同域分布的中华蟾蜍（Rana chensinensis）和Fejervarya multistriata蝌蚪的肠道微生物组及胆汁酸特征的比较分析

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Comparative analysis of the gut microbiome and bile acid profiles in sympatric Rana chensinensis and Fejervarya multistriata tadpoles

肠道菌群和胆酸代谢差异影响同域两栖类生理代谢

　　

王玉飞|王大海|王宏远

伦敦大学学院药学院，英国伦敦Gower Street WC1E 6BT

摘要

环境温度是影响两栖动物肠道微生物群的重要外源性因素，它通过改变胆汁酸（BAs）对宿主产生深刻的生理影响。即使是同域分布的两栖动物，其最佳繁殖温度也往往存在显著差异。然而，不同发育温度对同域两栖动物肠道微生物群和胆汁酸谱的影响仍不清楚。为了解决这一不足，我们比较了Rana chensinensis和Fejervarya multistriata蝌蚪在形态学、组织学、宏基因组学和代谢组学方面的差异。形态学和组织学结果显示，F. multistriata的体重指数（BMI）、肠道质量与体重比（IM/BM）以及肠上皮细胞高度（EH）较高，而R. chensinensis的体重（BM）、总长度（TL）和肠道质量（IM）较高。宏基因组学分析显示，产生胆盐水解酶（BSH）的微生物（Bacteroides、Clostridium和Enterococcus）在F. multistriata中相对丰富，而具有BAI操纵子的微生物（Dorea spp、Extibacter muris、Clostridium leptum和Proteocatella sphenisci）在R. chensinensis中相对丰富。比较代谢组学分析发现，F. multistriata中未结合胆汁酸与结合胆汁酸的比例（CA/TCA、CDCA/TCDCA和DCA/TDCA）较高，这可能抑制了病原体（如Clostridioides difficile）的丰度。此外，F. multistriata中较低的TDCA含量可能与其较强的吸收能力有关。总体而言，本研究阐明了发育温度差异对同域两栖动物肠道微生物群和胆汁酸生理代谢的潜在影响。

引言

脊椎动物的肠道微生物群组成受外源性和内源性因素的调节，包括栖息地条件（如温度）（Bletz等人，2016年；Fontaine等人，2018年）、饮食（Youngblut等人，2019年）、发育阶段（Tong等人，2020年）和生理状态（Yang等人，2023年）。两栖动物对环境变化非常敏感，其体温在很大程度上反映了环境温度（Emerson等人，2023年；Xu等人，2025a）。Fontaine等人（2018年）发现，环境温度升高会降低Plethodon cinereus的肠道微生物群多样性。另一项研究表明，冷冻处理显著增加了Nanorana parkeri肠道微生物群中Lachnospiraceae的数量（Niu等人，2023年）。此外，入侵物种Lithobates catesbeianus蝌蚪对环境温度变化的反应比非入侵物种Lithobates clamitans更快（Fontaine和Kohl，2020年）。有趣的是，将耐热物种Lithobatus clamitans的肠道微生物群移植到耐热性较低的Lithobatus sylvaticus经抗生素处理的卵中，可以提高蝌蚪的耐热性（Dallas等人，2024年）。因此，两栖动物的肠道微生物群组成容易受到环境温度的影响，肠道微生物群的变化可能会影响宿主的代谢。

肠道微生物群通过执行各种生物转化反应（包括去结合和7α-脱氢作用）来增加胆汁酸（BA）池的多样性（Collins等人，2023年；Liu等人，2024年）。胆盐水解酶（BSH）通过水解酰胺键来催化结合胆汁酸的去结合，释放未结合胆汁酸和游离氨基酸（牛磺酸或甘氨酸）（Ridlon等人，2006年）。BSH由多种革兰氏阳性菌产生（如Clostridium和Bifidobacterium），而在革兰氏阴性菌中，仅在Bacteroidetes门中检测到（Patel等人，2010年；Yao等人，2018年）。此外，一系列开创性研究证实，携带胆汁酸诱导（BAI）操纵子的肠道微生物群（包括Dorea spp、Extibacter muris、Clostridium leptum、Proteocatella sphenisci（Liu等人，2024年；Ridlon和Gaskins，2024年）能够对胆酸或鹅去氧胆酸（CA或CDCA）进行7α-脱氢，生成脱氧胆酸或石胆酸（DCA或LCA）（Hylemon等人，1980年；Harris等人，2018年；Ridlon等人，2023年）。

