在自然环境中，经过本地适应的拟南芥（Arabidopsis thaliana）品系在全基因组基因表达的多时间尺度分析中表现出转录组可塑性

《Plant Biology》：Locally adapted Arabidopsis thaliana accessions show transcriptomic plasticity in a multi-timescale analysis of whole-genome gene expression in a natural environment

　　摘要

识别参与植物发育的基因、调控网络和环境信号是植物科学中的一个重要目标。然而，基因和调控网络并非在受控的环境条件下进化而来，而是在自然环境中进化的。因此，在自然环境中进行实验对于真实地解析植物发育的潜在机制至关重要。我们在两个不同的年份里，在自然环境中进行了共同花园实验，以量化拟南芥（Arabidopsis thaliana）生命周期表型中的全基因组基因表达模式，时间跨度包括昼夜、季节和年度。这些自然种群通过调整关键的生活史特征，适应了西班牙南部不同海拔高度的环境。我们发现，种群间的差异、季节性（在不同发育阶段）和昼夜（早晨和下午）的比较主要影响了全基因组的基因表达。我们检测到大多数具有不同表达模式的基因来自各种生物学功能和与开花相关的调控途径，并且这些基因在所有自然种群中都是共有的。尽管如此，早期开花时间相似的种群也表现出更相似的基因表达模式。我们还检测到多个与开花时间相关的基因，这些基因来自已知的调控途径，尤其是在光周期和生物钟途径中。总体而言，我们的结果强调了自然拟南芥种群在生命周期表型和全基因组基因表达模式方面的显著可塑性，表明在适应性变异研究中，自然种群相对于实验室品系具有更大的价值。

引言

植物发育及其背后的基因调控网络是多种环境信号在不同时间尺度上整合的结果（Gibson 2008；Richards等人2012；Wang等人2024；Redmond等人2025）。特别是昼夜温差以及温度和光照条件的季节性波动，可能是影响发育转变过程中基因调控网络的最重要非生物信号，这些转变具有重大的进化意义，例如从营养生长到生殖生长的转变（Koornneef等人1998）。此外，每年环境条件的变化增加了理解植物如何调节发育阶段以完成生命周期的复杂性，因为在自然环境中没有两年是完全相同的（de la Mata等人2024）。因此，所有昼夜、季节和年度时间尺度都是必要的，以解开整个生命周期表型中的基因表达模式（即从种子到种子的发育事件的季节性时间安排），这是植物适应性变异的关键目标（Donohue 2005；Debieu等人2013；Burghardt等人2015；Vidigal等人2016；Marcer等人2018）。在自然环境中评估基因表达非常重要，因为基因调控网络实际上是在这些环境中进化的（Richards等人2012；Plessis等人2015；Kudoh 2016；Antoniou-Kourounioti等人2018；Hepworth等人2018, 2020；Song等人2018；Nagano等人2019；Groen等人2020, 2022；H?m?l?等人2022；Satake等人2022；Bhaskara等人2023；Walter等人2023；Nishio等人2024）。在大多数这些实验研究中，控制条件下获得的幼苗或莲座叶被放置在户外，以便在不同时间和发育阶段收集组织进行基因表达分析。这种做法避免了户外种子萌发的风险，因为种子萌发不规律且变量大，可能会影响基因表达谱的比较。然而，这种方法忽略了发育转变（例如种子萌发和开花时间）在生命周期表型中的相互关系，因为这些转变在不同发育阶段具有多效性（Wilczek等人2009；Huang等人2010；Chiang等人2013；Donohue 2014；Burghardt等人2015）。尽管我们缺乏比较户外萌发的植物与作为幼苗或莲座叶放置的相同基因型植物之间的基因表达模式的数据，但环境变化对基因表达的复杂而深远的影响要求我们采用生态学方法，考虑自然条件下的整个生命周期表型。在这里，我们进行了共同花园实验，以量化自然环境中野生拟南芥种群在整个生命周期表型中的全基因组基因表达模式，这些种群适应了西班牙南部不同海拔高度的环境。在这些实验中，我们考虑了所有与基因表达模式相关的时间尺度，包括昼夜（早晨和下午）、季节（营养生长、诱导生长和生殖生长阶段）和年度（两年）时间尺度。由于这种密集的采样方案，我们选择了三个自然种群（加上Col-0参考品系），它们位于非常相似的纬度上，但在海拔高度上有所不同（从海平面到高海拔）。这一点很重要，因为海拔高度在很大程度上决定了关键特征的适应性变异（例如种子休眠、开花时间和开花所需的春化要求）及其在伊比利亚拟南芥中的遗传基础（Méndez-Vigo等人2011；Kronholm等人2012；Vidigal等人2016；Marcer等人2018）。这项研究的具体目标如下：(i) 适应当地环境的拟南芥种群在基因表达的全基因组模式上随时间尺度有何差异？我们预计，适应当地环境的种群和主要的时间尺度（主要是季节性和昼夜性）会在每年结构化基因表达，因为年度环境差异对基因表达的影响应该小于明显的昼夜和季节性变化。(ii) 不同种群在时间尺度上独特和共享的差异表达基因的数量和类型是否有所不同？如果种群进化的环境不仅塑造了生活史特征，还影响了基因表达模式，我们预计来自相似环境的种群在时间尺度上会有更多共享的差异表达基因。(iii) 参与开花时间的基因及其调控途径在不同种群间的表达是否有所不同？鉴于不同种群在开花时间及其生理要求上的差异，我们预计差异表达的开花相关基因在不同种群间会有显著差异。

材料与方法

我们使用了来自西班牙南部的三个自然拟南芥种群（Bon、Moj和Vel；图1a）和Col-0参考品系（以下简称Col），在自然环境中获取全基因组基因表达数据。Bon（Bonanza；加的斯省）是多尼亚纳自然保护区内的低海拔河岸松林，Moj（Montejaque；马拉加省）是格拉萨莱马自然公园边缘以栓皮栎为主的中海拔地中海森林，Vel（Veleta；格拉纳达省）是内华达山脉国家公园中的高海拔草地（图1b）。这些种群位于受保护的区域，人类干扰较少，纬度非常相似（表1），因此所有研究种群全年都有相同的日照时间。图1展示了三个自然拟南芥种群的位置及其海拔高度（括号内标注），以及用于分析自然环境中基因表达模式的实验设施。图1a还展示了三个种群的主要植被类型，图1b展示了实验设施中每个种群的幼苗盆栽，图1c展示了每日最高温度（红色）、最低温度（蓝色）和降水量（绿色）在2020-2021年和2021-2022年两次实验期间的变化情况。表1提供了关于这三个自然种群（Bon、Moj和Vel）的描述性信息，这些种群在共同花园实验中用于量化自然环境中基因表达的全基因组模式，时间跨度包括昼夜、季节和年度。

