叔丁基酚（2,4-DTBP）及其类似物通过激活视黄酸X受体α来干扰甲状腺激素信号传导

《Environmental Research》：Di -tert-Butylphenol (2,4-DTBP) and Its Analogs Disrupt Thyroid Hormone Signaling via Activation of Retinoid X Receptor α

本研究系统评估了2,4-二特丁基苯酚（2,4-DTBP）及其类似物对甲状腺激素（TH）系统的干扰作用及机制。通过分子、细胞和体内实验，发现2,4-DTBP、1,3,5-三特丁基苯（1,3,5-TTBB）和2,4,6-三特丁基苯酚（2,4,6-TTBP）均能激活视黄oid X受体α（RXRα），通过RXRα与甲状腺激素受体（TR）异源二聚化途径干扰TH信号传导。体外实验证实这些化合物抑制垂体GH3细胞增殖，体内实验显示2,4,6-TTBP暴露可降低斑马鱼胚胎的TH水平及调控相关基因表达，转录组分析进一步揭示其影响脂质代谢、免疫应答等关键生物学过程。 hazard quotient方法评估表明，2,4-DTBP和2,4,6-TTBP在现有暴露水平下可能对健康构成风险。本研究揭示了RXRα依赖的新机制，为环境风险评价提供理论依据。

　　

任晓敏|马宇伟|刘欣欣|张晓琪|何欢|徐志祥|杨贵|黄斌|潘学军

昆明理工大学环境科学与工程学院，中国昆明 650500

摘要

二叔丁基酚衍生物，包括2,4-二叔丁基酚（2,4-DTBP）及其类似物，是常用的合成酚类抗氧化剂，在食品、环境样品和人体样本中广泛检测到。本研究通过分子、细胞和体内实验方法系统研究了2,4-DTBP及其类似物对甲状腺激素（TH）系统的干扰作用，并阐明了其作用机制。在分子水平上，荧光素酶报告基因实验、共激活因子招募实验和分子对接分析表明，2,4-DTBP、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-TTBB）和2,4,6-三叔丁基苯（2,4,6-TTBP）可作为视黄酸X受体α（RXRα）的激动剂。在细胞水平上，大鼠垂体GH3细胞的增殖实验显示，这些化合物通过激活RXRα而不是直接作用于甲状腺激素受体（TR）来干扰TR/RXRα异二聚体信号通路。在体内水平上，斑马鱼胚胎暴露实验表明2,4,6-TTBP会破坏TH水平及相关基因的表达，转录组分析进一步揭示了多个关键生物过程的紊乱。总体而言，这些发现揭示了2,4-DTBP及其类似物对TH的干扰作用，并阐明了一种通过RXRα而非TR介导的新机制。此外，使用危害商数方法评估了2,4-DTBP和2,4,6-TTBP的潜在健康风险，表明在当前人体暴露水平下这两种化合物可能对TH产生干扰作用。本研究提供了支持2,4-DTBP及其类似物环境风险评估的机制见解和毒理学证据。

引言

近年来，2,4-二叔丁基酚（2,4-DTBP）及其类似物（化学结构见图1A）的环境和健康风险逐渐受到关注（Liu和Mabury，2020）。2,4-DTBP是一种常用的合成酚类抗氧化剂，广泛应用于食品包装材料、石油化工产品、消费品和个人护理产品中（Agency，2016；Liu等，2017；Rodil等，2010）。其类似物，包括2,6-二叔丁基酚（2,6-DTBP）、2,4,6-三叔丁基酚（2,4,6-TTBP）、1,3-二叔丁基苯（1,3-DTBB）和1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-TTBB），也作为抗氧化剂或化学中间体用于工业生产（Cui等，2021；Cui等，2019；Dilek等，2008；Gunda Kamalakar，2006；Matsumoto等，1991；Nemoto，2001；Sudha等，2006）。这些物质的广泛使用导致它们在食品和各种环境介质中残留，通过迁移和生物累积途径进入人体。

