《Applied Microbiology and Biotechnology》：Co-cultivation Serratia marcescens with Trichoderma harzianum for improving production of Huperzine A
编辑推荐：
为应对植物源抗阿尔茨海默症(AD)药物石杉碱甲(HupA)资源匮乏，化学合成异构体活性低、毒性高等瓶颈，本研究创新性地从石杉(Huperzia serrata, HS)中分离得到内生细菌Serratia marcescens HL-1，并与内生真菌Trichoderma harzianum NSW-V建立共培养体系，将细菌的(-)-HupA产量提升至32.976±0.21 mg/L。所获生物合成HupA(BHA)经鉴定与植物源(-)-HupA(PHA)结构一致，且在棕榈酸(PA)诱导的胰岛β细胞损伤模型中展现出保护活性(细胞活力从58.2%提升至71.2%)，首次揭示了HupA在经典抗AD活性之外的胰腺保护新功能，为解决HupA的可持续生产和拓展其临床应用提供了新策略。
在对抗阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)这场没有硝烟的战争中，科学家们一直在寻找高效、安全的武器。石杉碱甲(Huperzine A, HupA)正是这样一种明星分子，它作为一种高效、可逆的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)抑制剂，在临床上被用于改善AD患者的认知功能。然而，其传统的来源——珍稀蕨类植物石杉(Huperzia serrata, HS)正面临资源枯竭的困境，而从植物中提取HupA含量极低。另一条路径化学合成，虽然能生产HupA，但主要生成的是活性仅为天然(-)-HupA 1/30的(+)-异构体，且合成过程复杂、成本高昂、易产生污染。这双重瓶颈严重制约了HupA药物的开发与应用，迫使科学家们将目光投向微生物，探寻能否让这些“微型工厂”为我们高效、绿色地生产出珍贵的天然药物分子。
与此同时，微生物共培养作为一种模拟自然生态互作的策略，在激发微生物合成潜能、提高次级代谢产物产量方面展现出独特优势。但此前，利用细菌与真菌共培养来生产HupA尚未有报道。为了突破HupA的生产瓶颈，并探索更高效的微生物制造策略，一项发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上的研究应运而生。该研究不仅成功地从石杉中分离出一株能产HupA的内生细菌，更创新性地将其与一株高效产HupA的真菌进行共培养，显著提升了目标产物的产量，并意外地发现了HupA在保护胰岛β细胞方面的新功能，为这种传统药物的应用开辟了令人惊喜的新方向。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先，他们从中国四川广元采集的石杉植株中，通过形态学观察、生理生化鉴定，并结合16S rRNA测序分析，对分离得到的内生微生物进行了系统鉴定。其次，他们建立了细菌(Serratia marcescens HL-1)与真菌(Trichoderma harzianum NSW-V)在改良马铃薯葡萄糖培养基中的共培养体系，并利用高效液相色谱(HPLC)对培养物中的HupA进行定量分析。为了确认产物的结构，他们进一步采用了核磁共振(NMR)光谱学对生物合成的HupA(BHA)和植物来源的HupA(PHA)进行对比分析。在机制探索层面，他们通过分子对接(Molecular Docking)模拟了HupA与乙酰胆碱酯酶(AChE)蛋白的结合模式，以解释其高活性。最后，为探索HupA的新功能，他们构建了棕榈酸(Palmitic Acid, PA)诱导的小鼠胰岛β细胞系Min6损伤模型，并使用CCK-8法检测细胞活力，评估BHA的细胞保护作用。
HupA-producing symbiotic strain isolated from HS
研究人员从野生石杉中分离出四株内生细菌，其中编号为3的菌株在与先前研究中从同一植物分离得到的内生真菌Trichoderma harzianum NSW-V共培养时，显示出较高的HupA生产潜力。该真菌单独培养时形成菌丝球，而与细菌共培养后，菌丝球的形态发生了变化。
Yielding of HupA
产量分析显示，3号菌株在单独培养时HupA产量为32.175±0.13 mg/L。与Trichoderma harzianum NSW-V共培养后，产量提升至32.597±0.19 mg/L。而将细菌从优化后的共培养环境中再次分离培养，产量进一步增加到32.976±0.21 mg/L。统计分析表明，尽管产量呈上升趋势，但组间差异未达到统计学显著水平(p>0.05)。然而，共培养策略成功恢复了菌株在自身产量潜力下降时的HupA合成能力，并对真菌的HupA产量也有促进作用，实现了“互惠共赢”。
Morphological characteristics
通过光学显微镜和扫描透射电子显微镜(STEM)观察，3号菌株的菌落呈圆形、光滑、湿润、乳白色、有粘性。该菌为革兰氏阴性菌，形态多样，近球形或短杆状。STEM图像清晰显示了细菌周围的荚膜、孢子，以及细菌通过直接分裂进行增殖的过程，甚至能观察到细菌内的DNA。
Physiological and biochemical identification
