咖啡与樱桃的发酵时间对哥伦比亚乌伊拉省两个农业生态区中阿拉比卡咖啡豆的物理化学性质、光谱特征及感官品质的影响

《Journal of Food Composition and Analysis》：Impact of coffee-cherry fermentation time on physicochemical, spectral and sensory characteristics of Arabica coffee beans in two agroecological zones of Huila, Colombia

　　伊万·爱德华多·阿尔瓦雷斯·利兹卡诺（Iván Eduardo álvarez Lizcano）| 安德烈斯·费利佩·巴阿蒙·蒙赫（Andrés Felipe Bahamón Monje）| 艾达·埃斯特·佩努埃拉·马丁内斯（Aida Esther Pe?uela Martínez）
哥伦比亚国家咖啡协会（Federación Nacional de Cafeteros），邮编410001

**摘要**
本研究探讨了咖啡果实与樱桃在果实内发酵（预榨前）的时间（0–96小时）如何影响哥伦比亚乌伊拉省两个不同农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）生产的阿拉比卡咖啡的化学成分（通过HPLC测量的咖啡因、Trigonelline和绿原酸）以及红外光谱特征（FTIR/FTNIR）。同时，还评估了物理质量指标（缺陷、产量相关参数）和感官评分（SCA协议），以补充说明化学-光谱变化及其对加工过程的影响。

**研究目的**
本研究评估了果实内发酵时间（0–96小时）对哥伦比亚乌伊拉省两个农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）阿拉比卡咖啡的物理、化学、光谱和感官质量的影响。采用随机区组设计，在两个区域测试了五种不同的发酵时间。研究内容包括物理质量参数（缺陷率、产量）、感官属性（SCA协议）、化学成分（通过HPLC测量的咖啡因、Trigonelline和绿原酸）以及光谱特征（FTIR/FTNIR）。结果表明，较长的发酵时间（≥72小时）会增加物理缺陷并降低优质咖啡豆的比例。咖啡因和Trigonelline的含量保持稳定，而绿原酸的含量则随发酵时间和农业生态区的不同而显著变化。FTNIR有效捕捉了发酵过程动态（PC1=70%），并提供了化学特异性的信息。感官评分范围为78至86分，其中ZAE 1的评分随时间变化较为稳定，而ZAE 5的评分波动较大。研究结果表明，没有普遍适用的最佳发酵时间；然而，24–48小时被认为是安全的操作范围，具体时间可根据当地条件和基本工艺控制（温度、pH值、°Brix）进行调整。研究建议开发预测性多变量模型，以根据微环境条件调整发酵策略，从而优化采后决策。

**引言**
果实内的发酵是咖啡质量控制的关键阶段（Meira Borém等人，2023a），这一阶段涉及果实的微生物生态（de Sousa等人，2023）、基质的物理化学条件以及湿法加工的技术决策。研究表明，时间和温度会影响发酵动力学、果胶的提取以及具有感官影响的代谢物的形成/降解（dos Santos Gomes等人，2025），但这些影响的程度和方向取决于生产环境和管理方式（Flávio M. Borém等人，2024）。此外，使用接种剂（酵母和乳酸菌）和生物反应器可以提高可重复性并调节挥发性物质和感官特性，但不同基质和环境下的结果仍存在差异（Afriliana等人，2024；Haile和Kang，2019；Mardhatilah等人，2023）。

在哥伦比亚，记录显示在10–30°C温度下进行控制的发酵需要比自然发酵多2至13小时才能完全降解果胶，最终pH值也有所不同（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）。在微生物多样性方面，对昆迪奥省20个农场的研究发现，Enterobacteriaceae属细菌在发酵后期被Leuconostoc、Lactobacillus和Acetobacter取代，这与pH值下降及绿色咖啡豆中醇类和酯类的形成有关（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）。控制温度还能影响不同海拔地区的发酵过程质量：在15°C时，咖啡的感官评分高于30°C和自然发酵的情况，且这种效应在不同海拔均一致（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）。此外，氧气供应和时间也会影响发酵效果：短时间的厌氧发酵能获得最佳的物理和感官质量指标，而长时间发酵则会降低这些指标（Pe?uela-Martínez等人，2025）。卡斯蒂略（Castillo）、塞尼卡费-1（Cenicafé-1）和塔比（Tabi）品种的试验表明，这些品种在发酵行为上相似，评分均超过82分，且在15°C、30°C和自然发酵条件下没有显著差异（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）。这些研究为将相关知识应用于实际生产提供了基础，有助于咖啡种植者提高咖啡质量并避免导致感官缺陷的风险。

一个常被忽视的因素是气候，它影响着果实的生物化学特性和发酵过程动态。乌伊拉省的两个农业生态区存在显著差异：ZAE 1（平均海拔1,477米）年日照时间为1,300–1,600小时，年降水量为1,200–1,600毫米，开花期间有约94天的水分不足；ZAE 5（海拔1,459米）年日照时间为1,400–1,600小时，年降水量为1,400–1,800毫米，果实形成期间的日积温为2,300–2,800度（Pe?a等人，2012）。这些微环境差异会影响果胶的含量和状态、酶活性以及微生物的分布，从而影响相同发酵时间下的发酵结果。

尽管取得了一些进展，但仍存在不足之处：（i）缺乏按农业生态区划分的对照实验，以单独研究发酵时间对果实的影响；（ii）缺乏关于特定化学化合物（咖啡因、Trigonelline、绿原酸）与感官质量之间关系的研究结果；（iii）缺乏整合色谱法、FTIR/FTNIR光谱技术和化学计量学的多尺度分析，以解释而非仅仅描述不同区域和工艺之间的差异。本研究通过评估乌伊拉省阿拉比卡咖啡在果实内发酵0、24、48、72和96小时对物理化学参数、HPLC测量的化学成分（咖啡因、Trigonelline、绿原酸）、FTIR/FTNIR光谱特征以及感官质量的影响，比较了ZAE 1和ZAE 5之间的差异，从而填补了这些空白。

