没有共同进化的地理结构：关于Siphamia雀鲷与其发光共生体之间高度特化共生关系的基因组学见解

《Ecology and Evolution》：Geographic Structure Without Co-Divergence: Genomic Insights Into a Highly Specific Symbiosis Between Siphamia Cardinalfish and Their Bioluminescent Symbiont

　　**摘要**

与微生物的共生关系对地球上的生命至关重要，然而关于这些相互作用如何随时间持续存在、它们如何共同进化，以及它们在多大程度上受到遗传限制，我们知之甚少。在这项研究中，分析了来自印度-太平洋广泛分布区域的三种雀鲷属（Siphamia）鱼类——S. tubifer、S. mossambica 和 S. fuscolineata——及其发光细菌共生体的遗传分化模式。通过对鱼类发光器官进行全基因组测序（WGS），我们探讨了这种关联的特异性是否在宿主物种之间以及广泛的地理范围内得以保持，以及是否存在与宿主或地理位置相关的共生体分化模式。结果表明，所有三种 Siphamia 物种的发光器官共生体均为 Photobacterium mandapamensis，这表明这种共生关系的特异性得到了高度保守。尽管在不同采样区域之间存在共生体的生物地理结构差异，但宿主与其共生体之间并未表现出共同进化（p = 0.92）。然而，对来自日本和菲律宾的两种 S. tubifer 种群的单核苷酸多态性（SNPs）分析显示，宿主之间存在中等程度的遗传分化（FST = 0.043），且共生体具有不同的系统发育分支。总体而言，这些发现表明 Siphamia 宿主与 P. mandapamensis 之间的关联高度保守，但共生体内部存在由地理因素和可能的宿主生态因素驱动的显著遗传多样性。