胆汁酸不仅有助于宿主消化和重塑肠道微生物群，还作为信号分子调节宿主代谢（Di Ciaula等人，2017年；Chiang和Ferrell，2020年；Ng等人，2024年）。初级胆汁酸在肝细胞中合成并储存在胆囊中（Collins等人，2023年）。进食后，胆汁酸被分泌到十二指肠中，通过乳化作用促进膳食脂肪的吸收（Jones等人，2008年）。肠道微生物群通过多种修饰将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸（Collins等人，2023年；Liu等人，2024年）。最近的研究表明，次级胆汁酸（如牛磺脱氧胆酸（TDCA）可以通过激活或抑制胆汁酸受体来调节宿主代谢，从而影响宿主的生长、发育和繁殖（Koz?owski等人，2020年；Sorrentino等人，2020年；Li等人，2024年）。此外，肠道微生物群对胆汁酸的生物转化增加了胆汁酸池的疏水性，这可以抑制病原体（如Clostridioides difficile）的相对丰度（An等人，2022年；Collins等人，2023年）。

同域分布的两栖动物在繁殖时间上存在差异（例如，中巴拉那河流域的Boana pulchella和Boana punctata），这可能与繁殖和发育所需的温度密切相关（Antoniazzi等人，2019年）。然而，尚不清楚同域两栖动物在繁殖期间的不同环境温度如何影响其肠道微生物群结构和胆汁酸池。尽管R. chensinensis和F. multistriata都分布在西安市，但我们观察到它们的繁殖期分别始于2月（水温：12±2°C）和6月（水温：29±3°C），这使它们成为研究这一问题的理想模型系统。

在本研究中，我们比较了R. chensinensis和F. multistriata蝌蚪的形态学和组织学参数，包括体重（BM）、肠道质量（IM）、总长度（TL）和肠上皮细胞高度（EH）。此外，还计算了两种青蛙的体重指数（BMI）和肠道质量与体重比（IM/BM）。随后，利用宏基因组学研究了R. chensinensis和F. multistriata蝌蚪之间肠道微生物群的变化，并通过代谢组学确定了肠道胆汁酸的差异。我们的研究旨在提供新的见解，了解繁殖季节期间环境温度差异如何影响同域分布的两栖动物的肠道微生物群和胆汁酸谱。

实验设计

动物和实验设计

2024年2月和6月，分别从中国陕西省Yu河流域（34°07′48″N，108°53′20″E）的一个静水栖息地收集了性成熟的R. chensinensis和F. multistriata样本。这些动物被运送到实验室，并放置在水族箱中，水中含有去氯自来水（DTW），它们在那里自然地进行交配和产卵，无需人工干预。受精卵被放置在玻璃培养皿中

组织学特征和形态学参数比较

组织学染色显示肠道屏障清晰完整，核形状规则，微绒毛排列密集整齐，杯状细胞零星分布其中（图1A-B）。测量并计算了两种物种的形态学参数，包括体重（BM）、总长度（TL）、肠道质量（IM）、肠上皮细胞高度、IM/BM和BMI，分别为202.33±7.21 mg、28.80±0.87 mm、35.38±4.96 mg、31.46±0.59 μm、0.18±0.03 mg/cm²

讨论

在本研究中，F. multistriata的体重（202.33±7.21 mg；R. chensinensis：266.70±19.14 mg）和总长度（F. multistriata：28.80±0.87 mm；R. chensinensisR. chensinensis。先前的研究表明，R. chensinensis蝌蚪从胚胎到变态大约需要两个月的时间（Mu等人，2018年）。相比之下，F. multistriata蝌蚪在大约28天内完成变态。这与我们的观察结果一致

结论

总之，我们的系统比较了同域分布的F. multistriata和R. chensinensis蝌蚪的肠道微生物群和胆汁酸谱，并假设胆汁酸池的差异可能影响耐寒性、病原体丰度和脂质吸收（图7）。我们的研究表明，在较高温度下发育的F. multistriata蝌蚪中Bacteroides、Clostridium和Enterococcus的水平较高，这可能导致未结合胆汁酸的比例较高。

CRediT作者贡献声明

王玉飞：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、软件使用、实验设计、数据管理。王大海：撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、实验设计、正式分析、数据管理。王宏远：验证、监督、资源提供、方法论设计、实验设计、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。