来源种群

我们使用了来自西班牙南部的三个自然拟南芥种群（Bon、Moj和Vel；图1a）和Col-0参考品系（以下简称Col），在自然环境中获取全基因组基因表达数据。Bon（Bonanza；加的斯省）是多尼亚纳自然保护区内的低海拔河岸松林，Moj（Montejaque；马拉加省）是格拉萨莱马自然公园边缘以栓皮栎为主的中海拔地中海森林，Vel（Veleta；格拉纳达省）是内华达山脉国家公园中的高海拔草地（图1b）。这些种群位于受保护的区域，人类干扰较少，纬度非常相似（表1），因此所有研究种群全年都有相同的日照时间。表1还提供了关于这三个自然种群的描述性属性，包括经度（°W）、纬度（°N）、海拔高度（m.a.s.l.）、月平均最低温度（°C）、月平均最高温度（°C）、年总降水量（mm）、土壤pH值、自然植被类型百分比、残遗遗传簇百分比、种子休眠期（DSDS50；天数）、开花时间（无春化要求时；天数）以及开花所需的春化要求。

材料与方法

我们使用了来自西班牙南部的三个自然拟南芥种群（Bon、Moj和Vel；图1a）和Col-0参考品系（以下简称Col），在自然环境中获取全基因组基因表达数据。Bon（Bonanza；加的斯省）是多尼亚纳自然保护区内的低海拔河岸松林，Moj（Montejaque；马拉加省）是格拉萨莱马自然公园边缘以栓皮栎为主的中海拔地中海森林，Vel（Veleta；格拉纳达省）是内华达山脉国家公园中的高海拔草地（图1b）。这些种群位于受保护的区域，人类干扰较少，纬度非常相似（表1），因此所有研究种群全年都有相同的日照时间。表1还提供了关于这三个自然种群的描述性属性，包括经度（°W）、纬度（°N）、海拔高度（m.a.s.l.）、月平均最低温度（°C）、月平均最高温度（°C）、年总降水量（mm）、土壤pH值、自然植被类型百分比、残遗遗传簇百分比、种子休眠期（DSDS50；天数）、开花时间（无春化要求时；天数）以及开花所需的春化要求。

共同花园实验

我们在El Castillejo植物园（36.46°N, 5.30°W, 326 m；加的斯省，ES）进行了两次共同花园实验（2020-2021年和2021-2022年），该地点的纬度与这三个自然种群相似，海拔高度介于Bon和Moj之间（图1a）。我们之前已经使用数百个不同的伊比利亚拟南芥种群进行了实验，所有这些种群都完成了从种子萌发到种子散布的整个生命周期（Manzano-Piedras等人2014；Exposito-Alonso等人2018；Gómez等人2018；Méndez-Vigo等人2022；de la Mata等人2024）。对于这些种群，我们在2010年代初从自然种群中收集种子，在温室中通过单粒种子繁殖（马德里国家生物技术中心，ES），并在室温下黑暗条件下储存。对于这项研究，我们在2020年的冬季和春季再次繁殖种子。为了确保种子充分成熟，新繁殖的种子被储存在透明塑料袋中，在室温下和黑暗条件下保存了几个月，直到2020年11月5日和2021年11月10日播种。每个种群包括20个重复实验，每个重复实验播种250粒种子（图1c），种子种植在塑料盆中（12 × 12 × 12 cm3），盆内填充了减少泥炭的培养基（Blumenerde，Gramoflor Ibérica SLU，Moixent，ES）。在这两年中，我们将盆栽放置在完全相同的位置，以避免空间异质性对植物发育和基因表达的影响。两次实验期间的每日最低和最高温度以及降水量数据来自附近的自动气象站（36.43°N, 5.30°W, 295 m；El Bosque，加的斯省，ES）。基于我们在El Castillejo植物园进行的拟南芥共同花园实验，我们能够估计种群的发育阶段，这有助于我们设计采样方案（图1d）。我们在两个年份几乎相同的日期采集了营养生长阶段（即当茎分生组织开始致力于开花时）和生殖生长阶段（抽薹）的样本（图1d和表2）。由于在拟南芥中难以通过表型识别花诱导阶段，我们假设在生殖阶段之前的最后一次采样对应于所有种群的诱导阶段（即生殖阶段采样前15天）。总体而言，我们每年对两个早开花种群（Bon和Moj）和两个晚开花种群（Col和Vel）进行了3-4次采样（表2）。采样日期及其对应的发育阶段（营养生长期、诱导期和生殖期），这些样本来自西班牙南部的三个拟南芥（Arabidopsis thaliana）自然种群（Bon、Moj和Vel），在共同花园实验中生长，以量化自然环境中的全基因组基因表达模式。

实验
采样日期

#1（2020–2021）
2020年12月30日
2021年2月3日
2021年2月18日
2021年3月4日

#2（2021–2022）
2022年1月5日
2022年2月2日
2021年2月17日
2021年3月3日

每个采样日期，我们在上午和下午各采集三次样本，每次三个重复，每个实验共84个样本。破折号表示由于种群此时已经完成生长周期，没有可采集的植物。上标1和2用于区分图2中晚开花种群的两个营养生长期，即Veg1和Veg2。

在每次采样中，我们分别在上午（10:00至10:30）和下午（15:30至16:00）各采集约20分钟的样本。每次采样每个种群采集三个重复样本，每个重复包含五株相似的植物，以减少使用单株植物时对全基因组基因表达模式的影响。总共每年（两年两个实验）采集84个样本，结合了日变化（上午和下午）和季节变化（营养生长期、诱导期和生殖期）的时间尺度，四个种群各重复三次（表2）。我们保留了莲座叶的地上部分用于RNA提取，丢弃了所有样本的根部和处于生殖期的茎部。我们使用铝箔袋将样本储存在液氮中，并使用低温运输瓶（KGW-Isotherm，Karlsruhe，DE）。样本随后在实验室的冷冻柜中以-80°C保存，直到进行RNA提取。

