《Environmental Research》：A Review on Microbial Lipids Conversion from Organic Wastes: Adaptive Laboratory Evolution-Driven Strategies for Enhanced Biofuel Precursor Synthesis
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适应性实验室进化（ALE）技术通过定向构建生物压力环境重塑微生物代谢网络，显著提升其在含抑制性有机废物的发酵中的耐受性，从而直接利用复杂废液生产微生物脂质，为可持续生物能源开发提供新路径。
孙淑双|王雪梅|卢东婷|陈正贤|曹鸿鑫|程世坤|李子富|Luiza C. Campos
北京科技大学，能源与环境工程学院，工业污染物资源化处理国家重点实验室
摘要
将有机废弃物的发酵液战略性地转化为微生物脂质以生产生物燃料，已成为推动可持续发展的关键策略。然而，发酵液中的抑制性成分会严重阻碍产油微生物的代谢，从而大幅降低生物转化效率。传统的预处理方法（如化学和酶法）会带来额外的成本。适应性实验室进化（ALE）技术基于定向进化的原理，精确构建生物应激环境并重塑微生物代谢网络，以提高菌株的耐受性和功能性。这使得可以直接利用复杂的发酵液进行脂质生产。本文首先介绍了ALE技术施加的选择压力机制，并根据菌株的生理特性提出了营养供应和极端环境应激的策略。接着重点讨论了ALE过程的技术原理，以及不同进化模式及其适用场景。在此基础上，本文综述了结合ALE与合成生物学的新策略，利用精准代谢工程、基因组编辑和机器学习来扩展ALE技术的应用范围。最后，系统探讨了ALE技术在有机废物资源化领域的未来发展趋势。
引言
全球人口增长和快速工业化显著增加了有机废物的产生。有机废物是一种富含碳的残留物，通常含有超过50%的可生物降解成分，来源于农业（农作物秸秆和粪便）、食品加工（厨余垃圾和果皮）以及工业部门（污泥和纺织品）。目前，超过60%的这些废物通过焚烧或填埋处理，导致过量的碳排放和严重的生态负担（Withanage等人，2021年；Shin等人，2023年）。近年来，将有机废物转化为高价值产品的增值处理技术受到了关注，其中从有机废物中生产脂质已成为一种可行的平台技术（Sun等人，2023a）。
传统的脂质生产主要依赖于可食用作物，这不可避免地加剧了食品安全与能源需求之间的全球竞争。尽管基于非可食用木质纤维素生物质的第二代生物燃料减轻了与食品的直接竞争，但其实施往往受到生物质抗性以及昂贵的预处理和水解步骤的限制，这些步骤降低了产率稳定性。相比之下，由微生物脂质生产的第三代生物柴油在可控的生物过程中具有较高的脂质产量，可以利用广泛的废物碳流，并将生物柴油供应与耕地限制脱钩（Kumar等人，2025年；Al Shehhi等人，2025年）。这通过将有机废物从高碳排放途径转向高价值利用，促进了全面的脱碳策略。微生物脂质由真菌、细菌或微藻在特定条件下利用各种碳源、氮源和无机盐辅因子生产。如图1所示，有机废物可以水解生成两种关键底物：糖类和短链脂肪酸（SCFAs），为产油微生物提供丰富的碳源和营养物质。然而，在原料生物转化过程中释放的过量碳源和抑制性化合物对这些微生物造成了巨大压力。这些有毒/抑制性化合物可以分为三大类：呋喃醛、高浓度有机酸和酚类化合物（Liu等人，2021b）。
一个看似简单的解决方案是稀释水解液以降低抑制物浓度。虽然稀释可以在实验室环境中缓解急性抑制，但同时会减少可发酵糖分，降低脂质产量和体积生产力，并增加水需求和下游处理负担。此外，对于弱酸抑制剂，毒性与介质pH值和未解离的酸部分密切相关，因此仅靠稀释可能无法可靠地将系统置于稳定的运行范围内（Antunes和Sa-Correia，2024年；Nunes等人，2024年；Kamal等人，2024年）。近年来提出了多种方法来降低水解产物中的抑制物浓度，从而提高微生物在发酵过程中的表现。例如，Zhang等人（2019年）从腐烂的木材中分离出了木质分解菌Mycobacterium smegmatis LZ-K2，该菌具有较高的木质素降解能力和脂质生产潜力。该菌株在碱处理、酸处理和未经处理的玉米秸秆中的脂质产量分别为0.083克/升、0.069克/升和0.072克/升。为了克服桦木水解产物对Lipomyces starkeyi脂质转化的抑制作用，Brandenburg等人（2016年）建立了一个恒定pH值的静态补充批次培养系统，通过监测乙酸消耗引起的pH值升高来自动补充底物，从而消除了抑制物的累积效应。此外，Gujjala等人（2019年）使用漆酶预处理的Ricinus communis废液作为Aspergillus awamori的培养基，并通过响应面方法优化了工艺参数（31°C，C/N比156，接种体积11.5% v/v），实现了最大脂质产量。
