷基间苯二酚（heptadecylresorcinol，C17:0）的含量最低且变异性最高（CV分别为22.26%和21.73%）。这些结果与之前关于小麦植物化学成分的研究结果大致一致。例如，已有报道指出小麦中的总芳烃类化合物含量在19.4至74.1 mg/100 g干物质之间变化，植物甾醇含量在6.7至11.87 mg/100 g干重之间，叶黄素水平在82–114 μg/100 g干重之间，α-生育酚（α-T）含量在0.34–1.01 mg/100 g干重之间[13,14,15]。这些比较表明，所研究品种中的植物化学成分浓度与早期发现基本一致，而某些国内品种中的较高值可能反映了遗传和环境因素的影响。β-谷甾醇是主要的植物甾醇类化合物，约占全麦总植物甾醇含量的40–60%[14]。二十二烷基间苯二酚（stigmasterol）的峰度和CV值高于其他植物甾醇类化合物，表明不同小麦品种中的二十二烷基间苯二酚含量差异较大。几种维生素E形式（γ-T, γ-T3, δ-T, δ-T3）在色谱图中仅以微量存在，并且低于分析方法的定量限（表S2），因此未包括在定量分析中。我们全麦样品中未检测到可量化的γ-和δ-形式维生素E，这与先前的研究结果一致，即这些形式通常在小麦中无法检测到或仅以微量存在。先前的研究一致表明，α-和β-生育酚以及生育三烯酚是小麦籽粒中的主要生育酚类化合物，而γ-和δ-异构体要么不存在，要么仅以极低水平存在[21,22,23,24]。在检测到的维生素E形式中，2019年的α-T3和2020年的β-T3表现出最高的CV变异性，分别为38.75%和40.51%。这表明维生素E含量根据收获年份存在显著差异。所有小麦品种中的叶黄素含量均低于叶黄素。2019年收获的全麦平均叶黄素含量为93.24 μg/100 g，2020年为67.30 μg/100 g。尽管叶黄素含量始终低于叶黄素，但其在不同小麦品种间的变异性更大，这从较大的CV值可以看出。这些发现突显了小麦品种间植物化学成分的显著差异，强调了遗传因素的影响。3.2 环境因素对植物化学成分年度变化的影响 使用箱线图（Figure 1）评估了2019年和2020年间全麦品种植物化学成分的年度变化。芳烃类化合物的年际变异性很小，两年间水平稳定，表明遗传因素起主导作用。其中，二十三烷基间苯二酚（tricosylresorcinol，C23:0）表现出轻微的年度变化，但总体一致性得以保持（图1a）。与2019年相比，2020年的植物甾醇类和类胡萝卜素含量显著减少（图1b,d）。维生素E含量表现出中等程度的变化，品种间的范围较广（图1c），表明涉及遗传和环境因素的更复杂响应。2020年收获的全麦品种中植物甾醇类和类胡萝卜素的减少可能与两个生长季节之间的环境条件差异有关。2020年的总日照时间比2019年减少了约119小时，而总降水量增加了156毫米（表S7）。先前的研究表明，光照对次生代谢物（包括植物甾醇类和类胡萝卜素）的生物合成和积累至关重要[25,26,27]。此外，2020年的总降水量比2019年增加了约156毫米，其中2月21日至3月20日和5月21日至6月20日的降水量显著增加。水对植物生存至关重要；然而，过量的水会导致压力并阻碍土壤与大气之间的气体交换[28]。此外，过多的降雨可能导致气孔关闭和光合作用减少[29]。光合作用的减少可能会影响次生代谢物的生物合成。这些发现支持了芳烃类化合物水平主要由基因型决定的观点，而植物甾醇类、维生素E和类胡萝卜素的浓度则更受环境因素的影响。此外，对胡萝卜、土豆和卷心菜等蔬菜的田间研究表明，在不同天气条件（温度、降雨量）下，酚类化合物和抗氧化活性存在显著变化，表明季节性环境变化可以影响植物化学成分[30,31]。然而，由于本研究仅进行了两个生长季节，因此无法完全解析环境条件对植物化学成分积累的影响。需要进一步的多年研究，结合详细的气象数据和生理测量，以更清楚地描述这些关系。图1. 收获年份对连续两年（2019年和2020年）种植的小麦品种中植物化学成分浓度的影响。