**研究假设**
本研究假设咖啡果实的物理、化学和感官质量受气候条件影响，因此探讨发酵时间对咖啡品质的影响。我们认为，果实预榨前的等待时间作为一种采后处理方式，可能改变（i）果胶的可用性以及（ii）发酵过程的物理化学变化（如pH值和温度）。这些过程层面的差异可能与发酵动力学和水分溶性成分的传递变化有关，进而影响物理缺陷和酚类酯（如绿原酸）的稳定性/转化，这种影响因农业生态区而异。

**主要贡献**
本研究的主要贡献在于结合了针对不同农业生态区的发酵时间效应的化学-光谱表征，结合了HPLC标记物、FTIR/FTNIR光谱技术和化学计量学分析方法。物理和感官质量测量结果作为辅助指标，有助于将化学-光谱发现转化为实际的采后决策依据。

**材料与方法**
**2.1 原材料**
本研究使用的是阿拉比卡咖啡（Coffea arabica L.）卡斯蒂略（Castillo）品种。果实采用手工采摘，仅选取成熟果实，来自乌伊拉省的两个具有不同农业生态特征的农场，以捕捉与果实发酵及其采后效应相关的变异性。各农场的土壤和气候特征见表1。

**表1. 不同农业生态区（乌伊拉省）农场的特征**
| 特征 | ZAE 1 | ZAE 5 |
|-----------------|-----------------|-----------------|
| 地点（WGS84坐标） | 02°11′41.5083″ N; 75°56′58.2304″ W | 01°49′00.4524″ N; 75°51′23.1488″ W |
| 海拔（米） | 1,813 | 1,341 |
| 年平均降水量（毫米） | 1,477 | 1,508 |
| 年平均日照时间（小时） | 1,438 | 1,486 |
| 年平均温度（℃） | 18 ± 5 | 26 ± 5 |

**2.2 实验设计与样本量**
本研究采用随机完全区组设计，包含两个农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）和五种预榨前咖啡果实发酵时间（0、24、48、72和96小时）。每个农业生态区（每个区一个农场）重复三次实验，共得到15个实验单元（3个区组×5次），总计30个实验单元。每个区组采集180公斤成熟咖啡果实，其中150公斤用于五种处理（每种处理约30公斤），确保有足够的材料进行物理、感官、化学和光谱分析。

**2.3 采后咖啡加工**
两个农场均具备适当的基础设施和设备，用于咖啡加工（研磨机和筛分机）。每个实验组采集180公斤成熟咖啡果实，使用Mediverdes?工具（Guerrero等人，2022）和Cromacafé?工具（Pe?uela-Martínez等人，2022）进行质量评估。然后通过双桶技术对果实进行密度分类，并再次使用Mediverdes?工具进行质量评估。从中选出150公斤咖啡用于五种处理：对照组（分类后立即研磨）和四种不同预榨时间的处理（24、48、72和96小时）。预榨阶段相当于控制下的果实内发酵。0小时处理表示分类后立即研磨。研磨后，采用Fermaestro?方法进行果胶发酵（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）。该方法基于研磨后咖啡质量的表观密度变化（由于果胶降解），直到体积稳定（约为初始体积的11.9–13.1%）。为便于观察，使用了一种截锥形穿孔装置（内部容积500毫升），孔径小于6毫米，穿孔面积至少为55%，以便液体排出同时保留咖啡豆。将新鲜研磨的咖啡从较大底部注入装置，盖子密封后将其放入容器中，窄端朝上。发酵接近结束时，将装置从3厘米高度掉落三次，以沉淀咖啡豆并便于读取上部空隙高度。当装置内咖啡/空隙高度稳定且空隙高度超过初始值的85%时，认为达到洗涤终点（即果胶去除率超过96%）。如果未达到该标准，需重新插入装置并每小时检查一次，直至满足条件。

**2.4 发酵过程中的过程控制和测量**
在洗涤前，使用便携式pH计（HI9814，Hanna Instruments SAS制造，美国）测量新鲜研磨咖啡的pH值和温度（校准使用pH 4.0、7.0和10.0缓冲液）。使用折射仪（BTX-1，Vee Gee Scientific制造，美国）测量总可溶性固体（°Brix），使用数字探针温度计（TP101，SHTROL制造，中国）测量温度。发酵结束后，所有样本手动洗涤四次，然后进行密度分类。洗涤后的咖啡在遮阳干燥机中晾干，直至水分含量达到10–12%（使用KETT制造的PM-450设备）。**咖啡豆的物理分析**

选取了250克干烘焙咖啡作为代表性样本，通过脱壳处理去除烘焙层，然后分离出不同组分：优质咖啡豆、杏仁状咖啡豆或生咖啡豆；Pasilla咖啡豆、有缺陷的咖啡豆以及根据NTC 5248-2013标准不符合13号筛孔大小的咖啡豆；此外还包括损耗物、果壳、烘焙残渣、杂质和缺陷豆。根据这些重量数据，计算出了优质咖啡豆的百分比、损耗率、Pasilla咖啡豆的比例以及产量因子。

**2.4.1 产量因子（YF）**

产量因子是根据获得70公斤高品质咖啡所需干烘焙咖啡（DPC）的数量（公斤）来估算的（公式1）。计算方法基于样本的高品质产量：
$$
YF = \frac{250\ \text{g}\ DPC}{70\ \text{kg}\ \text{优质咖啡重量}}
$$

**2.4.2 优质咖啡豆的百分比（%GB）**

这是干烘焙咖啡样本中优质咖啡豆的比例（公式2）：
$$
\%GB = \frac{M_g}{M_{\text{干烘焙咖啡总重量}} \times 100
$$
其中，$M_g$表示去除果壳/杂质和有缺陷咖啡豆后的生咖啡豆重量。

