《Estuarine, Coastal and Shelf Science》：Comparison of Methods for the Enumeration of Heterotrophic Bacteria in Seawater from the Adriatic Sea: Implications for Aquaculture
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定量异养菌方法比较研究显示，无菌海水与Marine Agar组合显著提高细菌回收率，而Yeast Extract Agar普遍偏低，EasyDisc YEA方法效果最佳。
达米尔·卡佩塔诺维奇（Damir Kapetanovi?）|阿里亚娜·切诺夫（Arijana Cenov）|德拉热恩·卢希奇（Dra?en Lu?i?）|布里吉塔·诺沃塞尔（Brigita Novosel）|达里娅·武基奇·卢希奇（Darija Vuki? Lu?i?）
鲁杰尔·博什科维奇研究所（Ru?er Bo?kovi? Institute），克罗地亚萨格勒布（Zagreb），邮编10000
摘要
可靠地计数可培养的异养细菌对于海洋微生物监测至关重要。然而，实验室程序的差异可能会显著影响异养平板计数（HPC）的结果，并限制不同研究之间的可比性。本研究比较了三种稀释液（无菌海水、0.9% NaCl溶液和Milli-Q水）和三种培养基（海洋琼脂、酵母提取物琼脂-YEA和EasyDisc YEA），并使用涂布平板法和倾注平板法对从水产养殖相关地点采集的10个亚得里亚海海水样本中的异养细菌进行了定量分析，所有分析均在相同条件下进行。为了解释样本间的变异性，对经过log10转换后的计数结果进行了线性混合效应模型分析，其中样本身份作为随机效应。检测类型和稀释液对细菌回收率有显著影响。海洋琼脂和EasyDisc YEA通常比酵母提取物琼脂产生更高的log10(CFU/mL)值，而无菌海水产生的计数显著高于Milli-Q水。交互效应有限，表明样本间的方法学差异是一致的。这些发现表明，方法选择会系统性地影响HPC结果，强调了在基于培养的海洋微生物监测中采用标准化和透明报告程序的重要性。
引言
亚得里亚海作为地中海的西北部海域，在水产养殖和渔业发展中起着关键作用，尤其是在克罗地亚境内，这两产业构成了该国经济的重要支柱。这个生物多样性丰富的海洋生态系统为许多具有经济价值的物种提供了理想的生长条件，包括欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）和金头鲷（Sparus aurata）（FAO, 2024）。克罗地亚的水产养殖结合了传统技术和现代科技，继续满足全球对鱼类产品的需求，同时面临着与生产增长、资源利用以及沿海生态系统潜在环境压力相关的可持续性挑战（FAO, 2023）。克罗地亚国家水产养殖发展计划（NPRA）提出了支持该行业可持续发展的措施，包括水产养殖区的空间规划、环境监测和生产效率的提升。根据NPRA，实施这些措施预计不会对环境或生态网络产生显著负面影响。潜在的负面影响，如环境压力和资源需求的增加，被认为是局部性的（农业部，2021年）。维持适当的环境条件，包括微生物稳定性，对水产养殖作业和环境监测至关重要。海水的微生物分析在海洋监测和水产养殖相关环境中被广泛使用（FAO, 2022）。异养平板计数（HPC），以前称为标准平板计数，是一种用于估算水中活的、可培养的异养细菌数量的方法（EPA, 2014）。在海洋系统中，HPC值可能因生态条件和方法学因素而有所不同。了解不同细菌定量方法的有效性对于准确解释和比较HPC结果至关重要。
基于培养的异养细菌计数方法在海洋研究中仍被广泛使用；然而，实验室程序的差异可能会影响细菌的回收率，并限制数据集之间的可比性（Lebaron等人，2001；Ganesh等人，2010；Seetharaman等人，2023）。传统的HPC测定方法包括使用各种稀释液、培养基和接种技术（Simisu等人，1983；Avsar和Berber，2014；Karbasdehi等人，2017；Vijayan等人，2022）。每种方法都有其特定的优势和局限性，这些都会影响最终结果（Lebaron等人，2001）。例如，使用无菌海水、盐水或Milli-Q水作为稀释液可能导致细菌细胞保存程度的不同（Torrella和Morita，1981；Ganesh等人，2010；Seetharaman等人，2023；Vijayan等人，2022）。培养基的选择，如酵母提取物琼脂、海洋琼脂或人工培养基，也会影响某些细菌物种的生长和检测（Buck，1974；Ganesh等人，2010；Kudaka等人，2010；Kapetanovi?等人，2012；Sun等人，2019）。
本研究的目的是评估三种不同稀释液和三种培养基与两种接种技术（涂布平板法和倾注平板法）结合使用，在相同海水样本中计数可培养异养细菌时的相对效率。该研究旨在评估在受控分析条件下细菌回收率的方法学差异，而不是评估空间变异性或水产养殖的影响。
采样
在一次采样活动中共收集了10个海水样本。在亚得里亚海北部站点（图1），在两个位置采集了海水样本：一个位于网箱区域内（北纬45°01'23.3"，东经14°21'17.7"），另一个位于距离网箱约500米的非网箱区域（北纬45°01'07.1"，东经14°21'06.1"）。在每个位置，分别在四个深度采集样本：水面、6米深处和接近底部的位置。在亚得里亚海中部站点（图1），在网箱区域内采集了海水样本（北纬43°50'34.5"）
结果
本研究分析了10个样本，这些样本代表了亚得里亚海中不同位置和深度的样本。分析数据见表1，其中包含了使用酵母提取物琼脂（YEA）和海洋琼脂（MA）以及EasyDisc YEA（ED YEA）通过涂布平板法（SP）和倾注平板法（PP）测得的异养细菌的平均值（Av）、标准差（±Dev）、最小值（Min）和最大值（Max）。所使用的稀释液为无菌海水。
讨论
本研究结果显示，不同方法和培养基在海水异养细菌计数方面的性能存在显著差异。这些差异突显了在比较不同海洋研究中的异养平板计数（HPC）数据时方法学一致性的重要性（Buck，1974；Buck和Cleverdon，2003）。EasyDisc YEA方法在所有稀释液条件下始终显示出最高的细菌计数，表明其回收率更高。
结论
准确计数可培养的异养细菌需要仔细考虑方法学因素，因为稀释液的类型、培养基和平板接种技术会显著影响细菌的回收率。在测试的方法中，EasyDisc YEA在测试条件下的回收率与海洋琼脂相当，而酵母提取物琼脂通常产生的log10(CFU/mL)值较低。无菌海水在实现更高细菌计数方面比Milli-Q水更有效。
作者贡献声明
达米尔·卡佩塔诺维奇（Damir Kapetanovi?）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、调查、数据分析。布里吉塔·诺沃塞尔（Brigita Novosel）：初稿撰写、数据管理。德拉热恩·卢希奇（Dra?en Lu?i?）：审稿与编辑、监督、数据管理。达里娅·武基奇·卢希奇（Darija Vuki? Lu?i?）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目管理、资金筹集、概念构思。阿里亚娜·切诺夫（Arijana Cenov）：审稿与编辑、数据验证、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了“Primorje-Gorski Kotar县沙滩和海水中真菌数量与多样性环境监测”项目（UNIRI-ISKUSNI-BIOMED-23-245）的资助。作者还感谢AqADAPT项目（HRZZ IP-2018-01-3150）在物流支持和提供水产养殖站点方面的帮助，这些站点使得本研究能够进行海水采样。
