食物限制和热应激作为大型溞（Daphnia magna）性繁殖及甲壳形成的独立诱导因素 Paola Andrea Alméciga-Díaz 和 Ricardo Vieira Rodrigues

《Fishes》：Food Restriction and Thermal Stress as Independent Inducers of Sexual Reproduction and Ephippia Production in Daphnia magna Paola Andrea Alméciga-Díaz and Ricardo Vieira Rodrigues

　　摘要：大型溞（Daphnia magna）表现出生殖可塑性，在压力条件下会在无性生殖和有性生殖之间切换，并形成休眠卵（ephippia）。本研究在受控条件下进行了两次连续60天的实验（每次处理一个实验组），评估了食物限制和热应力作为诱导休眠卵形成的独立因素。在第一次实验中，新生溞被喂食20 mg L?1、10 mg L?1或0.5 mg L?1的Arthrospira platensis。在第二次实验中，新生溞被维持在10、15、20、25和30°C的温度下，并提供最佳食物供应。对照组（20°C）条件下仅发生无性生殖，每天喂食20 mg L?1的A. platensis时，产卵数量达到13,170 ± 515个。相反，严重食物限制（0.5 mg L?1）使无性生殖减少了99.3%，并显著增加了休眠卵的产生（726 ± 10个）。极端温度（10°C和30°C）也诱导了休眠卵的形成，其中30°C时数量最多（85 ± 7个）。休眠卵的质量受压力影响：中等食物限制（10 mg L?1）条件下产生的双卵休眠卵比例最高（82.3%），孵化成功率也最高（82%），而严重食物限制或高温（30°C）虽然增加了休眠卵的数量，但降低了其存活率。这些发现表明，诱导大型溞有性生殖存在不同的阈值。该研究为休眠卵的生产提供了标准化方案，具有在水产养殖、生态毒理学和保护研究中的应用价值。

1. 引言
溞类（Daphnia spp.）是水生生态系统中的关键生物，在食物链中处于重要位置[1]，并且广泛用作淡水鱼幼体和稚鱼的活饵[2]。它们在水产养殖中的价值在于易于饲养、适宜的大小、良好的营养组成[2,3]以及营养物质的生物封装能力[4]。溞类具有较短的生命周期和显著的生殖可塑性，能够在无性生殖和有性生殖之间切换[1]。在最佳环境条件下，雌性通过二倍体卵产生后代；而在温度波动[1,5]、食物供应有限[6,7]、光照周期变化[6,7]、通过化学信号检测到捕食者[1]或水中存在金属[5]等压力条件下，其生殖策略会发生变化。这种变化会导致产生单倍体卵，这些卵在受精后会形成休眠卵（ephippia）[8]。休眠卵使大型溞能够在不利环境中存活，有助于扩散并维持遗传多样性，也是种群持续存在的关键适应机制[1]。因此，它们在水产养殖中对于培养物的储存和后续激活具有重要意义[9]。

食物供应的减少，尤其是浮游植物的减少，是环境恶化的信号，会触发休眠卵的形成，作为种群持续存在的适应性反应[10]。低食物水平（≤0.05 mg/个体）会刺激[11]，使资源分配转向有性生殖，优先满足产生休眠卵所需的能量[11]。然而，这些休眠卵的质量和存活率可能受到饮食营养组成的影响[12,13]。

相比之下，温度是调节生理过程（如新陈代谢、生长和生殖）的关键环境因素[14]。在溞类中，次优或极端温度会作为非生物刺激，终止无性生殖阶段并启动有性生殖，通过形成休眠囊来确保生存[5,14]。这种对热应激的反应会加速Moina micrura的发育（蜕皮和成熟）[15]，并改变基本的生殖参数，如繁殖力和早熟性[16]。鉴于全球变暖对水生系统构成重大威胁[17]，了解热应力对自然暴露于显著温度变化的生物的影响至关重要。因此，本研究关于大型溞休眠卵形成的诱导具有双重重要性：生态学上，有助于确保种群持续存在；应用上，因其在水产养殖、生态毒理学和水环境管理中的潜在用途。尽管先前的研究已经确定食物限制、温度变化和光照周期是无性生殖的关键诱导因素[18,19]，但这些因素通常是结合在一起进行评估的。Kleiven等人[18]表明，诱导休眠卵需要三个同时发生的刺激（短光照周期、高种群密度和食物限制），没有单一因素足够。Deng[19]也报告了D. pulex中光照周期和食物的基因型-环境相互作用，但这些因素仅在实验室条件下单独评估，未在受控孵化场环境中进行研究。此外，目前缺乏高效且可重复地在孵化场条件下诱导休眠卵产生的标准化和定量方案，同时评估囊的质量参数。为了解决这一空白，本研究分为两个阶段进行评估：（1）食物限制对大型溞休眠卵产生的影响；（2）不同孵化温度对其形成、存活率和孵化成功率的影响，以开发适用于水产养殖生产系统的方案。我们假设食物限制和热应力都能独立诱导大型溞的有性生殖，但根据应力强度的不同，对休眠卵的数量和质量会产生不同的影响。