**2.4.3 咖啡脱壳损耗率（%Ctl）**

损耗率指的是脱壳过程中产生的果壳、烘焙残渣和不可用材料的总质量（公式3）：
$$
\%Ctl = \frac{250\ \text{g}\ DPC}{M_{\text{脱壳后生咖啡总重量}} \times 100
$$
这里，$DPC$表示干烘焙咖啡的重量。

**2.4.4 Pasilla咖啡豆的百分比（%P）**

Pasilla咖啡豆是指新鲜脱壳样本中的缺陷豆比例（公式4）：
$$
\%P = \frac{\text{所有缺陷咖啡豆重量}}{M_{\text{脱壳后生咖啡总重量}} \times 100
$$

**2.5 烘焙过程**

咖啡豆在标准化条件下进行烘焙，遵循专业咖啡协会（SCA）的杯测烘焙方法，以减少烘焙过程中的变异对感官和化学分析的影响。烘焙使用的是DR-1型样品烘焙机（1公斤容量，PRISMA Coffee Tech公司，哥伦比亚麦德林），每次烘焙批量为200克。烘焙过程通过Artisan v3.4.0软件持续监控和记录关键事件（如上料、变黄/干燥结束、首次裂开等）。所有咖啡豆均烘焙至中等程度，具体程度通过Lighttells CM-100色度计（台湾）进行客观颜色测量，目标为Gourmet等级51–60。总烘焙时间控制在10至12分钟之间。每个样本在相同条件下重复烘焙三次。达到烘焙终点后立即取出并快速冷却至室温，以停止烘焙反应。烘焙后的咖啡豆储存在避光防潮的密封容器中，按照SCA规范进行杯测前的静置处理。

**2.6 咖啡的感官分析**

感官分析按照专业咖啡协会（SCA）的杯测规程在受控条件下进行（无异味环境、恒定温度和标准化杯测工具）。参与分析的小组由五名品鉴师组成，包括四名认证的Q Graders和一名具有咖啡评估经验的非认证品鉴师。为避免品鉴疲劳和顺序效应，分析分为三个随机批次进行，每批次最多评估10个样本。样本在每个批次中随机编号并依次呈现。烘焙后的咖啡在评估前立即研磨（使用Mahlkonig公司生产的EK43s研磨机），并按照SCA标准条件冲泡（咖啡与水的比例和浸泡时间）。评估内容包括香气/风味、口感、余味、酸度、醇厚度、平衡性、清洁度、甜度以及整体品质和缺陷（SCAA, 2015）。

**2.7 咖啡中绿原酸和咖啡因的测定（HPLC–DAD）**

咖啡中绿原酸和咖啡因的定量分析采用Sánchez-Ria?o等人（2024）描述的方法，并进行了少量调整。具体步骤如下：取100毫克烘焙咖啡粉，用10毫升超纯水（18.2 MΩ·cm）在90°C下超声提取30分钟（使用15毫升试管），然后在300 rpm和60°C的摇床（KS 4000 i control，IKA公司）中孵育18小时。提取液在4200 rpm下离心（Unicen 21，Orto Aleresa公司），通过0.20 μm尼龙膜过滤后转移到2毫升琥珀色小瓶中。取10 μL提取液注入Infinity II 1260 HPLC系统（Agilent Technologies公司），该系统配备Poroshell 120 EC-C18柱（150 × 4.6 mm；4 μm）。洗脱条件为甲醇：水（20:80，v/v），流速1.0 mL min?1，温度30°C。检测使用二极管阵列检测器（DAD），检测波长分别为272 nm（咖啡因和Trigonelline）和325 nm（绿原酸）。外部校准使用认证参考标准品：绿原酸（Aldrich，C3878，CAS 327-97-9）、Trigonelline（US Pharmacopeia Reference Standard，1686411，CAS 6138-40-5）和咖啡因（Sigma-Aldrich，PHR1009，CAS 58-08-2）。在相同的溶剂系统中制备六点校准曲线，咖啡因和Trigonelline的浓度分别为50、80、100、150、200 mg L?1（ppm），绿原酸为20、50、80、100、150、250 mg L?1（ppm）。通过最小二乘线性回归将峰面积与理论浓度进行关联，校准适用性通过回归统计和残差检验进行评估；绿原酸的最终结果以绿原酸当量表示。方法的灵敏度（LOD/LOQ）根据3.3 σ/S和10 σ/S标准确定，其中σ为响应的标准偏差，重复性通过中等浓度标准品的多次注射结果评估（以%RSD表示）。

**2.8 FTIR光谱的测定**

烘焙咖啡的红外光谱（MIR）测定方法参考Collazos-Escobar等人（2024）的研究，使用FTIR光谱仪（Cary 630，Agilent Technologies公司，加利福尼亚州圣克拉拉）和水平ATR附件（Diamond ATR）进行。在测量前，通过激光频率校准测试（x轴精度）验证仪器性能，记录聚苯乙烯薄膜的光谱并与NIST标准参考物质（SRM）1921的认证值进行比较。光谱采集范围为4000–650 cm?1，分辨率4 cm?1，扫描速度16次/秒，包含900个波数。为减少测量误差，每次测量前清洁ATR晶体并保持样品与晶体的良好接触。光谱预处理包括基线校正和乘法散射校正（MSC，Collazos-Escobar等人，2023）。每个样本重复测量五次（n = 5个光谱），平均光谱用于后续的多变量分析。

**2.9 傅里叶变换近红外光谱（FT-NIR）的测定**

FT-NIR光谱测定方法依据Ordo?ez Lozano等人（2025）的研究进行。使用Spectrum Two FT-NIR光谱仪（PerkinElmer公司，美国）进行测量，配备连续样品旋转附件和交错扫描功能。将约15克烘焙咖啡豆放入培养皿中，并置于旋转样品架上进行测量，确保测量过程中的均匀性。采集模式为漫反射模式，使用高分辨率InGaAs探测器，覆盖12,000–4,000 cm?1的光谱范围。每个光谱包含900个波数，每个样本重复测量五次，平均光谱用于后续的化学计量分析。