2021年和2022年春季，我们使用ISOLATE II RNA Plant Kit（Meridian Bioscience Inc.，Cincinnati，OH，USA）从每个实验中提取了总RNA（每年84个样本）。柱上DNase处理（Meridian Bioscience Inc.，Cincinnati，OH，USA）去除了任何DNA污染。RNA浓度通过NanoDrop光度计进行检测（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）。按照制造商的建议，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit v.2（Illumina，San Diego，CA，USA）进行文库制备。测序深度为每个样本3000万个读段，使用Illumina HiSeq 4000测序仪进行，以100个核苷酸长的配对末端运行。每个样本有两个生物学重复。

我们通过FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行了质量控制分析。然后使用HISAT2（Kim et al. 2019）将读段映射到每个种群的索引参考基因组上。获得的序列比对图（SAM）格式结果使用Samtools（Danecek et al. 2021）转换为二进制比对图（BAM）文件，并使用deepTools的bamCoverage工具转换为BigWig文件（Ramírez et al. 2016）。我们使用BAM文件和注释的参考基因组，通过StringTie（Pertea et al. 2015）计算FPKM（每百万映射片段的转录本片段数）来估计基因表达。

在2021年和2022年春季，我们从每个实验中提取了总RNA（每年84个样本）。使用ISOLATE II RNA Plant Kit（Meridian Bioscience Inc.，Cincinnati，OH，USA）进行提取。柱上DNase处理（Meridian Bioscience Inc.，Cincinnati，OH，USA）去除了任何DNA污染。RNA浓度通过NanoDrop光度计进行检测（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）。按照制造商的建议，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit v.2（Illumina，San Diego，CA，USA）进行文库制备。测序深度为每个样本3000万个读段，使用Illumina HiSeq 4000测序仪进行，以100个核苷酸长的配对末端运行。每个样本有两个生物学重复。

我们通过FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行了质量控制分析。然后使用HISAT2（Kim et al. 2019）将读段映射到每个种群的索引参考基因组上（Tabas-Madrid et al. 2018）。在序列比对图（SAM）格式中获得的结果使用Samtools（Danecek et al. 2021）转换为二进制比对图（BAM）文件，并使用deepTools的bamCoverage工具转换为BigWig文件（Ramírez et al. 2016）。我们使用BAM文件和注释的参考基因组，通过StringTie（Pertea et al. 2015）计算FPKM（每百万映射片段的转录本片段数）来估计基因表达。

我们对数据进行了探索性分析，使用Ballgown R包（Frazee et al. 2015）。由于Vel的第三个采样的一个样本质量较低，我们将其移除。最后，我们使用NormalyzerDE软件（Willforss et al. 2019）进行了分位数归一化处理，并对数据进行了log2转换。鉴于每个样本的三个重复之间的基因表达模式一致性，我们在所有分析中使用了重复样本的平均值。对于日变化时间尺度，我们比较了每个种群的上午和下午样本。对于季节变化时间尺度，我们关注了每个种群的营养生长期与诱导期、诱导期与生殖期之间的连续比较。在所有比较中，我们使用了第一次采样的营养生长期样本。对于季节变化时间尺度，我们分别比较了上午和下午采集的样本。通过比较和测试不同年份的日变化和季节变化时间尺度，考虑了年度时间尺度（见下文）。我们使用limma v3.46.0 R包（Ritchie et al. 2015）对上述选定的对比进行了差异基因表达分析。我们使用limma，没有使用voom修改，这在处理已经归一化的连续表达数据时是可接受的。我们使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）程序（limma）筛选出差异表达基因（DEGs），对数倍数变化>1.5且调整后的P值<0.01。我们使用GeneCodis4（Garcia-Moreno et al. 2022）进行基因本体（GO）注释富集，并使用超几何分布测试进行验证。最后，我们使用调整后的P值–log10(P) = 2的阈值筛选出显著基因。总共从第一年和第二年的33,602个已知基因中保留了15,538个和14,313个DEGs。我们使用Venny v.2.1软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）识别独特的和共享的DEGs，并使用UpSetR v.1.4.0软件（https://cran.r-project.org/web/packages/UpSetR/index.html）进行图形表示。使用所有DEGs，我们使用vegan R包的adonis2函数（https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html）进行了排列多元方差分析（PERMANOVA）。PERMANOVA测试了种群（Bon、Moj、Vel和Col）、日变化（上午和下午）、季节变化（营养生长期、诱导期和生殖期）和年度时间尺度对DEGs的影响。我们估计了每个因素的边际效应、每个因素解释的方差百分比（R2），并使用999次排列进行了显著性测试。对于每个年份，我们还使用factoextra R包（https://CRAN.R-project.org/package=factoextra）进行了主成分分析（PCA）。此外，我们使用G测试检验了不同年份之间组合中检测到的DEGs数量、发育阶段之间的差异以及时间尺度之间的差异。最后，我们从FLOR-ID（Flowering-Interactive Database；Bouché et al. 2016；访问日期：2023年12月22日）下载了开花时间基因列表，该列表收集了306个已知基因及其所属的基因调控网络。我们将开花时间基因列表与通过我们统计阈值的DEGs列表进行了交叉，以识别在不同时间尺度上在拟南芥种群中差异表达的基因。