2. 材料与方法
2.1. 实验生物和预处理
实验使用的是从Tropcol观赏鱼场（哥伦比亚波哥大）获得的溞类大型溞（Daphnia magna）。在实验开始前，选择了7至10天大的无性生殖成年雌性，这个年龄范围确保了最佳的生殖成熟度[20]，平均体长为2.5 ± 0.2毫米。这些生物健康，实验前没有表现出压力或休眠卵产生的迹象。雌性被维持在2升的容器中，密度为10个个体/升，水质量参数受控，温度为20°C，pH值为8.0，溶解氧为6.0 mg/L，碱度为120 mg/L，总氨（NH3 + NH4+）浓度≤0.5 mg/L。每周监测两次水质参数，并每周更换10%的水量，遵循大型溞的标准培养方案[21]。光照周期为14小时光照：10小时黑暗，光照强度为3000 lx，使用人工白光照明。饲料为商业级螺旋藻粉（Arthrospira platensis；Naturela?，哥伦比亚波哥大；干基含64%粗蛋白、26%总碳水化合物和9.6%膳食纤维），每天分三次喂食（08:00、14:00和20:00），浓度为20 mg L?1。从这些培养物中收集24小时以内的新生溞并分配到实验组中。

2.2. 实验设计
研究分为两个连续的60天实验，分别独立评估食物限制和热应力对大型溞休眠卵产生的影响。
2.2.1. 第一次实验：食物限制的影响
为了评估食物供应对休眠卵诱导的影响，将24小时以内的新生溞分配到圆形平底15升容器中，密度为10个个体/升，每个处理设置三个重复组：对照组（D20）每天喂食20 mg L?1的A. platensis，中等限制组（D10）每天喂食10 mg L?1，严重限制组（D0.5）每天喂食0.5 mg L?1，每个容器视为一个独立的实验单元。通过每天移除新生溞来维持10个个体的种群密度，保留初始的雌性。食物每天分三次喂食（08:00、14:00和20:00）。水质参数和部分换水方案与亲鱼预处理阶段相同。

2.2.2. 第二次实验：热应力的影响
为了评估热应力对休眠卵诱导的影响，将24小时以内的新生溞分配到2升玻璃容器中，密度为10个个体/升，每个处理设置三个重复组，每个容器视为一个独立的实验单元。所有组每天喂食20 mg L?1的A. platensis。在整个实验过程中，通过每天移除多余的新生溞来维持10个个体的种群密度。评估了五个温度：对照组（TC：20°C）和四个热应力处理组。T25（25°C）和T30（30°C）使用浸入式恒温器控制，而T10（10°C）和T15（15°C）使用外部水浴和间接冰瓶旋转系统控制。温度从适应条件（20°C）开始逐渐调整，每小时升高1°C，以减少热冲击。水质参数和部分换水方案与第一次实验相同。

2.3. 生物测量
在每次实验的第14天，对每个处理的21只雌性进行生物测量，区分无性生殖的雌性和携带休眠卵的雌性。使用Nikon SMZ800N立体显微镜（Nikon Corporation，日本东京）和ImageJ软件（版本1.54r，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）拍摄的数字图像，测量休眠卵的尺寸。测量休眠卵的体长（从前眼边缘到尾刺基部的直线距离，不包括刺本身[22,23]和最大宽度。