**2.10 统计分析**

实验采用随机完全区组设计，包含两个农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）和五个预浸出处理时间（果实内发酵时间：0、24、48、72和96小时）。每个农业生态区内的处理在三个独立区组中重复三次，每个ZAE内每个处理有3个实验重复，共计30个实验单元（2 ZAE × 5次 × 3区组）。FTIR分析中，每个实验单元重复测量五次（n = 5个光谱），平均光谱用于化学计量分析。感官评估由三名认证品鉴师和一名非认证品鉴师在三个随机批次中进行，每批次最多评估10个样本。感官评分通过汇总每个批次内品鉴师的评分，然后跨三个批次平均得到每个实验单元的单一感官值。

**3. 结果与讨论**

**3.1 发酵过程中的物理化学特性**

在咖啡果实加工过程中，发酵开始和结束时观察到物理化学特性的变化（图2）。这两个农业生态区之间的差异明显。pH值逐渐下降，ZAE 1在96小时时酸化程度更明显，这可能与有机酸的积累有关（De Bruyn等人，2017）。ZAE 5的咖啡果实温度升高，最终接近27°C，而ZAE 1的温度相对稳定在22°C左右，这与不同农场之间的工艺微环境差异（如环境条件和发酵过程中的热量积累）有关。总可溶性固体（°Brix）在两个区都呈持续下降趋势，可能源于果肉和果胶中可溶性化合物的释放，这些化合物受时间和温度等因素影响，也与发酵过程中的底物利用情况相关；时间和温度条件可能促进可溶性成分的快速消耗/稀释，但不一定涉及特定的微生物机制（Nakyinsige等人，2025）。这种行为与使用发酵菌种的发酵过程类似，其中微生物活动增强，酵母和乳酸菌的加入加速了糖类向有机酸和其他代谢物的转化。在工艺控制下，可溶性固体含量从15.8降至8.45°Brix（Polanía Rivera等人，2024）。这些结果与先前关于咖啡发酵的研究一致，即pH值显著下降，温度相对升高，总可溶性固体含量波动（Nakyinsige等人，2025；Janne Carvalho Ferreira等人，2023）。

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**图2. 两个农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）发酵过程中测得的物理化学参数变化：**
(a) pH值，(b) 温度（°C），(c) 总可溶性固体（°Brix）。条形图/点表示每个ZAE内三个独立实验重复（n = 3个批次/批）的平均值±标准偏差。