年度环境变化对植物表现的影响

我们在连续两年（2020–2021和2021–2022）的自然环境中进行了共同花园实验，以估计拟南芥种群的全基因组基因表达。11月初至3月初的日温度在两年间相当相似，最低温度（平均值±标准差分别为7.6±3.9°C和6.9°C±3.1°C）和最高温度（分别为16.6±3.9°C和17.8°C±3.0°C）（图1d）。相比之下，两年间的主要差异在于实验期间的降水量，第二年的降水量比第一年少约40%（总降水量分别为396.4毫米和220.8毫米）。此外，第一年实验期间的降水量更为均匀（CV=185.8%；图1d），而第二年（CV=356.9%；图1d）的降雨几乎完全缺失，12月中旬达到峰值（图1d）。为了将这些天气记录置于上下文中，我们从CRU-TS 4.06（Harris et al. 2020）获取了El Castillejo植物园1960–2018年的月度天气数据，并使用WorldClim 2.1（Fick & Hijmans 2017）进行了降尺度处理（访问日期：2025年1月3日）。天气记录与历史数据的比较表明，实验期间的温度比历史记录更高且更干燥（最低和最高温度的平均值±标准差分别为6.5±1.7°C和15.0±1.7°C；总降水量分别为424.0毫米）。因此，与第二年的历史记录相比，第二年更温暖且干燥。第二年降水量の差异主要影响了每个盆中莲座叶的数量和大小，但所有种群在两年间的发育时间表相同，特别是抽薹时间，Bon和Moj在2月初，Col和Vel在2月底。由于降水量稀少且不规律，第二年的天气条件对Col的影响大于对其他三个自然种群（Bon、Moj和Vel）的影响，可能是因为Col已经不再是自然种群，而是一个经过多代人工选择的实验室品系。实际上，在同一设施中对Col和Ler参考品系进行的先前实验也显示了表现差异（例如，植物数量较少、体型较小和/或早死），特别是在恶劣的年份（F.X. Picó，未发表的数据）。

我们使用所有在所有对比中保留的DEGs，通过PERMANOVA和PCA（图2）测试和可视化了不同种群（Bon、Moj、Vel和Col）和时间尺度（日变化、季节变化和年度）之间的全基因组基因表达模式。种群和所有时间尺度显著解释了DEGs的变化（F > 6.86，P < 0.001；PERMANOVA），尽管种群和季节时间尺度解释的方差比例高于日变化和年度时间尺度（图2a）。为了可视化种群和采样如何分组，我们分别对每年进行了PCA分析。然而，Spearman等级相关性表明，前两个轴的主成分分别解释了第一年和第二年52%和56%的变化，表明两年间没有差异（Spearman's rho分别为0.98和0.97；P < 0.0001）。因此，我们估计了每年每个样本的平均主成分。图2显示了两个不同年份（2020–2021和2021–2022）在自然环境中进行的两个实验中拟南芥种群（Bon、Moj、Vel和Col）的全基因组基因表达模式的PERMANOVA（a）和排序分析（PCA）结果。PERMANOVA显示了每个因素的R2值。PCA结果是每个样本的实验间平均主成分。代码：veg表示营养生长期，ind表示诱导期，rep表示生殖期，m表示上午，a表示下午。上标1和2用于区分晚开花种群的两个营养生长期，即veg1和veg2。对于三个自然种群（Bon、Moj和Vel），我们发现了季节变化和日变化时间尺度之间的明显模式。简而言之，所有营养生长期样本集中在左侧，所有诱导期和生殖期样本集中在右侧，上午和下午采集的样本分别位于PCA的下方和上方（图2b）。值得注意的是，晚开花自然种群（Vel）的第二个营养生长期样本（编码为veg2）与各自的上午和下午采样中的诱导期和生殖期样本分组在一起（图2b），表明这些被认为是营养生长期的样本已经过渡到诱导期。Col样本也清晰地分为上午和下午的采样，尽管营养生长期、诱导期和生殖期样本倾向于分组在一起（图2b）。这一结果可能解释了种群对DEGs变化的影响，表明Col的表现不典型。除了分组模式的差异外，Col在第二年的表现也较差，因为它显示的DEGs数量较少，且GO注释富集中的基因代表性较低。由于其非伊比利亚起源或缺乏FRI（一个关键的春化基因）等，可能导致Col在户外表现不佳。因此，我们展示了包括三个自然种群的结果，并在图S1和S2中展示了完整分析。

我们分析了自然种群之间显著共享的DEGs数量以及每个种群在日变化时间尺度（上午和下午）每个发育阶段和年份中独特检测到的DEGs数量（图3）。总体而言，年度间共享的DEGs数量以及每个种群中独特检测到的DEGs数量在年度间显著不同（χ2 > 19.2，P < 0.0001；G测试），生殖期共享DEGs的数量除外（χ2 = 6.7，P = 0.080；G测试）。此外，两年中，不同发育阶段的独特DEGs和共享DEGs在每日比较中的数量存在显著差异（χ2 >22.0，P < 0.0002；G检验）。图3在图查看器中打开

图3显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）在全基因组基因表达模式上的UpSet图，时间尺度为每天（上午和下午采样），包括营养（a-b）、诱导（c-d）和生殖（e-f）阶段。结果显示了每个发育阶段和年份中，不同接入点之间的独特和共享差异表达基因（DEGs）。在第一年，营养阶段大多数DEGs是共享的（图3a）。相比之下，在诱导和生殖阶段，大多数DEGs是特定于每个接入点的，特别是对于早花接入点Bon和Moj（图3c,e）。此外，除了第二年的诱导阶段外，两年中Bon和Moj之间的共享DEGs数量始终多于这些接入点与晚花接入点Vel之间的共享DEGs数量（图3）。在每个接入点的独特DEGs方面，Bon和Moj在第一年的所有阶段都显示出更多的DEGs（图3a,c,e）。因此，具有相似开花行为的接入点在诱导和生殖阶段共享了共同的DEGs模式。然而，这些模式在第二年的不同发育阶段中并不一致（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。仔细观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。然而，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。尽管如此，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。尽管如此，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。尽管如此，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。尽管如此，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍。尽管如此，我们在第二年的不同发育阶段发现了这些模式的不一致性（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S2和S3）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能上存在显著差异（χ2 >95.5，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物和生物胁迫相关的基因数量在营养到诱导的转变中最多，无论是在上午还是下午的采样中（图4b,d）。相比之下，在营养到生殖的转变中，与其他生物过程相关的基因数量更类似于那些参与胁迫响应的基因（图4f,g）。我们在第二年的营养到诱导的转变中也观察到了类似的模式，但仅在上午的采样中（图4b,f），因为在下午的采样中任何生物功能的基因数量都非常低或不存在（图4d,g）。进一步详细分析两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍，特别是在诱导和生殖阶段。然而，我们发现参与基本细胞过程的基因（例如，转录调控）在所有接入点中都占主导地位（图4a,c,e和数据集S1）。图4在图查看器中打开