2.4. 休眠卵和新生溞的处理
每天监测两种处理组的新生溞产生和休眠卵的释放情况。使用巴斯德吸管从容器底部收集释放的休眠卵，计数后转移到根据相应处理标记的培养皿中。随后，在室温（17°C）和黑暗条件下干燥48小时，然后在4°C下储存20天以保持其完整性[24]。每天收集通过无性生殖产生的新生溞，计数并隔离，以避免对实验的干扰。储存期结束后进行休眠卵的脱壳处理。按照Paes等人（2016a）[25]验证的方案，将每个处理的休眠卵放在100微米的浮游动物网网上，浸入10毫升2%次氯酸钠溶液中20分钟。使用Nikon SMZ800N立体显微镜初步测试确认，该时间足以使卵完全透明而不影响其完整性。随后，用蒸馏水冲洗休眠卵以去除残留溶液，并在Nikon SMZ800N立体显微镜下检查。记录每个休眠卵中的卵数（0、1或2个）[25]。

2.5. 休眠卵孵化试验
对每个处理的脱壳休眠卵进行孵化试验以评估其存活率。将它们放入2升圆锥形塑料容器中，水中添加20 mg L?1的A. platensis，保持24小时连续光照和空气石提供的恒定通气条件[24]。每天两次（08:00和20:00）监测容器中的情况，并记录新生溞孵化的日期。

2.6. 统计分析
使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验分别评估数据的正态性和同方差性。符合这两个假设的数据使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey’s HSD事后检验；非参数数据使用Kruskal–Wallis检验后进行Dunn的事后检验。效应量（ε2）计算公式为ε2 =(?? ??? +1)/(?? ???)，其中H是Kruskal–Wallis统计量，k是组数，N是总观察数[25]。显著性水平设定为p < 0.05。使用主成分分析（PCA，FactoMineR包版本2.12）识别区分不同处理的关键变量。创建这些变量的雷达图，使用标准化数据进行综合可视化。对于雷达图，采用两种方法对数据进行标准化：min–max重标定（值 ? min)/(max ? min) × 100，得到0–100%的刻度；以及相对于最大值的标准化（值/max），得到0–1.0的刻度。所有分析均使用R（v4.5.1，R Foundation for Statistical Computing）软件进行。