箱线图展示了（a）烷基间苯二酚类（C17:0, heptadecylresorcinol；C19:0, nonadecylresorcinol；C21:0, heneicosylresorcinol；C23:0, tricosylresorcinol），（b）植物甾醇类（campesterol, stigmasterol, β-sitosterol），（c）维生素E（α-T, α-tocopherol；α-T3, α-tocotrienol；β-T, β-tocopherol；β-T3, β-tocotrienol），以及（d）类胡萝卜素（lutein和zeaxanthin）的含量。通过以品种和年份为因素的双因素方差分析（two-way ANOVA）评估统计显著性。星号表示显著差异，**** p < 0.0001；n.s.，不显著。为了评估遗传因素和环境因素在复合样本水平上的相对影响，对每种植物化学成分进行了标准的双因素方差分析，将品种和收获年份视为固定因素，并包括它们的交互作用（表S8）。使用每个因素的F统计量和相应的p值来评估品种和年份的相对影响。对于烷基间苯二酚类化合物，变化主要与品种相关（C17:0: F_cultivar = 26.88, p < 0.0001；C19:0: F_cultivar = 58.49, p < 0.0001；C21:0: F_cultivar = 34.15, p < 0.0001），而年份的影响较小（C17:0: F_year = 13.45, p = 0.0004）。相比之下，植物甾醇类如campesterol和β-sitosterol主要与年份相关（campesterol: F_year = 2348, p < 0.0001；β-sitosterol: F_year = 3030, p < 0.0001）。对于维生素E化合物，品种和年份的贡献更为平衡（α-tocopherol: F_cultivar = 31.48, p < 0.0001；F_year = 920.0, p < 0.0001）。对于类胡萝卜素，叶黄素和zeaxanthin与年份的相关性更强（lutein: F_year = 1400, p < 0.0001；zeaxanthin: F_year = 12,818, p < 0.0001）。总体而言，这些在复合样本水平上的关联表明芳烃类化合物的水平主要与基因型相关，而植物甾醇类和类胡萝卜素与环境条件的关联更强。这一模式与先前的研究结果一致，即基因型是全麦中芳烃类化合物含量的主要决定因素[7,32]，尽管环境和气象因素也可能对变化有所贡献[33,34]。总体而言，我们的发现表明遗传和环境因素都与全麦的植物化学成分有关。从营养和功能的角度来看，这种变异性可能会影响基于小麦的食品的健康益处的稳定性和有效性。由于已知芳烃类化合物、植物甾醇类、维生素E和类胡萝卜素具有抗氧化、抗炎和降胆固醇的作用，它们含量的差异可能会影响基于小麦的食品的营养价值[3]。因此，全面了解遗传和环境因素的影响对于选择旨在提高全麦营养价值的育种品种至关重要。3.3 2019年和2020年收获的41个小麦品种中植物化学成分轮廓的聚类分析 基于2019年和2020年收获的41个小麦品种中的芳烃类化合物、植物甾醇类、维生素E和类胡萝卜素的含量进行了聚类分析。这些品种被分为五个组——A组（7个品种）、B组（11个品种）、C组（5个品种）、D组（10个品种）和E组（8个品种），并使用各组的平均值来比较不同年份间的植物化学成分谱（见图2和表3）。D组和E组的总芳基Resorcinols（ARs）含量最高，2019年的含量范围为45.39至59.94毫克/100克，两年间保持一致。主要的同系物是C19:0和C21:0，而C17:0和C23:0的含量较低，这与早期研究结果一致[13]。这些数值处于之前报道的小麦中22.0–94.3毫克/100克的范围内，尽管研究之间的差异可能归因于环境因素和遗传变异[7]。