尽管这些解毒方法有效，但它们增加了生物精炼系统的成本和复杂性。相比之下，ALE技术通过代谢途径重塑从根本上增强了微生物特性（Sandberg等人，2019年），使菌株能够在复杂且未经脱毒的水解液中稳健生长并积累脂质，从而无需严格的预处理或大量稀释。这种进化出的耐受性显著提高了整体资源效率。例如，增强的渗透适应能力可以部分替代能耗高的脱盐装置，最终减少了对严格pH值和盐度条件的依赖，以及二次环境修复的需求（Sun等人，2021年）。迄今为止，ALE技术在基于水解液的培养基中用于提高产油微生物性能的应用研究较少。图2使用“微生物脂质”和“适应性进化”作为关键词搜索，在过去20年的“Web of Science”数据库中展示了产油酵母的研究情况。结果表明，尽管ALE在微生物进化、氧化应激和Saccharomyces cerevisiae等领域得到了广泛研究，但其在有机废物生物燃料前体合成中的应用仍然有限。在阐明特定选择压力如何驱动实际水解液中的适应轨迹、比较不同抑制条件下的进化策略以及追踪支持优异表型的突变位点方面仍存在关键空白。
本综述全面总结了ALE在有机废物资源化背景下的机制基础和目标技术框架。我们阐明了选择压力策略与微生物代谢适应之间的相互作用，强调了将ALE与合成生物学结合以扩展生物转化边界的协同潜力。通过将进化原理与工业化视角相结合，本研究为克服代谢抑制和加速微生物脂质的可持续生产提供了战略路线图，以促进生物能源转型。
节选
产油微生物在ALE中的进化压力
在ALE技术中，抑制性压力是驱动微生物进化的关键因素。如图3所示，在多种有机废物底物的水解过程中，尽管预处理阶段有助于生物转化过程，但水解液中存在的抑制性化合物（如呋喃醛、脂肪酸、酚类衍生物和糖类）可能会引发产油微生物的应激反应（Tekarslan-Sahin，2022年）。例如，呋喃醛（如5-HMF）等
针对性ALE策略
在有机废物生物转化系统中，木质纤维素水解物抑制物的复杂性、底物代谢不平衡和产品反馈抑制对传统ALE技术构成了双重挑战：突破微生物代谢可塑性的进化瓶颈，并实现环境压力对代谢表型的动态适应。如图5(a)所示，不同条件下菌株的原始耐受阈值
ALE技术的进步
尽管ALE技术是构建微生物细胞工厂的强大工具，但其实际应用仍面临重大挑战。这些挑战包括耗时且劳动密集的进化过程，单独使用时可能导致关键酶活性不足或调控网络不匹配。目前，ALE与合成生物学的协同整合已成为生物技术领域的关键发展方向。
结论与未来展望
合成生物学和代谢工程的进步催生了多种生物技术，为微生物工程提供了多样化的工具。在有机废物资源化的背景下，ALE仍然是改善微生物在异质性抑制剂和波动条件下的表现的有效途径。然而，几个障碍限制了其更广泛的应用。传统的ALE技术资源消耗大且
利益冲突声明
本手稿的提交不存在利益冲突，且未在其他地方考虑发表。如果被接受，其发表将得到所有作者的批准，不会以相同形式或任何其他语言在其他地方发表。
CRediT作者贡献声明
曹鸿鑫：研究。陈正贤：研究。Luiza C. Campos：写作——审稿与编辑。程世坤：研究。李子富：写作——审稿与编辑。孙淑双：写作——初稿。卢东婷：研究。王雪梅：概念构思
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFD1600201）、国家自然科学基金国际合作与交流项目（52261145693）以及国际青年教师交流与成长项目（QNXM20250004）的支持。本出版物得到了中国留学基金委的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者借此机会对国家环境与能源科学技术国际合作基地的支持表示衷心的感谢。