对该菌株进行的生理生化鉴定(包括鸟氨酸、葡萄糖、乳糖、硝酸盐还原等多项测试)结果，与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的特征相符，因此将其初步鉴定为Serratia marcescens，并命名为HL1。
The result of PCR and phylogenetic analysis
对HL1菌株进行16S rRNA基因的PCR扩增和测序，并将序列提交至GenBank(登录号MW632158)。系统发育树分析显示，HL1的16S rRNA序列与已知的Serratia marcescens菌株(如CP053378.1和CP029715.1)相似度高达99.93%，在进化树上亲缘关系最近，从而最终确认该菌株为Serratia marcescens HL1。
Structure determination by NMR
通过核磁共振氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)分析，将生物合成的HupA(BHA)与植物来源的HupA(PHA)的光谱数据进行比对。结果显示，两者的1H和13C NMR数据完全吻合，证实BHA就是具有高活性的(-)-HupA异构体，其理化性质和晶体结构与PHA完全相同。这是首次报道在共培养条件下成功生产出(-)-HupA。
Docking analysis
分子对接分析揭示了(-)-HupA高活性的分子机制。(-)-HupA(包括PHA和BHA)与乙酰胆碱酯酶(AChE)活性位点(PDB ID: 1E66)的结合亲和能高达-10.3 kcal/mol，表现为强结合力。其结合模式显示，(-)-HupA通过其带正电荷的铵基与关键氨基酸Trp279形成强烈的π-阳离子相互作用，其芳香环结构与Trp279形成T型π-π堆积相互作用。相比之下，化学合成的(+)-HupA结合亲和能仅为-4.2 kcal/mol，结合力很弱。这从结构上解释了(-)-HupA作为高效AChE抑制剂的原理。
The protective effect of HupA isolated from endophytic bacteria on cells
除了经典的抗AD活性，本研究发现了HupA一个前所未有的新功能：保护胰岛β细胞。在棕榈酸(PA)诱导的小鼠胰岛β细胞Min6损伤模型中，当PA浓度为300 μM时，细胞活力下降至58.2%。而提前用100 μM的BHA进行预处理，可将细胞活力显著提升至71.2%(与模型组相比p<0.01)。同时，单独使用BHA对细胞基础活力无影响(98.5%)，说明其保护作用并非简单的促增殖效应，而是真实的细胞保护活性。这首次揭示了HupA在胰腺β细胞保护方面的潜力。
Significance of HupA-producing Serratia marcescens HL1 and co-cultivation strategy
该研究的核心创新在于首次报道了环境细菌Serratia marcescens HL1可作为生产(-)-HupA的微生物底盘，这拓展了可用于HupA工业生产的微生物菌种库。此外，所建立的与Trichoderma harzianum NSW-V的共培养策略，协同提高了(-)-HupA的产量和稳定性。所获BHA在结构上与植物源PHA一致，验证了该生物合成路径的可靠性。这种细菌-真菌互惠的产量促进效应前所未有，凸显了共培养在优化次级代谢产物生产方面的潜力。
Mechanistic hypotheses for co-cultivation-mediated HupA yield enhancement
对于共培养提升产量的机制，作者提出了两个有待验证的假说。其一，细菌的群体感应(Quorum Sensing, QS)系统可能在共培养环境中被激活，从而调控了次级代谢产物的生物合成。其二，共培养可能激活了双方参与HupA生物合成途径的关键酶(如乙酰胆碱酯酶、萜类合酶等)的活性。这些假说需要通过后续的转录组学和蛋白质组学分析来验证。
Functional implications of HupA-mediated β-cell protection
研究发现HupA能保护胰岛β细胞抵抗代谢应激，这为其临床应用开辟了超越AD的新方向，即可能用于糖尿病等相关代谢性疾病的治疗。当然，目前的细胞活力数据仅为早期指标，其确切的体内疗效和保护机制(如对胰岛素信号通路的影响)仍需通过动物实验进一步深入研究。
Future research directions
基于现有发现，未来研究将聚焦于三个方向：1) 对共培养体系进行多组学(基因组、转录组、代谢组)整合分析，解析HupA的生物合成途径与关键基因；2) 通过基因敲除或抑制剂实验，验证群体感应和酶激活在共培养产量提升中的具体作用机制；3) 利用糖尿病小鼠模型，在体内验证HupA的胰岛β细胞保护功能及调控血糖稳态的潜力。
Conclusion
Serratia marcescens HL1作为一种土著土壤细菌，在维持植物微生物区系的同时，通过一条未被报道的生物合成途径生产(-)-HupA。本研究创新的共培养策略显著提高了HupA的产量和稳定性，为突破植物资源瓶颈、实现HupA的可持续生产提供了切实可行的微生物学解决方案。更重要的是，HupA胰岛β细胞保护新功能的发现，将其治疗潜力从神经系统疾病拓展至代谢性疾病，展现了其多靶点药理学的魅力。这项研究不仅为HupA的工业化生产奠定了坚实基础，也为其未来的临床转化与多疾病应用描绘了充满希望的新蓝图。