图4显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj、Vel和Col）的全基因组基因表达模式中，不同生物功能在时间尺度（每日、季节性和年度）上显著过度表达的基因数量。结果仅显示了两年中每个发育阶段（a、c和e）以及每天（上午和下午）的每个发育转变（b、d、f和g）中三种自然接入点之间共有的基因（有关更多详细信息，请参见文本和数据集S1）。我们分析了每天（上午和下午）和每年（图5）中自然接入点之间显著共享的DEGs数量，以及每个接入点在营养到诱导和营养到生殖转变中独特检测到的DEGs数量。最初，我们还包括了诱导到生殖的转变，但结果表明，我们的分析中DEGs的数量、来自不同生物过程的基因数量以及开花时间基因的数量几乎不存在（图S3；数据集S4和S5）。这意味着在我们的实验中，诱导和生殖阶段在基因表达模式方面相当相当。总体而言，两年中接入点之间共享的DEGs数量以及每个接入点的独特DEGs数量在发育转变中存在显著差异（χ2 >247.6，P < 0.0001；G检验）。图5在图查看器中打开

图5显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）的全基因组基因表达模式在季节性时间尺度（发育转变比较：营养到诱导和营养到生殖）上的UpSet图，时间尺度为上午（a、b、e和f）和下午（c、d、g和h）。结果显示了每个比较和年份中接入点之间的独特和共享差异表达基因（DEGs）。在两年中，我们检测到在上午（图5a,b,e,f）的营养到诱导和营养到生殖转变中，自然接入点之间有大量的DEGs共享，但在下午（图5c,d,g,h）的采样中则没有。实际上，下午检测到的DEGs数量少于上午的数量，特别是早花接入点Moj在下午的两个转变中显示出更多的DEGs。总体而言，早花接入点Bon和Moj之间的DEGs数量大于它们与晚花接入点Vel之间的DEGs数量，在两年中的几乎所有转变中都是如此（图5）。就每个接入点的独特DEGs数量而言，Bon和Moj在第一年的所有阶段都显示出比Vel更多的DEGs（图3a,c,e）。因此，具有相似开花行为的接入点在诱导和生殖阶段共享了共同的DEGs模式。这些模式在第二年的不同发育阶段中变得不一致（图3b,d,f）。然而，在每日时间尺度上，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于两个接入点组合或单个接入点（数据集S1）。因此，我们专注于接入点之间的共享基因，以描绘生物过程、发育阶段和年份之间的差异（图4）。总体而言，每个发育阶段的基因数量在生物功能和年份上存在显著差异（χ2 >26.9，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物胁迫相关的基因数量从营养阶段到生殖阶段减少。参与细胞过程的基因数量在营养和诱导阶段较高，在生殖阶段减少。相比之下，参与昼夜节律和光响应的基因在诱导阶段趋于达到峰值。其他生物过程（光合作用和激素）在两年中的所有发育阶段都保持较低或中等水平。在第二年，这些模式不太明显（图4a,c,e和数据集S1），过度表达的基因数量较少。更仔细地观察两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍，特别是在诱导和生殖阶段。尽管如此，我们发现参与基本细胞过程的基因（例如，转录调控）在所有接入点中占主导地位（图4a,c,e和数据集S1）。图4在图查看器中打开

图4显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj、Vel和Col）的全基因组基因表达模式中，不同生物功能在时间尺度（每日、季节性和年度）上显著过度表达的基因数量。结果仅显示了两年中每个发育阶段（a、c和e）以及每天（上午和下午）的每个发育转变（b、d、f和g）中三种自然接入点之间共有的基因（有关更多详细信息，请参见文本和数据集S1）。我们分析了每天（上午和下午）和每年（图5）中自然接入点之间显著共享的DEGs数量，以及每个接入点在营养到诱导和营养到生殖转变中独特检测到的DEGs数量。最初，我们还包括了诱导到生殖的转变，但结果表明，我们的分析中DEGs的数量、来自不同生物过程的基因数量以及开花时间基因的数量几乎不存在（图S3；数据集S4和S5）。这意味着在我们的实验中，诱导和生殖阶段在基因表达模式方面相当相当。总体而言，两年中接入点之间共享的DEGs数量以及每个接入点的独特DEGs数量在发育转变中存在显著差异（χ2 >247.6，P < 0.0001；G检验）。图5在图查看器中打开

图5显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）的全基因组基因表达模式在季节性时间尺度（发育转变比较：营养到诱导和营养到生殖）上的UpSet图，时间尺度为上午（a、b、e和f）和下午（c、d、g和h）。结果显示了每个比较和年份中接入点之间的独特和共享差异表达基因（DEGs）。在两年中，我们在上午（图5a,b,e,f）的营养到诱导和营养到生殖转变中检测到大量自然接入点之间共享的DEGs，但在下午（图5c,d,g,h）的采样中则没有。实际上，下午检测到的DEGs数量少于上午的数量，特别是早花接入点Moj在下午的两个转变中显示出更多的DEGs。总体而言，早花接入点Bon和Moj之间的DEGs数量大于它们与晚花接入点Vel之间的DEGs数量，在两年中的几乎所有转变中都是如此（图5）。就每个接入点的独特DEGs数量而言，转变和年份之间的模式不太明显（图5）。与每日时间尺度的情况一样，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于接入点对或单个接入点（数据集S2和S3）。每个发育阶段和每天采样中，基因在生物功能和年份上的数量存在显著差异（χ2 >95.5，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物和生物胁迫相关的基因在营养到诱导的转变中最为丰富，无论是在上午还是下午的采样中（图4b,d）。相比之下，在营养到生殖的转变中，与其他生物过程相关的基因数量更类似于那些参与胁迫响应的基因（图4f,g）。我们在第二年的营养到诱导的转变中也观察到了类似的模式，但仅在上午的采样中（图4b,f），因为在下午的采样中任何生物功能的基因数量都非常低或不存在（图4d,g）。进一步详细分析两年中接入点之间共有的基因，发现参与昼夜节律的基因在所有发育阶段都非常普遍，特别是在诱导和生殖阶段。然而，我们发现参与基本细胞过程的基因（例如，转录调控）在所有接入点中占主导地位（图4a,c,e和数据集S1）。图4在图查看器中打开