3. 结果
3.1. 第一次实验：食物限制对生殖策略和休眠卵产生的影响
食物供应引发了大型溞的相反生殖反应，表现为无性生殖和有性生殖之间的明显权衡。在对照组（D20）中，生殖几乎完全是无性的；而在中等限制（D10）下，生殖策略转向混合投资的无性和有性生殖。在严重限制（D0.5）下，无性生殖几乎完全被抑制，而休眠卵的产生达到最高水平（图1；表1）。所有无性生殖参数都显示出非常大的效应大小，除了峰值释放日（ε2 = 0.30，中等程度，p = 0.138）。这导致了一种几乎完全的战略逆转，两种繁殖模式的峰值输出发生在相反的食物条件下，并且没有重叠。图1显示了食物限制对Daphnia总后代生产和卵囊形成的影响。D0.5 = 0.5 mg L?1 A. platensis day?1；D10 = 10 mg L?1 A. platensis day?1；D20 = 20 mg L?1 A. platensis day?1。条形图或点上不同的字母表示处理之间的显著差异（p < 0.05）。表1显示了食物限制对Daphnia magna无性生殖的影响：新生后代数量、成熟度和种群动态。随着食物限制的加剧，无性生殖期缩短，这一模式与有性生殖的情况完全相反，在食物限制的处理中，卵囊生产的持续时间显著增加，在D0.5时达到最大值。同样，首次无性生殖的年龄也因食物短缺而延迟。相比之下，不同食物限制处理下的首次卵囊形成年龄相似，大约在9.5天，这表明一旦超过最低压力阈值，有性生殖就会开始，而随后的卵囊输出则取决于压力强度。早期生殖效率也反映了这种权衡。在D0.5处理中，早期释放的后代比例高于D20处理。然而，D0.5处理中的后续生长受到限制，在D20处理中最为明显。在有性生殖中，D0.5处理中的早期卵囊生产显著更高，几乎是D10处理的两倍。所有与卵囊生产相关的显著变量都显示出较大的效应，而非显著特征的影响可以忽略不计（ε2 = 0.00）（表1和表2）。表2显示了食物限制对Daphnia magna有性生殖表现、诱导和种群动态的影响。这些结果揭示了数量和质量之间的明显权衡：在严重压力（D0.5）下，卵囊输出最大化；而在中等压力（D10）下，卵囊质量和孵化潜力得到优化。D10处理产生的卵囊质量更高，双卵卵囊的比例也更多。相比之下，D0.5处理中单卵卵囊和空卵囊的比例显著更高（图2A）。这种组成差异直接影响了孵化率，因为在D10处理中双卵卵囊的孵化率明显更高，而单卵卵囊的孵化率在各处理间相似（图2B）。图2显示了食物限制对Daphnia magna卵囊组成和存活率的影响。（A）每种处理下产生的卵囊（空卵囊、单卵卵囊、双卵卵囊）中卵含量的百分比分布。（B）卵囊中单卵卵囊和双卵卵囊的孵化成功率。条形图上不同的字母表示处理之间的统计显著差异（p < 0.05）。在（B）中，使用Kruskal–Wallis检验后进行Dunn的事后检验，并应用Bonferroni校正。饮食变化引起了D. magna的显著形态测量变化。尽管无性生殖雌性的长度在各处理间保持相似，但在食物限制（D0.5和D10）下，其宽度减小，导致前者的长宽比（LW）更高。携带卵囊的雌性比无性生殖雌性更小，尤其是在D0.5处理中差异最大。此外，卵囊的大小直接响应食物可用性，D10处理下的卵囊在长度和宽度上都更大。大多数形态测量特征显示出较大的效应大小（ε2 ≥ 0.57），尤其是在携带卵囊的雌性和卵囊尺寸上（ε2 ≥ 0.71）（表3）。表3显示了不同食物条件下Daphnia magna无性生殖雌性、携带卵囊的雌性和卵囊的形态测量参数。D20处理表现出以无性生殖为主（高后代产量和延长的生殖期）且不产生卵囊的特征，而D0.5处理则表现出相反的模式，即对卵囊的最大投资和最小的无性生殖活动。尽管如此，D10处理呈现出中间的平衡特征，卵囊的孵化率更好（图3）。图3显示了受食物限制的Daphnia magna的生殖期、早期生殖、后代数量、孵化率和总卵囊产量的PCA分析。雷达图显示了处理D20（20 mg L?1 A. platensis day?1，对照组）、D10（10 mg L?1 A. platensis day?1，中等限制）和D0.5（0.5 mg L?1 A. platensis day?1，严重限制）在六个关键参数上的标准化表现（0–100%）。较高的值表示更好的表现；对于早期生殖，首次生殖的年龄越年轻，得分越高。该图说明了无性生殖（左侧轴）和有性生殖（右侧轴）之间的权衡。数值通过最小-最大重新缩放标准化到0–100%。3.2. 第二项试验：热应力对生殖策略和卵囊生产的影响研究发现温度与生殖表现之间存在明显的关系。对于无性生殖，最高的总后代产量出现在25°C，高于10°C、15°C和30°C。相比之下，在最佳生长温度范围（20–25°C）内，卵囊的形成最少，而在两个极端温度下显著诱导。最高的卵囊产量出现在30°C，而在20°C时没有卵囊产生（图4）。图4显示了热应力对Daphnia magna总后代产量和卵囊形成的影响。五个温度处理下的生殖输出（T1 = 10°C，T2 = 15°C，TC = 20°C，T3 = 25°C，T4 = 30°C）。条形图或数据点上不同的字母表示处理之间的统计显著差异（p < 0.05）。温度对D. magna生产参数的影响表明，在中等温度范围（20–25°C）内，无性生殖得到优化，表现为更长的生殖期、更高的繁殖力和更早的成熟。相比之下，在热应力下，有性生殖的反应最大，卵囊形成的最高和最长时间出现在30°C。这种温度转换也体现在首次释放的时间上；在25°C和30°C时，新生后代出现得更早，而在30°C时卵囊产生得更早，在25°C时则明显延迟（表4和表5）。