高效脱氮菌株的机制分析与应用：脱氮特性、途径及最佳接种量

《Journal of Environmental Management》：Mechanism analysis and application of highly efficient nitrogen-removing strains: Nitrogen-removal characteristics-pathways and optimal inoculum size

氮污染控制；异养硝化-好氧反硝化菌株；脱氮途径分析；响应面法优化；环境适应性

　　

廖丽文|李子璐|潘 luqing|席泽彦|李腾|李娜|周玉龙

教育部海洋大学海洋养殖重点实验室，中国山东省青岛市 266003

摘要

氮（N）污染已成为21世纪阻碍全球水生生态系统可持续发展的关键环境问题。特别是在水产养殖水中，氮的积累已成为主要污染物，严重限制了水产养殖的绿色健康发展。本研究从虾类养殖环境中分离出两种高效且安全的异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）菌株，鉴定为Yanghufangia pacifica HHVEN1和Glutamicibacter nicotianae SDVEA2。在单一或混合无机氮条件下，这两种菌株均能去除超过82.29%的氨氮（NH₄⁺-N）和亚硝酸盐氮（NO₂^?-N），并在广泛的温度、pH值、盐度和C/N比范围内保持高效性能。值得注意的是，HHVEN1在18小时内完全去除了NH₄⁺-N，而SDVEA2在36小时内表现出特别强的硝酸盐去除能力（99.43%）。通过氮物种的时间进程分析、氮去除功能基因、酶活性和抑制剂检测发现，HHVEN1主要遵循经典的HN-AD途径，并显示出从氨到硝酸盐的捷径以及可能的直接将铵转化为气态氮的途径。相比之下，尽管SDVEA2缺乏可检测到的amoA、hao和nxr基因，但它主要通过硝酸盐和亚硝酸盐将铵转化为气态氮。Haldane动力学模型被用来描述底物浓度与氮去除之间的关系，表明其适应了中低氮水平。利用响应面方法（RSM）建立了连接盐度、氮源和接种剂大小的多因素耦合模型，并提出了在动态水环境中计算最佳接种剂大小的方法。本研究为水产养殖及相关水环境中的氮污染控制提供了科学支持。

引言

氮污染已成为21世纪限制全球水生环境可持续发展的关键环境问题（Kanter和Searchinger，2018年）。在农业生产系统中，氮管理效率低下（全球氮利用效率仅为43%-47%），导致大量活性氮的流失，从而引起水体富营养化，严重威胁水生生态系统的健康（Steffen等人，2015年）。总氮（TN）负荷在不同废水和径流来源中差异显著：农业排水中的氮含量可能低至约5 mg/L，而典型农业生态系统的地表水中TN中位数为约10–23 mg/L；而来自畜禽养殖的高浓度废水中的氮含量可达到数百至数千mg/L。相比之下，水产养殖废水中的氮含量通常处于中低水平（约5–20 mg/L），但其持续且波动的排放仍对接收水体造成长期压力（Cheng等人，2014年；Xu等人，2014年；Zhou等人，2024年）。

水产养殖在保障全球粮食安全和人类营养供应方面发挥着重要作用（Said等人，2025年），为了提高产量经历了快速集约化发展，但这导致了养殖水中NH₄⁺-N的积累。这种积累不仅危及水生动物健康，也成为限制水产养殖绿色发展的关键瓶颈（G. Li等人，2023年）。微生物去除氮的方法因其经济性、高效性和无二次污染而成为主要的绿色降解技术（Hu等人，2024年）。尽管已从养殖环境中分离出高效的本土氮去除菌株，但其实际应用仍面临两个瓶颈：首先，环境适应性的局限性导致在波动的田间条件下氮去除性能不稳定；其次，为了确保菌株成为优势物种，接种剂大小与环境因素密切相关，但其优化策略尚不明确。现有研究主要集中在单因素效应（如温度、盐度、pH值、C/N比）上，例如通过单变量实验评估Pseudomonas aeruginosa SH3的氮去除效率（Zhou等人，2025年）。这些研究忽略了水环境中氮源变量与核心环境因素之间的动态相互作用，使得在多因素交互条件下难以实现高效氮去除。因此，筛选具有强环境适应性的高效氮去除菌株、全面考虑养殖环境因素的变化以及建立动态环境中计算最佳接种剂大小的方法已成为亟待解决的科学问题，以控制水产养殖中的氮污染。

自1988年发现异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌以来（Robertson等人，1988年），它们在好氧条件下同时进行硝化和反硝化的特性成为研究热点（Fang等人，2024年）。目前，HN-AD细菌已从各种环境中分离出来，如污水处理厂（Ma等人，2025年）和池塘沉积物（Ou等人，2024年）。它们表现出不同的氮去除特性和途径，这些特性直接关系到氮去除效率（Zheng等人，2024年）。研究表明，除了传统的完整HN-AD途径外，筛选出的HN-AD菌株还表现出其他途径，如羟胺（NH₂OH）→ NO₃^?-N和NH₄⁺-N→NH₂OH→一氧化氮（NO）→一氧化二氮（N₂O）→氮气（N₂）（He等人，2022年；Xie等人，2023年）。这些途径减少了中间产物（如NO₂^?-N、N₂O）的积累，防止了细菌受到抑制，减少了温室气体排放（N₂O的温室效应是CO₂的298倍），并加速了反应过程（Zheng等人，2024年）。然而，当前的途径分析（依赖于底物降解和基因扩增）未能完全揭示代谢网络（Huan等人，2024年）。因此，全面分析HN-AD菌株的氮去除特性和途径对于筛选高效氮去除菌株和提高氮去除效率至关重要。