随着发酵时间的延长，pH值逐渐下降，这与微生物代谢产生的有机酸积累有关；类似的物理化学变化（酸化与糖分利用）也出现在其他水果发酵系统中（Cemalettin Baltaci等人，2024）。在湿法咖啡加工过程中，pH值和总固体含量（TSS）被广泛认为是发酵进程和微生物活动的实用指标，其变化已在受控和田间发酵条件下被多次记录（Tirado-Kulieva等人，2024年）。此外，随着发酵的进行，咖啡团块温度趋向于接近环境温度的趋势也在长时间湿法发酵过程中被报道，这强调了加工环境对发酵动力学的作用（Sánchez-Ria?o等人，2024年）。3.2 基于发酵时间和农业生态区的咖啡物理品质 图3显示了ZAE 1和ZAE 5在0至96小时发酵时间内的物理参数比较，我们看到损失百分比（图3a）随时间在ZAE之间有所变化；其值可能由于水分含量、去除的结构层（角质层或果皮）的重量而变化，而不仅仅是发酵时间。文献认为，咖啡的物理产量（果皮到生豆的比率、缺陷百分比以及优质咖啡的百分比）主要由遗传物质（品种/基因型）（Partelli等人，2021年）、田间管理（种植密度、施肥和营养管理）以及干燥管理（Pe?uela Martínez等人，2023a；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b；Pe?uela-Martínez等人，2023c；Pe?uela-Martínez等人，2023d；Pe?uela-Martínez等人，2023e；Pe?uela-Martínez等人，2023f；Pe?uela-Martínez等人，2023g）决定。下载：下载高分辨率图片（300KB）下载：下载全尺寸图片 图3. 两种农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）中物理品质指标随果实保存/发酵时间（0–96小时）的变化：(a) 咖啡脱粒损失（%Ctl），(b) 有缺陷的豆子（%P, pasilla），(c) 优质豆子（%GB），以及 (d) 产量因子（YF；获得70公斤特级生豆所需的干果皮咖啡重量）。条形图/点代表每个ZAE内每个处理组n = 3个批次/批次的平均值±标准差。 当发酵时间延长时，特别是控制条件较差的情况下，pasilla的百分比（图3b）有增加的趋势，这可能导致过度发酵和采后故障，从而引发物理缺陷和可能的感官缺陷（如醋味豆、黑斑、裂纹）（Osorio Pérez等人，2022年；Silva等人，2024a年）。多项研究证实，咖啡发酵过程中的故障会增加豆子缺陷的出现，并给咖啡种植者带来经济损失，尤其是在国际上公认咖啡品质优良的哥伦比亚（Motato Rocha等人，2024a年；Pe?uela Martínez等人，2023a年；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b年；Pe?uela-Martínez等人，2023c年；Pe?uela-Martínez等人，2023d年；Pe?uela-Martínez等人，2023e年；Pe?uela-Martínez等人，2023f年；Pe?uela-Martínez等人，2023g年）。不适当的采后处理，如控制不当的发酵，会导致品质不一致和缺陷，从而降低产品的商业价值和最终价格；因此，监测和控制发酵过程中的时间和温度对于避免缺陷至关重要。在我们的实验中，ZAE之间的差异表明，特定地点的加工条件（例如发酵过程中的温度曲线和咖啡果实的基线生理特性）可以调节发酵动力学，从而随着保存时间的延长增加物理缺陷的风险；然而，由于没有收集微生物群落数据，这里没有直接证明微生物驱动因素的作用（Motato Rocha等人，2024b年）。 有缺陷豆子（pasilla）的增加和物理品质指标的恶化与先前的报告一致，这些报告表明，收获和制浆之间的延迟（“果实储存/果实储备”）可能会促进不受控制的发酵和品质损失，尤其是在储存条件有利于微生物生长的情况下（Y.和Nugroho，2014年；Osorio等人，2024年）。关于咖啡发酵的综述进一步强调，延长或控制不当的发酵会改变微生物活动和代谢产物的产生方式，增加缺陷和不良特性的可能性，从而强调了明确加工窗口的必要性（Elhalis等人，2023年）。产量因子（图3d）显示ZAE 1和ZAE 5之间存在差异。证据表明，除非发生过度发酵或处理不当，否则发酵时间本身不会显著改变工业转化率；相反，地点×工艺的交互作用（微气候、温度控制）决定了检测到的微小差异。因此，超过72小时的时间需要严格控制，以避免物理品质或产量因子的下降（Pe?uela Martínez等人，2023a年；Pe?uela-Martínez和García-Duque，2023b年；Pe?uela-Martínez等人，2023c年；Pe?uela-Martínez等人，2023d年；Pe?uela-Martínez等人，2023e年；Pe?uela-Martínez等人，2023f年；Pe?uela-Martínez等人，2023g年）。3.3 果实发酵过程中的感官变化：时间和农业生态区（ZAE）的影响 对样本的感官分析（图4）显示了一些差异，例如在香气/风味（图4a）、味道（图4b）和余味（图4c）等属性上。对于ZAE 1，这些值随时间保持较高且更稳定，而ZAE 5在果实发酵24至48小时时有所增加，但随着发酵时间的延长，这些值略有下降（图4a-c）。酸度（图4d）表现出相同的行为，酸度值略有增加，因此ZAE 5处理的样本具有更好的品质特征，而ZAE 1的这一感官属性保持稳定。对于口感（图4e）和平衡度（图4f），变化趋势相似；ZAE 1始终高于或等于ZAE 5的水平。下载：下载高分辨率图片（340KB）下载：下载全尺寸图片 图4. 不同农业生态区（ZAE 1和ZAE 5）中果实保存/发酵（0–96小时）期间SCA感官属性的变化：(a) 香气/风味，(b) 味道，(c) 余味，(d) 酸度，(e) 口感，(f) 平衡度，(g) 整体印象，(h) 最终得分（SCA分数）。颜色代码：ZAE 1（蓝色）和ZAE 5（橙色）。条形图/点代表每个ZAE内每个处理组n = 3个批次/批次的平均值±标准差；感官值对应于每个实验单元（三次冲泡会话；五名品鉴师）的汇总结果。总体印象（图4g）和最终得分（图4h）证实了ZAE 1的咖啡品质有所提高，ZAE 5在24小时时略有提升，之后趋于稳定。属性（a–g）和综合指标（g–h）之间的一致性表明，在这些条件下，感官差异主要由ZAE决定，而发酵时间的影响是次要的，并且在不同参数上并不均匀。主要在巴西、危地马拉和哥伦比亚进行的研究表明，对于经过发酵的天然咖啡，SCA分数的最显著提高通常出现在48小时后，60至96小时之间达到2分以上的提升和感官峰值（Meira Borém等人，2023b年；Rocha等人，2024年；Silva等人，2024b年）。相比之下，在哥伦比亚的湿法加工过程中，18小时的发酵足以获得非常高的分数（88.5分）和花香及高酸度特征（Cruz O’Byrne等人，2020年），而在危地马拉，某些基因型在24至72小时之间没有显著差异，尽管风味特征有所变化（Dos Santos-Silva等人，2022年）。样本的感官特征（图5）主要由甜味基调主导，如蔗糖（0.93）、焦糖（0.83）、红糖（0.77）和糖蜜（0.73）。其次是植物味（0.60）、枣子（0.53）、巧克力（0.50）、香料（0.47）、稻草（0.47）和柑橘类（0.43）。这种甜味基调是主要特征，真正的区分体现在次要描述词及其受ZAE和时间的影响（图6）。这一观察结果与研究一致，即使发酵时间从24小时延长到72小时，主要变化也体现在焦糖和巧克力基调向果香和酒香方向的转变，而不是最终分数的巨大跳跃（Dos Santos-Silva等人，2022年；Pereira等人，2020年）。下载：下载高分辨率图片（181KB）下载：下载全尺寸图片 图5. 不同农业生态区（ZAE）的感官描述词相对频率。描述词频率以0–100的尺度表示，其中1表示所有评估中都报告了该描述词，0表示从未报告。下载：下载高分辨率图片（285KB）下载：下载全尺寸图片 图6. 不同农业生态区（ZAE）中感官描述词出现的时间动态（0, 24, 48, 72, 96小时）。数值代表每个时间点每个ZAE内描述词报告的相对频率（0-1），汇总了多次冲泡会话和品鉴师的结果。ZAE之间的差异在某些描述词中有所体现。例如，在图5中可以看到，香料（0.60）与（0.33）相比（Δ = +0.27），肉桂（0.40）与（0.20）相比（Δ = +0.20）。在ZAE 5中，巧克力含量为0.67，而在ZAE 1中为0.33（Δ = -0.33），丁香（0.40）与（0.20）相比（Δ = -0.20），麦芽（0.40）与（0.20）相比（Δ = -0.20），糖蜜（0.80）与（0.67）相比（Δ = -0.13）。总体而言，最丰富的描述词在不同区域之间的差异很小，例如，蔗糖（0.93）在两个ZAE区域中都存在，红糖的差异小于0.10。总之，ZAE 1表现出更多的蜂蜜、辛辣和成熟果实的味道，而ZAE 5则与更高的巧克力、丁香、麦芽和糖蜜的细微差别相关。这些甜味和香气复杂性的差异与文献描述的一致，即当发酵时间延长到72-96小时时，从主要以巧克力和坚果为主的香气转变为更果香、酒香和辛辣的香气（Brioschi Junior等人，2021年；Meira Borém等人，2023b年）。时间轴揭示了取决于ZAE的出现窗口（图6）。在ZAE 1中，72小时后的发酵过程中出现香料，而在ZAE 5中，这种味道在开始时很高（0.67），然后在24–96小时内减弱（0.33）。ZAE 1中的蜂蜜含量在0.67之间持续存在，而在ZAE 5中则边缘化或在0和72小时时为0.33。ZAE 5中的巧克力在48小时达到最大值（1.00），然后在96小时降至0.33，而在ZAE 1中观察到的峰值更为温和且交替出现（48小时和96小时分别为0.67）。糖蜜在ZAE 5中在24至72小时之间保持较高且稳定（1.00），然后在96小时降至0.33；在ZAE 1中则呈现更波动的模式，0小时为0.67，24小时为1.00，48小时为0.33，72–96小时为0.67。黄色水果的味道在两个ZAE中都在后期增强，特别是在ZAE 5中72–96小时的增强更为明显（ZAE 5为0.67和1.00，而ZAE 1为0.67和0.33）。原始蔗糖、焦糖和红糖的甜味基调在整个时间范围内保持较高，但略有波动：例如，在ZAE 1中，红糖在48–96小时暂时降至0.67，而在ZAE 5中在24至48小时保持1.00，然后在72–96小时降至0.66。3.4 咖啡因、葫芦巴碱和绿原酸的分析 在图7a中，咖啡因在0至96小时期间在两个ZAE中保持稳定。中位数显示轻微变化且没有趋势，而四分位数范围有时略有增加，这表明存在微环境效应而非系统性转化。比较研究表明，某些方法（如自然法、干法、湿法和半湿法）比涉及清洗或长时间浸泡的方法保留更多的咖啡因，这有助于解释轻微的差异（Halagarda和Obrok，2023年；Jo?t等人，2010a）。下载：下载高分辨率图片（184KB）下载：下载全尺寸图片 图7. 盒线图显示了通过HPLC测量的生物活性化合物在ZAE 1和ZAE 5中果实保存/发酵时间（0–96小时）的变化：(a) 咖啡因，(b) 葫芦巴碱，(c) 绿原酸（CGA，以绿原酸当量表示）。盒子表示四分位数范围（IQR），中线是中位数，须状部分延伸到1.5×IQR，点表示异常值。数据对应于每个条件下的n = 3个批次/批次。在图7b中，葫芦巴碱在长时间发酵过程中发生变化；在24小时时观察到更大的变异性，但在控制异常值后这种变异性减小，表明检测到的变化是暂时的，可能主要由特定阶段的浸出过程而非生化转化引起。文献表明，葫芦巴碱具有高度的水溶性和热不稳定性，在洗涤或浸泡过程中会有显著损失，尤其是在烘焙过程中（Duarte等人，2010年）。因此，在发酵阶段，由于发酵时间导致的葫芦巴碱变化可能较为微小，并且对pH值、温度和微生物负荷的微小变化非常敏感，而不是时间的线性效应（Heo等人，2020年；Konstantinidis等人，2023年）。关于绿原酸（CGA），它们是这三个标志物中反应最敏感的（图7c），显示出显著的ZAE、时间和ZAE×时间效应（表2）。由于CGA主要是咖啡酰奎宁酸酯，在长时间的水处理和洗涤过程中，它们的非线性行为可能反映了（i）可溶性酚类的质量传递/浸出，以及（ii）温度和pH依赖性的化学重排（酰基迁移/异构体重新分布）和咖啡酰奎宁酸的部分水解。重要的是，ZAE 5表现出更温暖的过程微环境（更高的发酵-物料温度）和不同的pH轨迹（图2），这可能改变了CGA的保留、浸出和转化之间的平衡，从而在ZAE 5中观察到更强的时间依赖性，而ZAE 1中的CGA水平相对稳定。我们强调这是一个机制假设；要将其归因于微生物途径，需要进行专门的分析（有机酸、个别CGA异构体/内酯和微生物组数据），这超出了本研究的范围（Purwoko等人，2022年）。收获后的研究记录了由于湿加工和罐内微生物-酸动态导致的CGA变化，这与观察到的模式一致（Sinaga等人，2021年）。相应地，数据指出了ZAE的特定效应，这些效应因微气候、作物管理和特定微生物动力学而异，这些因素可以改变生化动态的时间趋势（Jo?t等人，2010a）。