温度对无性生殖特征有显著影响（ε2 ≥ 0.86），其中对生殖期的影响最大（ε2 = 0.94）；峰值释放日的效应中等（ε2 = 0.19，p = 0.201）。在热应力下，显著的性生殖参数具有较大的效应（ε2 ≥ 0.75）；非显著特征显示出中等效应（ε2 = 0.46–0.53），表明具有生物学意义。表4显示了温度对Daphnia magna无性生殖的影响：新生后代数量、成熟度和种群动态。表5显示了温度对Daphnia magna有性生殖表现、诱导和种群动态的影响。在极端温度（10°C和30°C）下，卵囊产量最大化，其中双卵卵囊占主导（图5A）。然而，孵化成功率则呈现相反的模式，25°C下形成的卵囊具有最高的双卵和单卵存活率，超过了10°C和30°C下的比率。这揭示了一个明显的权衡，即极端温度有利于产生抗性强的卵，而中等热应力（25°C）则优化了胚胎存活（图5B）。图5显示了温度对Daphnia magna卵囊卵组成和孵化成功率的影响。（A）不同温度处理下卵囊内卵含量的分布，以空卵囊、单卵卵囊和双卵卵囊的百分比表示。（B）不同温度处理下单卵卵囊和双卵卵囊的孵化成功率。条形图上不同的字母表示同一类别内处理之间的统计显著差异（p < 0.05）。在（B）中，分别使用Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后检验（带Bonferroni校正）对单卵卵囊和双卵卵囊进行了比较。饮食变化引起了D. magna的显著形态测量变化。尽管无性生殖雌性的长度在各处理间保持相似，但在食物限制（D0.5和D10）下，其宽度减小，导致前者的长宽比（LW）更高。携带卵囊的雌性比无性生殖雌性更小，尤其是在D0.5处理中差异最大。此外，卵囊的大小直接响应食物可用性，D10处理下的卵囊在长度和宽度上都大于D0.5处理下的卵囊。大多数形态测量特征显示出较大的效应大小（ε2 ≥ 0.57），尤其是在携带卵囊的雌性和卵囊尺寸上（ε2 ≥ 0.71）（表3）。表3显示了不同食物条件下Daphnia magna无性生殖雌性、携带卵囊的雌性和卵囊的形态测量参数。D20处理表现出以无性生殖为主（高后代产量和延长的生殖期）且不产生卵囊的特征，而D0.5处理则表现出相反的模式，即对卵囊的最大投资和最小的无性生殖活动。尽管如此，D10处理呈现出中间的平衡特征，卵囊的孵化率更好（图3）。图3显示了受食物限制的Daphnia magna的生殖期、早期生殖、后代数量、孵化率和总卵囊产量的PCA分析。雷达图显示了处理D20（20 mg L?1 A. platensis day?1，对照组）、D10（10 mg L?1 A. platensis day?1，中等限制）和D0.5（0.5 mg L?1 A. platensis day?1，严重限制）在六个关键参数上的标准化表现（0–100%）。较高的值表示更好的表现；对于早期生殖，首次生殖的年龄越年轻，得分越高。该图说明了无性生殖（左侧轴）和有性生殖（右侧轴）之间的权衡。数值通过最小-最大重新缩放标准化到0–100%。3.2. 第二项试验：热应力对生殖策略和卵囊生产的影响研究发现温度与生殖表现之间存在明显的关系。对于无性生殖，最高的总后代产量出现在25°C，高于10°C、15°C和30°C。相比之下，在最佳生长温度范围（20–25°C）内，卵囊的形成最少，而在两个极端温度下显著诱导。最高的卵囊产量出现在30°C，而在20°C时没有卵囊产生（图4）。图4显示了热应力对Daphnia magna总后代产量和卵囊形成的影响。五个温度处理下的生殖输出（T1 = 10°C，T2 = 15°C，TC = 20°C，T3 = 25°C，T4 = 30°C）。条形图或数据点上不同的字母表示处理之间的统计显著差异（p < 0.05）。温度对D. magna生产参数的影响表明，在中等温度范围（20–25°C）内，无性生殖得到优化，表现为更长的生殖期、更高的繁殖力和更早的成熟。相比之下，在热应力下，有性生殖的反应最大，卵囊形成的最高和最长时间出现在30°C。这种温度转换也体现在首次释放的时间上；在25°C和30°C时，新生后代出现得更早，而在30°C时卵囊产生得更早，在25°C时则明显延迟（表4和表5）。温度对无性生殖特征有显著影响（ε2 ≥ 0.86），其中对生殖期的影响最大（ε2 = 0.94）；峰值释放日的效应中等（ε2 = 0.19，p = 0.201）。在热应力下，显著的性生殖参数具有较大的效应（ε2 ≥ 0.75）；非显著特征显示出中等效应（ε2 = 0.46–0.53），表明具有生物学意义。表4显示了温度对Daphnia magna无性生殖的影响：新生后代数量、成熟度和种群动态。表5显示了温度对Daphnia magna有性生殖表现、诱导和种群动态的影响。在极端温度（10°C和30°C）下，卵囊产量最大化，其中双卵卵囊占主导（图5A）。然而，孵化成功率则呈现相反的模式，25°C下形成的卵囊具有最高的双卵和单卵存活率，超过了10°C和30°C下的比率。这揭示了一个明显的权衡，即极端温度有利于产生抗性强的卵，而中等热应力（25°C）则优化了胚胎存活（图5B）。图5显示了温度对Daphnia magna卵囊卵组成和孵化成功率的影响。（A）不同温度处理下卵囊内卵含量的分布，以空卵囊、单卵卵囊和双卵卵囊的百分比表示。（B）不同温度处理下单卵卵囊和双卵卵囊的孵化成功率。条形图代表平均值±标准差（SD）。条形图上不同的字母表示同一类别内处理之间的统计显著差异（p < 0.05）。无性生殖雌性在较高温度（25°C和30°C）下达到最大体型，而携带卵囊的雌性在所有处理中始终比无性生殖雌性更小。