D组的‘Dajoong’品种和E组的‘Shinmichal’品种在两年中始终表现出最高的ARs浓度。2019年，D组和E组的总植物甾醇含量也最高，尤其是β-谷甾醇，其含量分别为61.30毫克/100克和61.03毫克/100克。值得注意的是，D组的‘Hanbaek’、‘Goso’和‘Joah’品种以及E组的‘Anbaek’和‘Jonong’品种也始终表现出较高的植物甾醇含量。本研究观察到的植物甾醇水平超过了之前报道的全麦颗粒中20.2至35.5毫克/100克的范围，其中β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇是主要成分[35]。这些发现表明，某些国产小麦品种可能是植物甾醇的宝贵来源，具有改善营养和功能特性的潜力。图2显示了41个小麦品种的植物化学成分的层次聚类结果。热图展示了包括烷基Resorcinols、植物甾醇、维生素E同系物和类胡萝卜素在内的13种植物化学化合物在所有品种中的相对丰度。每一行代表一个单独的小麦品种，每一列对应一种特定的植物化学化合物。根据它们的整体植物化学成分谱，这些品种被分为五个不同的组（A–E）。每个单元格的颜色强度表示该品种中特定植物化学化合物的相对丰度，红色表示较高水平，蓝色表示较低水平。表3比较了41个小麦品种在不同组（A–E）和不同年份（2019年与2020年）之间的平均植物化学成分浓度。A组在两年中都表现出最高的α-生育酚、β-生育酚和β-生育三烯酚水平。在该组中，‘Eunpa’和‘Namhae’品种的维生素E浓度最高。在所有样本中，β-生育三烯酚是主要成分，占总维生素E的50–55%，这与之前报道的小麦中β-T3为主要形式的研究结果一致[24]。类胡萝卜素浓度差异较大，叶黄素和玉米黄质的含量分别为61.73–120.13微克/100克和7.76–62.02微克/100克。C组在两年中表现出最高的平均叶黄素水平，尤其是‘Uri’和‘Chungkye’品种。未检测到β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，这与先前的研究结果一致[36]，尽管其他研究报道了可检测到的β-胡萝卜素和更高的叶黄素值[24]。这种差异可能反映了品种间的遗传差异。有趣的是，B组的‘Saekeumkang’品种表现出平衡的植物化学成分谱，在所有四类化合物中都高于平均水平。这种成分平衡可能是其先前报道的健康益处的基础，包括对抗非酒精性脂肪肝病和肥胖的有效性[4,37]，强调了植物化学成分协同作用在小麦品种中的潜在重要性。3.4. 植物化学成分谱的主成分分析（PCA）PCA被用来补充层次聚类结果，并进一步阐明代谢物之间的关系。PC1和PC2分别解释了总方差的26.3%和17.0%（见图3）。PCA载荷图显示ARs和植物甾醇之间存在强烈的正相关，这与热图中观察到的聚类模式一致，表明这些化合物在品种间共同积累。尽管ARs和植物甾醇通过不同的代谢途径合成——ARs通过聚酮途径，植物甾醇通过甲瓦酮酸途径[38,39]——但它们的同时富集可能受到共同环境因素的影响或它们在相似谷物组分中的分布。先前的研究也报告了ARs、甾醇、tocols和其他植物化学成分之间的相关性，这可能反映了麸皮组分相对贡献的差异[40]。图3显示了2019年和2020年收获的41个小麦品种的植物化学成分谱的主成分分析（PCA）结果。PCA分析了13种植物化学化合物。每个数据点代表一个单独的品种，品种根据层次聚类分析的结果用不同颜色编码：A组（青色）、B组（绿色）、C组（橙色）、D组（蓝色）和E组（粉色）。PCA中包括的变量有烷基Resorcinols（C17:0、十七烷基Resorcinol；C19:0、十九烷基Resorcinol；C21:0、二十一烷基Resorcinol；C23:0、二十三烷基Resorcinol）、植物甾醇（菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇）、维生素E同系物（α-T、α-生育酚；α-T3、α-生育三烯酚；β-T、β-生育酚；β-T3、β-生育三烯酚）和类胡萝卜素（叶黄素和玉米黄质）。