表2. 发酵时间和农业生态区（ZAE）对咖啡因、葫芦巴碱和绿原酸的影响，通过HPLC定量（平均值±标准差），使用Tukey HSD检验确定组间差异（α = 0.05）。
时间（小时） ZAE 咖啡因（mg/g） 葫芦巴碱（mg/g） 绿原酸（mg/g）
0 14.61 ± 0.29 Aa 14.39 ± 1.96 Aa 19.07 ± 0.59 Aa
5 12.16 ± 0.72 Bb 9.68 ± 1.49 Ba 12.42 ± 1.35 Bb
24 114.79 ± 0.55 Aa 12.86 ± 3.27 Aa 18.02 ± 1.85 Aa
5 12.28 ± 0.59 Bb 10.10 ± 2.08 Aa 12.87 ± 1.82 Bb
48 114.22 ± 0.83 Aa 14.75 ± 0.83 Aa 18.27 ± 1.33 Aa
5 11.73 ± 0.17 Bb 8.31 ± 1.69 Bb 10.87 ± 1.51 Bb
72 114.87 ± 0.44 Aa 14.31 ± 1.67 Aa 18.23 ± 1.14 Aa
5 13.38 ± 0.95 Ba 12.27 ± 2.16 Aa 15.84 ± 2.22 Ba
96 114.87 ± 0.99 Aa 13.52 ± 2.38 Aa 18.25 ± 1.02 Aa
5 13.93 ± 0.54 Aa 12.27 ± 1.69 Aa 17.15 ± 1.03 Aa