图5显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj、Vel和Col）的全基因组基因表达模式中，不同生物功能在时间尺度（每日、季节性和年度）上显著过度表达的基因数量。结果仅显示了两年中每个发育阶段（a、c和e）以及每天（上午和下午）的每个发育转变（b、d、f和g）中三种自然接入点之间共有的基因（有关更多详细信息，请参见文本和数据集S1）。我们分析了每天（上午和下午）和每年（图5）中自然接入点之间显著共享的DEGs数量，以及每个接入点在营养到诱导和营养到生殖转变中独特检测到的DEGs数量。最初，我们还包括了诱导到生殖的转变，但结果表明，我们的分析中DEGs的数量、来自不同生物过程的基因数量以及开花时间基因的数量几乎不存在（图S3；数据集S4和S5）。这意味着在我们的实验中，诱导和生殖阶段在基因表达模式方面相当相当。总体而言，两年中接入点之间共享的DEGs数量以及每个接入点的独特DEGs数量在发育转变中存在显著差异（χ2 >247.6，P < 0.0001；G检验）。图5在图查看器中打开

图5显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）的全基因组基因表达模式在季节性时间尺度（发育转变比较：营养到诱导和营养到生殖）上的UpSet图，时间尺度为上午（a、b、e和f）和下午（c、d、g和h）。结果显示了每个比较和年份中接入点之间的独特和共享差异表达基因（DEGs）。在两年中，我们在上午（图5a,b,e,f）的营养到诱导和营养到生殖转变中检测到大量自然接入点之间共享的DEGs，但在下午（图5c,d,g,h）的采样中则没有。实际上，下午检测到的DEGs数量少于上午的数量，特别是早花接入点Moj在下午的两个转变中显示出更多的DEGs。总体而言，早花接入点Bon和Moj之间的DEGs数量大于它们与晚花接入点Vel之间的DEGs数量，在两年中的几乎所有转变中都是如此（图5）。就每个接入点的独特DEGs数量而言，转变和年份之间的模式不太明显（图5）。与每日时间尺度的情况一样，所有自然接入点共有的基因在各种生物过程中的过度表达数量不成比例地多于接入点对或单个接入点（数据集S2和S3）。每个发育阶段和每天采样中，基因在生物功能和年份上的数量存在显著差异（χ2 >95.5，P < 0.0001；G检验）。在第一年，与非生物和生物胁迫相关的基因在营养到诱导的转变中最为丰富，无论是在上午还是下午的采样中（图4b,d）。相比之下，在营养到生殖的转变中，与其他生物过程相关的基因数量更类似于那些参与胁迫响应的基因（图4f,g）。我们在第二年的营养到诱导的转变中也观察到了类似的模式，但仅在上午的采样中（图4b,f），因为在下午的采样中任何生物功能的基因数量都非常低或不存在（图4d,g）。进一步详细分析两年中接入点之间共有的基因，发现在上午的营养到诱导和营养到生殖的转变中，大多数基因涉及对生物胁迫（例如，细菌、真菌）和激素响应（例如，水杨酸和油菜素内酯）的响应，但在下午则没有（数据集S2和S3）。上调和下调DEGs的分布

上调和下调DEGs的分布在每个接入点中一致地上调或下调，并显示出不同的发育阶段和转变的特定变化模式（表3）。一方面，在上午-下午比较中，所有生物功能的上调DEGs比例在营养阶段最高（范围=0.49–1.00），在诱导阶段中等（范围=0.41–0.50），在生殖阶段最低（范围=0.00–0.32）。另一方面，一些生物功能在两个发育转变中都显示出较高的上调DEGs比例，特别是那些与胁迫响应、激素和发育相关的功能，在上午和下午的采样中都是如此（范围=0.54–0.98）。相比之下，其他生物功能在营养到诱导和营养到生殖的转变中显示出不同的上调DEGs比例，例如那些来自细胞过程和细胞壁的功能，在营养到生殖的转变中增加。最后，光响应和光合作用在两个转变中都显示出较低的上调DEGs比例（范围=0.00–0.42）。表3显示了在共同花园实验中生长的来自西班牙南部的三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）的三个接入点中，生物功能和发育阶段及转变的上调和下调差异表达基因（DEGs）的比例。

功能
营养（m-a）
诱导（m-a）
生殖（m-a）
营养到诱导（m）
营养到诱导（a）
营养到生殖（m）
营养到生殖（a）
营养到生殖（m）
营养到生殖（a）

上调/下调
上调/下调
上调/下调
上调/下调
上调/下调
上调/下调
上调/下调
上调/下调

非生物胁迫
0.65/0.35
0.50/0.50
0.00/1.00
0.73/0.27
0.54/0.46
0.74/0.26
0.64/0.36

生物胁迫
–
–
–
0.98/0.02
0.92/0.08
0.94/0.06
0.94/0.06

细胞过程
0.51/0.49
0.41/0.59
0.30/0.70
0.94/0.06
0.73/0.27
0.15/0.85
0.55/0.45

昼夜节律
0.49/0.51
0.48/0.52
0.32/0.68
–
0.29/0.71
–
–

细胞壁
–
–
–
0.33/0.67
0.33/0.67
–
0.83/0.17

发育
–
–
–
0.94/0.06
0.88/0.12
0.93/0.07
0.84/0.16

基因胁迫
–
–
–
0.95/0.05
0.87/0.13
0.98/0.02
0.82/0.18

激素
0.69/0.31
0.50/0.50
–
0.85/0.15
0.75/0.25
0.96/0.04
0.74/0.26

光响应
1.00/0.00
0.46/0.54
0.15/0.85
–
0.00/1.00
0.42/0.58
0.30/0.70

光合作用
–
–
–
0.00/1.00
–
0.13/0.87
0.14/0.86

发育阶段：营养（veg）、诱导（ind）和生殖（rep）用于上午-下午比较（m–a）。发育转变：营养到诱导（veg-to-ind）和营养到生殖（veg-rep）在上午（m）和下午（a）。主要比例以粗体表示，没有DEGs的功能用破折号表示。跨时间尺度表达的开花相关基因