水环境复杂多变，显著影响氮去除菌株的生长和氮去除效率。在这些因素中，氮去除菌株的接种剂大小是平衡氮去除效率和经济性的关键，在益生菌的工程应用中仍是一个挑战。生物动力学模型为微生物生长速率与底物之间的关系提供了新的见解。Haldane模型已广泛应用于微生物生产/降解研究（Mathur等人，2008年），如醋酸裂解甲烷生成（Lokshina等人，2001年）和酚类降解（Haitham Qaralleh等人，2022年），但在氮去除菌株降解研究中应用较少。此外，水环境中的多种环境因素显著影响微生物的氮去除效率（Lou等人，2023年）。为了实现最大氮去除效率，必须综合考虑多种环境变量（Zhang等人，2024年）。作为多变量优化工具，RSM已在食品和环境领域得到广泛应用（Choi等人，2019年）。例如，Zhang等人使用Box-Behnken设计-响应面方法（BBD-RSM）优化了影响Paracoccus sp. QD-21氮去除的因素（温度、C/N比、pH值和旋转速度），实现了氮去除效率的精确调控（Zhang等人，2024年）。然而，如何在复杂的动态水环境中更准确地预测HN-AD菌株的最佳接种剂大小？因此，使用RSM建立环境因素与益生菌接种剂大小之间的多因素交互预测模型值得深入研究。

Litopenaeus vannamei是全球水产养殖中最具生产力的经济型虾类。本研究从其养殖环境中分离并鉴定出两种HN-AD菌株，研究了它们的生长特性和氮去除效率，并全面分析了这些菌株的环境适应性和氮去除途径。此外，还使用RSM建立了环境因素与益生菌接种剂大小之间的多因素耦合预测模型，并首次开发了在动态环境中计算益生菌最佳接种剂大小的方法。基于此，我们提出了以下假设并进行了验证：（H1）本土HN-AD菌株能够在盐度、pH值、温度和C/N比的大范围内保持高NH₄⁺-N/NO₂^?-N去除效率；（H2）两种菌株在遗传和酶结构上的差异导致了它们氮去除途径的不同，从而产生了不同的氮去除性能；（H3）整合关键环境变量的响应面方法（RSM）模型可以定量且可行地预测动态水环境中的最佳接种剂大小。这为水环境中的氮污染控制和管理提供了科学支持。

部分摘录

培养基的制备和氮去除微生物的分离

样品采集自海南省海口（110°33′E, 20°03′N）和山东省东营（118°58′E, 37°44′N）的Litopenaeus vannamei养殖池塘，包括水面（水面下0-20厘米）、中层（水面下50-80厘米）和底层（沉积物上方10-20厘米）的水样以及排水口的出水，用于菌株筛选。富集培养基（EM-1、EM-2）、筛选培养基（SM-1、SM-2）、2216E液体/固体培养基、异养硝化培养基（HDM）的配方如下：

高效且安全的氮去除菌株的筛选和鉴定

从虾类养殖环境中分离出两种高效的氮去除细菌HHVEN1和SDVEA2。序列比对和系统发育树分析（图1A）确定HHVEN1（GenBank: OR 864298）为Yangia pacifica（与TCA-082菌株的相似度为99.71%），SDVEA2（GenBank: OR 864302）为Glutamicibacter nicotianae（与AI5a菌株的相似度为99.90%）——这是首次报道这两种属具有氮去除潜力。先前关于Yangia的研究主要集中在

结论

从虾类养殖环境中筛选出两种高效、安全且环境适应性强的氮去除菌株HHVEN1和SDVEA2。确认HHVEN1具有完整的HN-AD途径，即NH₄⁺-N→NO₃^?-N途径，以及可能的NH₄⁺-N→气态氮途径。SDVEA2主要遵循NH₄⁺-N→NO₃^?-N→NO₂^?-N→气态氮途径，并辅以NO₃^?-N→气态氮途径。这两种氮去除菌株的Haldane动力学模型已成功建立

CRediT作者贡献声明

廖丽文：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学，研究，数据分析，概念化。李子璐：方法学，研究。潘 luqing：资源获取，概念化。席泽彦：方法学，研究。李腾：方法学，研究。李娜：方法学，研究。周玉龙：方法学，研究。

伦理批准和参与同意

所有实验程序均符合中国青岛海洋大学机构关于实验动物护理和使用的指南，相关方案已获得该机构的批准。

资助

本研究得到了广东省重点研发计划的支持，项目名称为“海洋池塘系统的生态工程养殖技术和模式”（2020B0202010009）。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：潘 luqing报告与本工作有关，该工作得到了广东省重点领域研发计划（2020B0202010009）的支持，包括资金资助。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响所报告工作的财务利益或个人关系。