F-ratio值：时间（T）9.14***；ZAE（Z）135.02***；ZAE×时间（TxZ）3.59***；8.94***
大写字母表示在同一发酵时间内ZAE水平之间的显著差异（Tukey HSD，α=0.05）；小写字母表示在同一ZAE内不同发酵时间之间的显著差异（Tukey HSD，α=0.05）。
p值：ns：无显著差异；*** p < 0.001。数值表示每个农业生态区内每种处理的三个独立实验重复的平均值±标准差（n = 3个批次）。

表3. 常用于解释咖啡基质诊断光谱区域的选定中红外（FTIR）波数分配（cm?1）。这些分配基于文献，应视为指示性的而非排他性的（同一区域内可能存在多种成分）。
波长（cm?1） 化合物 参考文献
(3500-3200) 水 (Rodriguez, Calderon等人，2020)
2920 咖啡因、脂质 (Craig等人，2012a, Craig等人，2012b, Cremer和Kaletun?，2003)
2850 咖啡因 (Craig等人，2012a, Craig等人，2012b, Cremer和Kaletun?，2003)
1743 与咖啡感官特性相关的醛类羰基 (Wang等人，2009)
1740 与脂质相关的脂肪酸或脂肪酯 (Lyman等人，2003)
1739 脂质 (Rodriguez, Calderon等人，2020)
1650 绿原酸 (Rodriguez, Guzman等人，2020)
(1600-1300) 葫芦巴碱 (Craig等人，2012b, Rodriguez等人，2020)
(1450-1250) 绿原酸 (Wang等人，2009)
(1420 – 1000) 绿原酸 (Craig等人，2012b)
(1153-1150) 多糖 (Craig等人，2018)
1025 酯的C-O-C键 (Lyman等人，2003)
碳水化合物 (Craig等人，2012b)
872 碳水化合物 (Lyman等人，2003)

表2中的结果显示，农业气候区（ZAE）是影响咖啡因、葫芦巴碱和绿原酸（CGA）变化的最重要因素，其次是咖啡果肉的发酵时间，以及显著的ZAE×时间交互作用（p < 0.001）。这些结果表明，发酵过程中的组成动力学并非普遍适用，而是一个多因素问题，可能取决于每个作物区域的微环境。ZAE 1的浓度显著较高：咖啡因14.2-14.9 mg/g；CGA 18.0-19.1 mg/g，而ZAE 5为咖啡因11.7-13.9 mg/g；CGA 10.9-17.2 mg/g。这一发现表明，两个采样区域之间的浓度差异可能归因于特定于风土的生态生理和环境因素，这些因素调节了咖啡豆中代谢物的积累，而不仅仅是生产过程的暂时效应（Cheng等人，2016）。然而，他们也指出，果实发酵期可能导致非线性变化：感官特征的偶尔下降和恢复，这可能与水溶性化合物的扩散、浸出或降解、颗粒的代谢活动以及通常存在于粘液-胚乳生态系统中的微生物群介导的潜在转化有关，这些反应可能因区域而异（De Bruyn等人，2017；Duarte等人，2010；Halagarda和Obrok，2023）。这一发现与研究假设相关，因为Z、T和Z×T的显著性支持了环境依赖性反应的假设。这证实了在不考虑ZAE的情况下优化或标准化时间可能会导致结果偏差，这对质量有直接影响，因为CGA（及其衍生物）影响咖啡的感官属性，如酸度、收敛性和苦味以及生物活性成分（Farah等人，2006；Jo?t等人，2010）。

关于分析的局限性，重要的是要认识到它仅关注两个ZAE中的三个特定标志物，并覆盖了一个特定的时间范围。然而，没有对可能影响结果的关键变量（如微生物群落、内部温度、洗涤和干燥条件等）进行明确控制。因此，无法以确定的方式归因于因果机制。此外，CGA的呈现可能掩盖了具有不同感官影响的异构体和衍生物之间的重排，这可能影响CGA的及时转化，而这对提高感官质量很重要。总体而言，这些发现为根据区域调整发酵窗口提供了证据，并提出了将这些化合物作为可追溯性和过程控制的标志物的实际用途。未来的研究应整合CGA异构体和内酯的扩展分析、代谢组学和微生物学，以将途径和微生物与化学变化联系起来，并建立多变量动力学模型，将化学与批量规模的感官测量联系起来（Cheng等人，2016；De Bruyn等人，2017；Duarte等人，2010）。

3.5. FTIR和FTNIR光谱分析
在FTIR（图8a）中，观察到与生咖啡基质一致的谱带。值得注意的是宽的O–H伸缩（3300 cm?1）、脂肪族C–H伸缩（2920–2850 cm?1）、羰基区域（1735 cm?1；酯/酸）、与蛋白质相关的酰胺I/II区域（1650/1540 cm?1）以及多糖指纹（1240–1045 cm?1），这些信息来自表3中提到的不同作者。经过基线+MSC清洗和排除异常值后，ZAE 1和ZAE 5之间的差异主要表现为指纹相对强度的调制。随时间（0–96小时）的读数没有显示出FTIR中预期的谱带移动，而是强度比的调整；PCA-FTIR（左下角面板）部分排序了样本，并表明主要影响是过程和微观结构（分散、结合水）而不是新化学功能的形成。