现有监测研究表明，2,4-二叔丁基酚（2,4-DTBP）及其类似物在食品、环境介质和人体样本中广泛存在。在食品中，2,4-DTBP常见于鱼类、肉类和动物内脏中，其类似物2,4,6-TTBP也在鱼类产品中被检测到，而2,6-DTBP则在某些食品中被发现（Nemoto，2001）。在环境介质中，2,4-DTBP存在于水生环境、污水处理厂沉积物和室内灰尘中，表明其在环境中的普遍存在（Tang，2015；Lu，2019；Liu等，2017）。其类似物2,6-DTBP也在地表水中被报道，2,4,6-TBP在室内灰尘样本中被检测到（Tang，2015；Uguz等，2003；Liu等，2017）。

关于人体暴露，2,4-DTBP已在多种人体生物样本中被检测到，包括母乳、血清和尿液，表明人类已经接触到了这种化合物（Liu和Mabury，2018，2019；Zhang等，2020）。相比之下，关于其类似物的人体暴露数据相对有限。迄今为止，只有少数研究报道在孕妇血清中检测到2,4,6-TBP（Du等，2019；Zhang等，2020）。总体而言，这些发现表明人类可能通过多种途径接触到这类化合物，强调了评估其潜在健康影响的重要性。

毒理学研究表明，2,4-DTBP及其类似物具有广泛的生物毒性作用。2,4-DTBP可诱导大鼠肝毒性，如引起肝细胞脂肪变性和肝脏重量增加（Hirata-Koizumi等，2005）。在斑马鱼模型中，2,4-DTBP会干扰胚胎发育，导致畸形、心率降低和运动行为异常（Li等，2023），并影响成骨细胞分化（D??;ng等，2023）、肠道免疫稳态（Liu等，2022）和类固醇激素合成（Yang等，2018）。其类似物也表现出类似的毒性作用。例如，2,4,6-TBP可诱导大鼠肝细胞空泡化和坏死，伴随血脂异常和轻度贫血（Matsumoto等，1991）。2,6-DTBP被报道会导致斑马鱼胚胎的发育畸形和血管异常（Liu等，2024）。总体而言，越来越多的毒理学证据表明这类化合物存在潜在的健康风险，需要引起重视。

核受体在多种生物过程中发挥着关键的调节作用。先前的研究表明，与核受体的相互作用可能是2,4-DTBP及其类似物毒性的重要机制（Akahori等，2008；Tollefsen和Julie Nilsen，2008；Wang等，2018）。在众多核受体中，视黄酸X受体α（RXRα）作为一个关键的二聚化中心，可以与多种其他核受体形成同源二聚体和异源二聚体，如视黄酸受体（RARs）、过氧化物酶体增殖活化受体（PPARs）、甲状腺激素受体（TRs）、肝脏X受体（LXRs）、法尼醇X受体（FXRs）、维生素D受体（VDRs）和视黄酸X受体（RXRs），从而调节多种受体信号通路（Alexander等，2019；Mangelsdorf等，1995）。我们之前的研究表明，2,4-DTBP及其类似物1,3,5-TTBB和2,4,6-TTBP可以激活RXRα，随后通过PPARγ/RXRα异二聚体途径促进人类间充质干细胞分化为脂肪细胞（Ren等，2023）。最近的研究还表明，2,4,6-TBP可以通过PPARγ/RXRα途径激活RXRα并促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化（He等，2025）。总体而言，这些证据表明RXRα的激活可能是这类化合物毒性的关键分子启动事件，这种激活可能进一步影响RXRα依赖的异二聚体信号通路。