相比之下，卵囊的大小随温度增加而增加，30°C下产生的卵囊比10°C下产生的卵囊更大。这种形态差异的模式表明资源在生长和休眠结构投资之间的热调节分配。无性生殖雌性显示出非常大的效应，而卵囊尺寸也显示出较大的效应，携带卵囊的雌性的效应较小（表6）。表6显示了不同温度条件下Daphnia magna无性生殖雌性、携带卵囊的雌性和卵囊的形态测量参数。PCA确认了极端温度触发了不同的生殖策略。为了最大化卵囊数量，处理T4（30°C）是最优的，而T3（25°C）则有利于无性生殖表现。T1（10°C）代表了一个中间点，保持了显著的卵囊产量和可接受的存活率，展示了两种策略之间的折中。在热应力下（T4）的高卵囊产量是以无性生殖参数和卵囊质量的明显代价为代价的，说明了由温度驱动的基本数量-质量权衡（图6）。图6显示了不同温度下Daphnia magna的生殖期、早期生殖、后代数量、孵化率和总卵囊产量的PCA分析。雷达图显示了温度处理T1（10°C）、T2（15°C）、TC（20°C）、T3（25°C）和T4（30°C）在六个关键参数上的标准化表现。较高的值表示更好的表现。底部轴代表无性生殖的投资，而顶部轴代表有性生殖的投资和卵囊的质量。数据相对于每个参数观察到的最大值进行了标准化。4. 讨论 4.1. 作为对压力的适应反应的生殖权衡本研究的结果证实，Daphnia magna的生殖投资受到无性生殖和有性生殖之间基本权衡的支配，这是对环境压力的中心适应反应。然而，这种生殖转变对所施加的应力类型表现出不同的敏感性。20至25°C之间的温度维持了高无性生殖输出，这与长期生理适应一致，优化了能量分配以直接用于生殖[1,27]。相比之下，严重的食物限制和极端温度作为独立的强大诱导因素，极大地抑制了D. magna的无性生殖。这种转变与经典模型一致，即环境压力促进了从无性生殖向有性生殖的转变[18,19]。然而，尽管Kleiven等人[18]提出需要三个同时的刺激才能诱导卵囊的形成，但本研究表明，无论是营养还是温度的单一严重压力源都可以独立触发有性生殖途径。这可能反映了D. magna中已充分记录的品系特异性遗传差异。因此，本研究中使用的哥伦比亚孵化场品系可能具有独特的遗传背景，解释了单一严重压力源的诱导，并增强了其对栖息地恶化信号的敏感性[28,29,30]。对严重食物限制的反应达到了与早期报告一致的临界诱导阈值[30]，而极端温度则作为一个强大的非生物信号，将能量从生长重新导向休眠[5,14]。这种模式反映了资源分配的战略，即在有利条件下克隆生殖占主导，促进快速殖民，而在严重压力下，资源被重新导向通过卵囊形成实现长期存活，符合适应性生活史可塑性的模型[31]。从指数生长到在恶化栖息地中产生少量高度抗性休眠卵的投资转变增强了遗传多样性和通过滞育的存活[1,29,32]。结合来自热带生态系统的证据[33]，这些发现证实了温度和食物可用性等非生物因素作为调节表型可塑性的关键开关，这不仅包括生殖特征，还包括生理和行为特征，使单个克隆能够适应不同的温度并有效利用有利于无性生殖的温度窗口[27]。与Kleiven等人[18]的模型不同之处在于性诱导的顺序。他们的研究报告称，雄性后代的产生和性别比例调整先于卵囊的形成，而本实验设计没有跟踪后代的性别比例。这种差异强调了虽然最终输出（卵囊产生）可以由单一急性压力源触发，但潜在的生理途径可能仍涉及中间步骤，如雄性产生，这需要在这些简化的诱导协议下进一步研究。4.2. 对压力严重程度的生殖反应将结果与关键研究进行比较，揭示了压力的强度和性质如何调节生殖反应的效率和结果。本研究的结果与Bae等人的研究[5]形成对比，他们发现20–25°C的温度范围是无性繁殖的最佳条件。这一最佳温度范围也与McKee[27]所观察到的在25°C时高无性繁殖率的结果一致。然而，本研究通过直接量化无性生殖产物的产生量（在该温度范围内无性生殖产物极少或不存在），为这一现象增加了新的维度。这表明，对于D. magna来说，温度的适度升高（最高至25°C）并不被视为严重的威胁，从而为向有性繁殖的转变提供了依据。本研究中该物种真正的诱导阈值出现在30°C时，此时无性繁殖停止，而无性生殖产物的形成达到最大。这一发现支持了Bae等人[5]关于在热应激下能量重新分配至防御机制的解释。30°C时无性繁殖的提前诱导反映了代谢速率随温度升高的加速现象，这是变温动物中的普遍规律[27]。相比之下，在15°C时，幼体的产生量适中而无性生殖产物的形成较少，说明这一温度对两种繁殖方式都不理想，这与D. magna的最佳生长温度范围的下限[31]相符。同样，食物供应情况也表现出逐渐增加的压力因素，进一步证实并扩展了Bednarska[29]提出的理论框架。尽管那项研究记录了食物量与孤雌生殖表现（体型、繁殖力和生长）之间的正线性关系，但结果也显示有性繁殖遵循相反的模式。严重的食物限制（0.5 mg L?1）是无性生殖产物的最强诱导因素。这一现象可以用Burns[34]提出的机制来解释：食物摄入量的减少会触发生殖程序的重新调整，从而优先形成抗性结构，以长期生存为首要目标而非即时繁殖。值得注意的是，即使在严重食物限制的情况下，无性生殖产物的产生和存活率在整个实验过程中仍然得以维持，这与Mezgebu等人[35]的报告相反，后者在类似浓度下未观察到存活现象。高无性生殖产物产量与30°C时较低存活率之间的负相关关系揭示了在极端热应激下的能量重新分配。尽管在这种处理下的雌性体型较大，但携带无性生殖产物的雌性体型较小，且产生的无性生殖产物体积最大，这表明即使在牺牲存活率的情况下，也优先投资于抗性结构的形成。这种形态生理学模式符合温度-体型规则[36]等原理，并展示了D. magna在极端压力条件下调整其繁殖策略的能力。