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图8. 根据农业生态区和果实储存/发酵时间（0-96小时）的烘焙咖啡样本的光谱指纹和PCA区分：(a) ATR-FTIR光谱（4000-650 cm-1）和(b) FT-NIR光谱（12000 - 4000 cm-1），均在基线校正和乘法散射校正（MSC）之后；(c) 从FTIR光谱得出的PCA得分图；(d) 从FT-NIR光谱得出的PCA得分图。每个点代表一个实验单元（n = 30；2个ZAE × 5次 × 3个批次）。FTIR光谱每个实验单元获取了五次重复（n = 5个光谱），并在PCA之前进行了平均；FT-NIR重复光谱在PCA之前进行了平均（如方法中所述）。PCA轴上标明了解释的方差（%）。颜色/标记编码遵循图例，以区分ZAE（ZAE 1 vs ZAE 5）和发酵时间（0-96小时）。

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图9. PCA载荷突出显示了图8中区分的光谱变量：(a) FTIR载荷和(b) FT-NIR载荷对于PC1和PC2。绝对载荷值较高的峰值表示对样本分离贡献最大的波数区域。颜色编码：ZAE 1（蓝色）和ZAE 5（橙色），与手稿约定一致。

在FTNIR（带注释的叠加图）中，ZAE×时间的差异在多变量水平上表现为更高的信噪比。可见的诊断区域包括：第一个O–H泛音（约1450 nm或约6900 cm?1）、O–H组合（约1930 nm或约5200 cm?1）、C–H泛音/组合（约1720 nm/5800 cm?1；2300 nm/4400 cm?1）和N–H贡献（约1510 nm/6500 cm?1）。PCA-FTNIR（右下角面板）集中在PC1上的方差，这与发酵过程中的结合水和分散变化一致；时间通常沿PC1组织（演变），而ZAE改变了散点图（微环境和管理差异）。总体而言，FTNIR更好地区分了过程动力学（基质和水分的全球变化），而FTIR在指纹识别方面提供了功能特异性。

鉴于ZAE的显著效应，我们假设ZAE 5的独特温度和酸化轨迹可能对其CGA模式有所贡献。温度和pH是咖啡发酵动力学的关键驱动因素，在较温暖的条件下加速了微生物演替和有机酸的产生（Costa等人，2025；Vaz等人，2023）。海拔和环境依赖的咖啡微生物群变化也与发酵和收获后处理期间的酸和其他代谢物的差异有关（Rojas-Chacón等人，2024）。这些变化可能影响绿原酸的提取率和生物转化：环境条件和湿加工可以改变生豆中的CGA水平（Jo?t等人，2010），并且咖啡酰奎宁酸在水介质中会发生酰基迁移/异构化和水解，其速率受pH和温度的影响（Alcázar Maga?a等人，2021；Dawidowicz和Typek，2011）。此外，乳酸菌具有能够将5-CQA水解为咖啡酸和奎宁酸的氯原酸酯酶，支持在不同酸化条件下微生物的潜在贡献（Bel-Rhlid等人，2013）。因此，ZAE 5的较高初始温度和不同的pH轨迹可能改变了CGA的保留、浸出和酶/微生物转化之间的平衡，导致与更稳定的ZAE 1相比观察到的非线性行为。这种解释是一个假设，因为本研究中没有直接测量有机酸动力学、个别CGA异构体和微生物群组成。

4. 限制和解释范围
由于本研究没有包括微生物群落分析（例如测序）或挥发性/代谢组学测量，我们避免将特定描述符（例如蔗糖、香料、巧克力）归因于个别微生物分类单元或单一香气化合物。相反，我们根据HPLC标志物和FTIR/FTNIR模式，在区域和时间依赖的化学指纹层面解释感官差异。将微生物组+挥发性物质与当前的化学-光谱框架结合的未来工作将允许在发酵动态和描述符级别的感官变化之间建立更强的因果联系。

5. 结论
本研究表明，果实的发酵时间会产生区域依赖的变化，这些变化最好通过绿原酸（HPLC）和通过化学计量学解释的FTIR/FTNIR光谱指纹来捕捉，而物理和感官指标提供了实际质量结果的补充证据。长达72小时的发酵可以保持高感官质量，得分在Specialty Coffee Association（SCA）量表上为78到86分，而超过这个时间的发酵开始损害豆子的物理质量，表现为 parchment百分比的增加和优质咖啡完整性的下降。同样，感官属性（如香气、风味和余味）的变化主要受农业生态区的影响，农业生态区1（ZAE 1）在整个过程中表现出最稳定的属性。微气候条件（如温度和pH）和区域特定的温度/pH条件与不同的化学轨迹和光谱指纹相关；微生物驱动因素是合理的，但在本研究中没有直接评估，这影响了产品的最终质量。最终，监测和控制水果发酵过程至关重要，这需要考虑到每个区域的具体条件，以便优化咖啡品质并减少采后损失，从而支持基于证据的决策，以减少采后损失并保持咖啡的品质。

**伦理声明**
感官评估由经过培训的成年品鉴师（四位认证的Q级品鉴师）按照SCA品鉴协议进行。参与者是自愿的；研究目的和程序事先已向他们解释清楚，并获得了书面知情同意。研究过程中没有使用任何强制手段，也没有收集任何个人身份信息或敏感数据，结果仅以汇总形式报告。根据哥伦比亚法规以及参与机构的政策，这种类型的食品感官评估无需正式的伦理委员会批准；因此，本研究被认为无需经过伦理委员会审查。研究中未涉及任何弱势群体。

**资金声明**
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门任何资助机构的特定资助。

**未引用参考文献**
(Pe?uela-Martínez等人，2013年)

**关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明**
在准备本研究报告的过程中，作者仅使用ChatGPT（GPT-5.2 Thinking）来改进英语语法、拼写和可读性。作者根据需要对输出内容进行了审核和编辑，并对出版物的内容负全责。