TR是RXRα的重要二聚化伙伴，TR/RXRα异二聚体是调节甲状腺激素（TH）调控基因表达的核心转录单元，在生长、发育和代谢稳态等生物功能的调节中起关键作用（Mangelsdorf等，1995；Yen，2001）。基于我们之前的发现，我们提出科学假设：2,4-DTBP及其类似物激活RXRα可能会进一步干扰TR/RXRα通路，从而引发TH系统干扰作用。为了验证这一假设，本研究建立了包括分子、细胞和体内水平的系统研究框架。首先，在分子水平上，我们使用荧光素酶报告基因实验和共激活因子招募实验来评估2,4-DTBP及其类似物（1,3-DTBB、2,6-DTBP、1,3,5-TTBB和2,4,6-TTBP）对RXRα的激活作用，并结合分子对接分析来阐明它们与RXRα的结合模式。其次，在细胞水平上，我们使用内源性表达TR/RXRα异二聚体的大鼠垂体GH3细胞，通过细胞增殖实验研究这些化合物是否通过RXRα干扰TR/RXRα信号通路。最后，在体内水平上，我们使用斑马鱼胚胎模型通过测量TH水平和相关基因的表达来评估代表性化合物2,4,6-TBP是否引发TH系统干扰作用，并通过转录组分析进一步探讨其潜在的毒性作用和作用机制。此外，我们还使用危害商数方法评估了2,4-DTBP和2,4,6-TTBP的潜在健康风险。总之，本研究旨在探讨2,4-DTBP及其类似物是否具有TH干扰作用，并阐明一种通过RXRα介导的新毒理学机制。

化学物质和试剂

2,4-DTBP（CAS：96-76-4，纯度>98%）、2,6-DTBP（CAS：128-39-2，纯度>98%）、2,4,6-TTBP（CAS：732-26-3，纯度>98%）、1,3-DTBB（CAS：1014-60-4，纯度>98%）和1,3,5-TTBB（CAS：1460-02-2，纯度>98%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。甲状腺激素（T3，CAS：6893-02-3，纯度>98%）和盐酸胺碘酮（TR拮抗剂，CAS：19774-82-4，纯度>98%）也来自Sigma-Aldrich。RXRα拮抗剂UVI3003（CAS：384347-55-5，纯度>98%）也来自Sigma-Aldrich。

2,4-DTBP及其类似物对RXRα的激活

为了评估2,4-DTBP及其类似物对RXRα的激活作用，使用了基于GAL4-RXRα嵌合体的荧光素酶报告系统（图1B）。所有化合物最初在0.31–20 μM的浓度范围内进行筛选。结果显示，2,4-DTBP在5 μM时开始显著激活RXRα，表现出明显的剂量依赖性关系（图1C）。由于1,3,5-TTBB和2,4,6-TBP的活性更强，因此进一步检测了更低的浓度（0.018–1.25 μM）。

讨论

目前，关于2,4-DTBP及其类似物的毒性和作用机制的研究非常有限。本研究在分子、细胞和体内水平系统评估了这类化合物的TH干扰作用。我们的结果揭示了一种新的作用机制，即这些化合物通过激活RXRα而不是直接作用于TR，从而启动TR/RXRα异二聚体通路，最终引发TH干扰作用。

关于

结论

本研究在分子、细胞和体内水平系统评估了2,4-DTBP及其类似物的TH干扰作用和作用机制。在分子水平上，RXRα荧光素酶报告基因实验、共激活因子招募实验和分子对接分析一致表明，2,4-DTBP、1,3,5-TTBB和2,4,6-TBP可以结合并激活RXRα。在细胞水平上，GH3细胞增殖实验进一步证实了这些化合物的影响。

CRediT作者贡献声明

徐志祥：资源提供。杨贵：资源提供。何欢：实验研究。刘欣欣：实验研究。张晓琪：实验研究。任晓敏：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，实验研究，正式分析。马宇伟：方法学研究，实验研究，正式分析。黄斌：资源提供。潘学军：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思

未引用的参考文献

Berger和David，2002；D??ng等，2023；Forman等，1995；Gunda Kamalakar和Sugi，2006；IPCS，W. H. O. W. I. P. O. C. S，2009；Le Maire等，2009；Li等，2004；Lu和De Silva，2019；Nemoto等，2001；Tang等，2015；Tollefsen和Nilsen，2008；Weitzel和Iwen，2011。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究生成或分析的所有数据均包含在已发表的文章及其补充信息文件中。RNA-seq数据将在手稿接受后公开发布在公共存储库中（例如NCBI GEO）。

伦理声明

所有斑马鱼实验均遵循机构指南，并获得了昆明理工大学动物伦理委员会的批准。

生成式人工智能使用声明

作者声明在撰写本文时未使用任何生成式人工智能工具。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号22476075、22176076、22276082）和云南省重大科技项目（资助编号202302AG050001）的财政支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。