我们寻找了拟南芥中已知的开花时间基因，以描绘它们在自然环境中的表达模式。排除诱导到生殖的转变（图S3和数据集S5），我们从六个调控途径中识别出35个开花相关基因，2个分生组织身份基因和1个开花时间整合基因（图6和数据集S5）。调控途径包括与衰老、温度、昼夜节律、内部（主要是赤霉素）、光周期和春化作用相关的过程。我们最多检测到这些开花时间基因66次。其中大多数基因（57次中的57个；86.4%）在三种自然接入点之间共享，在Bon和Moj之间共享较少（66次中的4次；6.1%）或在Bon中共享较少（66次中的3次；4.5%）。最后，我们只在Moj中发现了1个基因，以及在Moj和Vel之间共享了1个基因（66次中的1次；1.5%）。图6在图查看器中打开

图6显示了在自然环境中进行的两年（2020-2021年和2021-2022年）中，三种野生拟南芥（Bon、Moj和Vel）的全基因组基因表达分析中，涉及开花的调控途径和基因。结果显示了每个接入点在每日（上午与下午；a、c和e）和季节性（发育转变：营养到诱导（b）和营养到生殖（d）时间尺度上每个基因的对数倍数变化。我们主要在第一年（35个基因中的14个；40.0%）或两年中（35个基因中的13个；37.1%）检测到这些开花相关基因，而在第二年仅较少（35个基因中的8个；22.9%；图6和数据集S5）。在第一年检测到的大多数基因属于内部（7个基因中的6个；85.7%）和光周期（11个基因中的7个；63.6%）途径，而所有昼夜节律途径的基因（8个基因中的8个；100.0%）在两年中都检测到。最后，两个分生组织身份基因（AGL8和AP1）和两个春化基因（AGL19和FLC）仅在第二年检测到，而另一个春化基因（VIN3）和开花时间整合基因（SOC1）分别在第一年和两年中都检测到。在每日时间尺度上，三个发育阶段积累了最多的开花时间基因（66次中的13个；19.7%；图6和数据集S5）。营养到生殖的转变在上午（66次中的9个；13.6%）和下午（66次中的7个；10.6%）的采样中也有一定数量的开花基因。营养到诱导的转变在上午（66次中的5个；7.6%）和下午（66次中的6个；9.1%）的采样中检测到的开花基因数量最少。开花时间整合基因（SOC1）、一个春化基因（FLC）和两个分生组织身份基因（AGL8和AP1）主要在营养到生殖的转变中检测到。最终，开花时间基因最能代表的调控途径是光周期（35次中有11次；31.4%）和生物钟（35次中有8次；22.9%），这些途径在几乎所有发育阶段和日时间尺度上都被检测到（图6和数据集S5）。内部途径也由大量基因代表（35次中有7次；20.0%），其次是其他途径（衰老、温度和春化作用）、开花时间整合因子（SOC1）以及两个分生组织身份基因（AGL8、AP1）。最后，在所有发育阶段和发育转变中，与衰老、温度、春化作用和分生组织身份相关的基因都被发现上调（图6）。相比之下，生物钟、内部途径和光周期途径以及开花时间整合因子的基因表现出上调和下调的混合现象（图6）。