4.3 无性生殖产物的质量与孵化存活率
本研究的结果揭示了有性繁殖过程中的一个次要权衡：无性生殖产物的诱导不仅受压力影响，其数量和质量还与压力强度呈反比关系。这些发现补充并扩展了以往的研究成果。Kleiven等人[18]关注的是无性生殖产物诱导的先决条件，而本研究还评估了无性生殖产物的质量和存活率。Bednarska[29]研究了孤雌生殖卵的质量（体型和内容物），而本研究则从每个囊泡中的卵含量和孵化成功率的角度量化了无性生殖产物的质量。严重的食物限制（D0.5）虽然增加了无性生殖产物的数量，但降低了其质量（更多的空囊泡或仅含一个卵的囊泡，以及较低的孵化率）；而适度的食物限制（D10）则优化了质量（更多的双卵囊泡和更高的孵化成功率）。这可能表明，在急性压力下，D. magna优先大量产生抗性结构，而在适度压力下则能实现更平衡的投资，从而最大化后代的存活概率。通过与其他压力诱导因素的比较，这一补偿机制得到了验证。正如Deng等人[32]对D. pulex在蓝藻压力下的研究以及Paes等人[33]对热带湖泊中Daphnia spp.的研究所示，无论营养还是热应激的加剧都会增加无性生殖产物的产生，但会降低其存活率或繁殖力。本研究通过确定一个最佳诱导点（D10），在产量和质量之间取得了平衡，从而克服了实验室条件下无性生殖产物存活率较低的局限性[37]。这种权衡可能是由资源分配机制介导的。严重的食物限制可能限制了完成每个无性生殖产物中两个可存活卵所需的能量。Turcihan等人[38]的研究表明，D. magna的体成分和脂质储备受饮食影响，因此诱导前的饮食营养质量可能是产生数量更多、能量储备更高且存活率更高的无性生殖产物的关键。这一方面具有直接的应用价值：在受控条件下有效诱导高质量的无性生殖产物可以为水产养殖提供抗性卵库，并为招募高性能个体提供基础，正如从无性生殖产物中孵化出的个体[39]所观察到的那样。