**1 引言**

微生物共生是自然界的重要组成部分，它们形成了复杂的伙伴关系，塑造了生态群落，影响了宿主的适应性，并推动了进化过程。在这些共生关系中，生物发光共生是一个引人入胜的例子，其中宿主动物通过与发光细菌的共生关系获得了产生光的能力。这些发光共生关系在多种海洋谱系中独立演化出来，实现了诸如躲避捕食者、吸引猎物和种内交流等新的生态功能（Lau 和 Oakley 2021；Davis 等人 2016）。尽管它们在生态上非常重要且分布广泛，但我们对控制宿主-共生体特异性、共生体传播以及生物发光系统内共同进化动态的遗传机制的理解仍然有限，尤其是在地理尺度和亲缘关系密切的宿主物种之间。雀鲷属（Siphamia）鱼类与其细菌伙伴 Photobacterium mandapamensis 之间的生物发光关联为研究微生物共生中的这些基本问题提供了理想的机会。Siphamia 属鱼类与 P. mandapamensis 之间的关联已成为研究微生物共生中菌株水平遗传多样性的一个新兴模型（Gould 和 Osland 2025）。目前共有 25 种 Siphamia 物种分布于印度-太平洋地区（Gon 和 Allen 2012）。该属的一个独特特征是它们拥有一个盘状发光器官，该器官附着在肠道上并容纳发光共生体（Dunlap 和 Nakamura 2011）。据信，细菌产生的光在夜间觅食时用于伪装。在 Siphamia 中，存在两种不同的发光器官形态，这有助于将它们分为两类：S. tubifer 和 S. tubulata（Gon 和 Allen 2012），分别称为“tubifer”组和“tubulata”组。tubifer 组的发光器官及其相关组织具有条纹图案，而 tubulata 组的发光器官具有点状图案（Gon 和 Allen 2012）。Siphamia tubifer 是 tubifer 组的成员，也是该组中地理分布最广的物种（Gon 和 Allen 2012），因此也是研究最广泛的物种（Leis 和 Bullock 1986；Dunlap 等人 2009；Gould 等人 2015，Gould 和 Osland 2025）。tubifer 组的大多数成员在形态上相似，表现出两种颜色图案——银色和黑色条纹或深棕色，平均标准体长在 2 至 3 厘米之间（Gon 和 Allen 2012）。这些鱼类通常与有毒棘皮动物（如海胆和冠状海星）共生，后者在白天为它们提供保护性庇护所。tubifer 组中的许多物种具有重叠的分布范围（Gon 和 Allen 2012）。Siphamia 宿主在幼体发育的浮游阶段获得其共生体。雄性鱼类会在口中孵化卵 4-5 天，之后将幼体释放到水中，幼体继续发育，直到大约 30 天后定居在选定的基质上（Gould 等人 2016）。一旦摄入发光共生体，它就会通过连接鱼类肠道的导管进入发光器官。发光器官由立方形上皮细胞组成，这些细胞形成了容纳细菌的腔室。为了调节共生体数量，宿主会定期通过导管将共生体细胞排出体外，最终随粪便废物一起排入环境中（Dunlap 和 Nakamura 2011）。虽然许多发光细菌与海洋鱼类和鱿鱼形成兼性共生关系（Kaeding 等人 2007；Nyholm 和 McFall-Ngai 2021），但 Siphamia 似乎仅与 P. mandapamensis 共生（Kaeding 等人 2007；Gould 等人 2021），这是 P. leiognathi 的一个亚种（Urbanczyk 等人 2010）。然而，这种共生关系主要在冲绳群岛和日本的一个相对较小的地理区域内针对 S. tubifer 这一种类进行了研究（Gould 和 Dunlap 2019），以及一些遗传数据有限的博物馆标本（Gould 等人 2021）。尽管其他 tubifer 组 Siphamia 宿主的发光共生体在地理范围、特异性和进化模式上存在重叠，但这些方面尚未得到研究。本研究调查了在广泛地理区域内采样的 tubifer 组宿主与 P. mandapamensis 之间的高度特异性是否得以保持，以及这种关联是否存在显著的分化模式。我们分析了三种 Siphamia 物种——S. tubifer、S. fuscolineata 和 S. mossambica——来自四个地点：冲绳（日本）、Caubyan 岛（菲律宾）、Verde 岛（菲律宾）和桑给巴尔（坦桑尼亚）。首先，我们表征了各种宿主的共生体，以确定其与 P. mandapamensis 的特异性是否得以保持。利用全基因组数据，我们分析了宿主和共生体的遗传变异模式，并检测了任何共同进化的证据。在此过程中，我们还分析了具有相似生态特征的 Siphamia 物种的分化模式，有助于阐明 tubifer 组的进化历史。

**2 材料与方法**

**2.1 样本收集和发光器官提取**

共收集了 61 个 Siphamia 样本，来自印度-太平洋地区的四个地点：冲绳（日本，n = 15）、Caubyan 岛（菲律宾，n = 10）、Verde 岛（菲律宾，n = 24）和桑给巴尔（坦桑尼亚，n = 12）（图 1）。大多数样本是在大约 3-5 米的深度采集的，除了 Verde 岛的样本，它们是在大约 30 米的深度采集的。样本使用手网在近海采集，并按照加州科学院批准的 IACUC 协议（2021-12 IMSVBS）进行安乐死处理。所有样本均保存在 -80°C 直到进一步处理。图 1 显示了印度-太平洋地区采样的三种 Siphamia 物种的采集地点。采集日期和样本数量在框中注明。每个鱼类的发光器官都经过无菌解剖，然后使用 QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN) Quick-Start 协议提取其总基因组 DNA。使用 Nanodrop 2000C 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）评估 DNA 的纯度，并使用 Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 在 Qubit 4.0 测光仪（Invitrogen）上测量 DNA 浓度。所有提取的 DNA 都保存在 -20°C 直到文库制备。使用 NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep kit (New England Biolabs) 对 61 个总 DNA 样本进行全基因组测序。使用 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs) 对样本进行单独索引。文库制备完成后，再次使用 Qubit 4.0 测光仪（Invitrogen）测量 DNA 浓度，并将样本标准化至 2 ng/μL。使用 4150 TapeStation 系统（Agilent Technologies）估计摩尔浓度，然后使用 Novaseq 6000 平台（Illumina, Sacramento, CA）进行成对末端 150 bp 读取的测序。原始序列读取数据使用 fastp v0.22.0 (Chen 等人 2018; Chen 2023) 进行过滤和修剪，以处理鱼类和细菌 DNA 的成对末端数据。使用 BWA-MEM v0.7.17 (Li 2013) 分别将鱼类和细菌读取数据与两个参考基因组对齐；宿主参考基因组是 Siphamia tubifer (ASM2046626v1, Gould 等人 2022)，细菌参考基因组是 Photobacterium mandapamensis Ik8.2 (ASM3068539v1, Gould 和 Henderson 2023)。