讨论

要理解植物如何在整个生命周期中整合多种环境信号，一个重要的步骤是估计自然环境中的基因表达模式（Gibson 2008；Richards等人2012；DeBiasse & Kelly 2016；Maple等人2024）。将生态学方法纳入发育和功能遗传学研究，使研究人员能够提出新的问题，例如研究局部适应种群之间的基因调控网络差异，以理解适应性变异的机制（Gould等人2018；Honjo & Kudoh 2019；Hepworth等人2020；Bhaskara等人2023）。在这里，我们在自然环境中进行了共同花园实验，使用了一组局部适应的品系，以量化拟南芥生命周期表型相关所有时间尺度上的全基因组基因表达模式，并测试不同品系之间的发育差异是否转化为整体基因表达模式和特定开花相关基因调控网络的差异。我们研究的首个主要结果是，品系之间的差异以及与发育阶段相对应的季节时间尺度，在很大程度上解释了这组品系（包括三个自然伊比利亚品系和Col参考品系）的全基因组基因表达模式的变异（图2a）。值得注意的是，Col的全基因组基因表达模式与其他品系有显著差异（图2b），特别是在实验期间条件较干燥的第二年（图1d），这极大地影响了植物数量、植物大小和检测到的DEGs数量（图S1和S2）。这一结果表明，在自然环境中进行的基因表达研究应使用自然品系，因为实验室品系可能过于人工化，无法在户外产生可靠的结果（但参见Hepworth等人2018, 2020年的满意结果），尤其是与自然品系相比。就这三个自然品系而言，我们发现Bon和Moj这两个早开花品系在多个发育阶段和日时间尺度及季节时间尺度上的共享DEGs数量有明显的相似趋势，而与晚开花品系Vel相比则没有这种相似性（图3和5）。这一结果表明，环境介导的表型相似性，如拟南芥的开花时间，也影响了全基因组基因表达模式。实际上，实验设施的环境条件与Bon和Moj种群的环境条件更为相似，这加强了适应局部环境在拟南芥中的作用的证据（Arana & Picó 2025；Brachi等人2025）。从这个意义上说，2020年秋季到2021年春季在每个起源种群进行的野外调查显示，Bon和Moj的关键事件（例如，晚秋的招募、仲冬的莲座体建立和二月初的开花）与我们在实验中观察到的事件完全吻合（F. X. Picó，个人观察）。相比之下，Vel种群中的拟南芥在晚春和夏季发芽、生长和开花（F. X. Picó，个人观察），因为高海拔地区的天气条件过于恶劣，无法以营养莲座体的形式越冬。因此，尽管所有这些结果表明表型相似性可能会影响全基因组基因表达模式，但最终证明需要通过互惠移植实验来验证，即所有品系在原产地和异地环境中完成整个生命周期（如H?m?l?等人2022；Bhaskara等人2023）。另一方面，季节性（跨发育阶段）和日时间尺度（早晨和下午）对全基因组基因表达模式的影响并不令人惊讶。这是因为年度植物中主要发育转变的进化相关性对全基因组转录变异有重大影响（Richards等人2012；Wang等人2024；Redmond等人2025），以及光相关信号在植物发育中的关键作用（Huq等人2024）。然而，值得注意的是，条件更为严酷的第二年显著改变了DEGs的模式（图3和5），并大大减少了不同生物过程的显著过表达GO术语的数量（图4）。此外，开花相关基因及其调控途径的表达也表现出显著的年际变化（图6），因为一些调控途径在第一年被大量检测到（例如，内部和光周期途径），在两年中都被检测到（例如，生物钟途径），或在第二年（例如，春化途径和分生组织身份基因）。总体而言，这一发现对基于单次实验的自然环境中基因表达的研究提出了警告，因为环境压力的水平可能难以识别且难以控制，可能会以不可预测的方式影响结果（参见Hepworth等人2020）。然而，要了解某一年度或两年中基因、生物功能和调控途径的普遍性的确切原因，需要更长时间的全基因组基因表达数据和更广泛的品系样本。我们研究的第二个重要结果表明，表型可塑性是拟南芥进化动态的一部分，正如其他研究所示（Wilczek等人2009；Scheepens等人2018；Taylor等人2019；de la Mata等人2024；Arana & Picó 2025）。特别是，所有品系，尤其是Col和Vel，都根据实验设施的环境条件调整了它们的表型，并在两次实验中完成了整个生命周期，这突显了这些品系的适应性行为。此外，我们的基因表达数据还提供了一些值得考虑的基因表达可塑性的线索。例如，多项比较显示，三个自然品系在第一年的日比较中（图3a）和两年中的所有发育转变的早晨（图5）共享了最多的DEGs。更重要的是，这三个自然品系在我们从不同生物功能中富集的GO注释中大量共享了显著过表达的基因（图4和数据集S1–S3），包括所有调控途径中的开花相关基因（图6和数据集S5）。总体而言，我们发现这三个自然品系之间共有高达66%的基因，其次是其中两个品系（主要是Bon和Moj）之间共有25%的基因，而每个品系在两年中特有的基因仅占9%。这意味着这些自然品系在实验设施中的全基因组基因表达模式上有共同点，这表明它们具有适应新环境的可塑性。尽管如此，参与开花的基因在三个自然品系之间并不共享（图6），这指出了赋予每个品系潜在适应价值的开花调控途径。鉴于我们实验中Bon和Moj的开花表型相似性，这两个品系共享了一个早期激活糖代谢的基因（PGI1；Yu等人2000）、一个光周期开花转变的启动子（VOZ1；Kumar等人2018）和一个抑制ELF3从而增强FLOWERING LOCUS T表达的基因（AGL6；Lee等人2024），这些基因都促进开花。它们还共享了与GA依赖的开花途径相关的开花抑制基因，如RAV2（Osnato等人2012）和GASA5（Zhang等人2009）。相比之下，晚开花品系Vel仅与Moj共享了一个基因，该基因在地上组织中高度表达，对开花期间建立适当的GA水平很重要，尽管不参与开花启动（GA2OX2；Li等人2019）。最后，Bon和Moj还展示了独特表达的基因，如与FLOWERING LOCUS T表达相关的开花启动子（CRY2；Liu等人2018；SPL3；Jung等人2016）和分生组织身份基因。由于上述所有基因在两次实验中都没有在同一发育阶段或转变中被检测到过表达（图6和数据集S5），因此很难得出关于结果适应意义的明确结论。

结论

目前，人们越来越有兴趣进行实验，以揭示植物发育及其与环境线索相互作用的分子机制，特别是在真实的自然环境中（即野外自然实验；Kudoh 2016；Kudoh等人2018；Maple等人2024）。同时，直接在自然种群中生长的植物上量化基因表达的研究（属于景观转录组学领域；Hansen 2010；Bragg等人2015；Keagy等人2023）也将变得至关重要，以确定植物如何感知、整合和响应环境线索以完成它们的生命周期（参见Nishio等人2024）。此外，在使用自然品系或衍生遗传构建的野外自然实验中，可以解析参与主要适应性发育转变及其表型可塑性的调控途径（中性或适应性），这些地方正在发生进化变化。此外，应针对特定环境设计特定的进化实验，包括互惠移植和更广泛的局部适应品系的选择，使用这些特定环境中存在的遗传池（Exposito-Alonso等人2018；Oakley等人2023）。通过采用这种方法，我们将最大限度地提高量化并理解在特定环境中适应和进化的遗传池的基因表达模式的能力。

作者贡献

FXP、MC、FJR-C、JMR、MTR和FV提出了这个想法。所有作者都生成了材料和数据。FJR-C、AM-P和FXP分析了数据。FXP撰写了手稿的第一版，所有作者都对其做出了贡献。

致谢

我们感谢Carlos Alonso-Blanco、Belén Méndez-Vigo和Mercedes Ramiro在共同花园实验中帮助繁殖所有品系，以及Arnald Marcer从El Castillejo植物园获取历史天气记录。图书馆准备和测序工作在CABIMER基因组学单元（塞维利亚，ES）进行。我们还要感谢Sierra de Grazalema自然公园的管理层允许我们在El Castillejo植物园工作，以及实验设施的工作人员提供的帮助。Do?ana自然区和Sierra Nevada国家公园的管理层分别批准了采样Bon和Vel种群。Do?ana的独特科学和技术基础设施（ICTS-RBD）提供了后勤支持。作者感谢审稿人和编辑对本手稿先前版本的有益评论和反馈。

资助信息

这项研究由西班牙安达卢西亚大学、研究和技术秘书处（Junta de Andalucía）的安达卢西亚研究、发展和创新计划（PAIDI 2020）资助（授权号：P18-FR-3307），资助对象为FXP。

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

出版同意

不适用。

利益共享声明

这项研究的利益来自我们在公共数据库上共享的数据和结果，如上所述。

数据可用性声明

原始全基因组基因表达序列可在NCBI GEO上通过访问号GSE301981获得。所有生物信息学工作流程和数据分析的代码可以在https://github.com/aitoe96/AT_NAT_GEx找到。