变量后跟“19”和“20”表示分别来自2019年和2020年样本的测量值。数字（1–41）表示表1中列出的小麦品种代码。还观察到类胡萝卜素（叶黄素和玉米黄质）与维生素E同系物（α-生育酚、β-生育酚和β-生育三烯酚）之间的中等正相关。这些化合物类别有一个共同的前体——香叶基香叶基焦磷酸（GGPP），它在质体中合成。类胡萝卜素通过将GGPP转化为下游色素（如叶黄素和玉米黄质）的酶促反应产生[41]。相比之下，维生素E的生物合成涉及将GGPP转化为植酰焦磷酸，然后通过进一步的酶促转化形成生育酚和生育三烯酚[38]。这种共同的质体起源可能部分解释了品种间观察到的协调积累模式[42]。总体而言，聚类分析为识别具有优越植物化学成分谱的小麦品种提供了有用的工具，这对改善健康益处具有重要意义。3.5. 植物化学成分的方法验证所有用于植物化学成分定量的分析方法都在精确度和准确性方面进行了验证。精确度通过重复性和再现性进行评估，准确性通过回收测试进行评估。如表S9和S10所示，大多数化合物的重复性CV低于8%。生育三烯醇和β-生育酚的变异性较高（CV：16.9–17.9%），这可能是由于它们在全麦中的含量较低。所有分析物的再现性CV均低于8%。所有测试化合物的回收率均超过90%——十七烷基Resorcinol、β-谷甾醇、α-生育酚和叶黄素的CV低于5%，表明准确性足够。此外，维生素E同系物和类胡萝卜素的校准曲线显示出极好的线性（R2 ≥ 0.997），检测限（LOD）和定量限（LOQ）总结在表S2中。这些结果确认所应用的方法适用于目标植物化学成分的定量分析。4. 结论总之，本研究在连续两年内表征了41个韩国小麦品种的植物化学成分谱，重点关注ARs、植物甾醇、维生素E和类胡萝卜素。ARs的水平在两年间相对稳定，表明品种相关因素可能对其相对稳定性有贡献，而植物甾醇和类胡萝卜素表现出更大的年际变化，表明它们的水平可能受环境条件的影响。多变量分析，包括主成分分析（PCA）和层次聚类，使得可以根据植物化学成分模式对品种进行分类。值得注意的是，一些品种具有高含量的特定植物化学成分，而‘Saekeumkang’品种在所有化合物组中表现出平衡的成分谱。这些发现突出了植物化学成分谱在指导韩国小麦育种计划中的潜力。然而，需要多年多地点的研究来验证基因型在多种条件下的表现。补充材料以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/foods15061075/s1，图S1：用于鉴定全麦样品中类胡萝卜素的代表性HPLC色谱图；图S2：用于鉴定小麦样品中维生素E化合物的代表性HPLC色谱图；图S3：用于鉴定小麦样品中植物甾醇的代表性GC色谱图；图S4：用于鉴定小麦样品中烷基Resorcinols的代表性GC色谱图；表S1：41个小麦品种的列表；表S2：维生素E同系物和类胡萝卜素的校准曲线、决定系数（R2）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）；表S3：2019年和2020年收获的41个小麦品种中的烷基Resorcinols（ARs）含量；表S4：2019年和2020年收获的41个小麦品种中的植物甾醇含量；表S5：2019年和2020年收获的41个小麦品种中的维生素E含量；表S6：2019年和2020年收获的41个小麦品种中的类胡萝卜素含量；表S7：2019年和2020年生长期间的气候条件；表S8：品种、收获年份及其交互作用对全麦植物化学成分影响的双向ANOVA结果；表S9：全麦中植物化学成分测定的精确度；表S10：全麦中植物化学成分测定的准确性；表S11：本研究中分析的主要脂溶性植物化学成分类别，包括代表性化合物及其在小麦籽粒中的生物学和营养功能。