4.4 繁殖的形态测量成本
形态测量结果表明，D. magna的表型可塑性超越了繁殖方式的变化，包括体型和抗性结构的综合调整。后代体型和数量与每个卵所分配的能量之间的平衡受到母体体型和食物供应等因素的影响[1]。正如Ebert[1]所综述的，当食物稀缺时，Daphnia会产生数量较少但体型较大的后代，这一模式与理论模型预测的卵大小对食物供应的非线性响应一致[40,41]。这一框架与Bednarska[29]的研究结果相符，她观察到严重的食物限制会诱导出较大的孤雌生殖卵，而低质量的饮食则会产生较小的卵。在温度方面，本研究的结果与先前研究（如Bae等人[5]和Hoefnagel等人[36]）报告的在高温度下体型减小的现象存在明显差异，后者将这种现象归因于温度-体型规则（TSR）和能量向防御机制的重新分配。在本研究中，25–30°C下的雌性体型较大，这可能是由于受控的喂养条件和实验持续时间所致。然而，所有处理中携带无性生殖产物的雌性体型显著小于不携带无性生殖产物的雌性，这表明有性繁殖伴随着直接的形态学成本。这表明资源分配机制将能量从体细胞生长转向抗性结构的产生，这一原则与应激条件下的资源限制观察结果[36]及类似的密度依赖效应[42]一致。此外，无性生殖产物的大小直接响应了诱导条件：在适度食物限制（D10）和30°C时，无性生殖产物的体积较大。这可能表明，在有性繁殖的投资中，资源分配到保护结构本身的方式也存在可塑性，这种分配可能受到形成时可用能量的调节。

5. 结论
本研究建立了一种控制Daphnia magna繁殖的方案，使其在压力条件下从克隆增殖转变为无性生殖产物的形成作为长期生存策略。在最佳条件下（每天20 mg L?1的A. platensis和20–25°C的温度），孤雌生殖能产生最多的克隆个体；然而，特定的压力因素（如严重的食物限制（0.5 mg L?1每天）和极端温度压力（10和30°C）会抑制这一策略。这些压力因素有效地将繁殖投资转向了无性生殖产物的产生。虽然30°C是最有效的温度诱导因素，但适度的食物限制（10 mg L?1每天）代表了最佳权衡，实现了高诱导率与最高胚胎存活率的平衡。因此，在水产养殖应用中，应优先采用这种饮食方案而非温度诱导。未来的研究应重点优化诱导前的营养条件，以提高该技术的效率。