**2.2 宿主分析**

经过质量过滤后，有四个个体被从分析中移除。剩余 57 个个体的过滤序列首先使用 BWA-MEM v0.7.17 与整个 S. tubifer 线粒体基因组对齐。然后使用 SAMtools v1.19 (Danecek 等人 2021) 对对齐的读取序列进行排序和索引，并为每个个体生成共识 FASTA 文件，使用 AliView v1.28 (Larsson 2014) 创建多序列比对。另外三种雀鲷物种也被纳入分析作为参考：Apogonicthyoides taeniatus (MN699562.1)、Ostorhinchus fasciatus (NC_058293.1) 和 Sphaeramia orbicularis (AP018927.1)。然后使用 IQ-TREE v2.0.3 (Nguyen 等人 2015) 和 TPM2 + F + R5 模型基于 BIC 分数以及基于 1000 次重复的 ultrafast 自举支持推断系统发育关系。还对细胞色素氧化酶 I (COI) 基因进行了额外分析，以推断有 NCBI 序列数据的 Siphamia 物种之间的系统发育关系。57 个宿主的序列使用 BWA-MEM v0.7.17、SAMtools v1.19 和 AliView v1.28 与 S. tubifer COI 基因对齐。另外 26 个 Siphamia 物种的 COI 序列以及整个线粒体基因组分析中的参考雀鲷物种也被纳入分析。使用 IQ-TREE v2.0.3 和 TPM2 + F + I + G4 替换模型基于最低 BIC 分数以及 1000 次 SH-aLRT 和 ultrafast 自举重复进行系统发育推断。为了分析宿主中的遗传分化模式，使用 SAMtools v1.19 过滤和排序与 S. tubifer 参考基因组对齐的读取序列。使用 MarkDuplicates Picard v3.1.0 (Picard 2019; https://broadinstitute.github.io/picard/) 去除重复读取。使用 GATK v4.5.0.0–0 (McKenna 等人 2010; Van der Auwera 和 O'Connor 2020) 的最佳实践工作流程（https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/sections/360007226651-Best-Practices-Workflows）识别单核苷酸多态性 (SNPs)。根据染色体位置调用和基因分型 SNP，并使用 VCFtools v0.1.16 (Danecek 等人 2011) 对每个个体的 SNP 进行质量评估，基于等位基因频率 (MAF ≥ 0.05)、每个个体的平均深度 (minDP = 8, maxDP = 60)、位点质量 (minQ > 30) 和缺失基因型数据的比例 (max-missing ≥ 95%)。使用 BCFtools v1.19 (Danecek 等人 2021) 将所有 23 条染色体连接成一个 GVCF 文件。在物种水平上（S. tubifer、S. mossambica 和 S. fuscolineata 之间）以及在群体水平上（两个 S. tubifer 种群之间）对 SNP 进行分析。使用来自过滤后的 GVCF 文件中的 15,506 个 SNP 对 57 个 Siphamia 个体进行了主成分分析 (PCA)。使用 R 包 adegenet v2.1.10 (Jombart 和 Ahmed 2011) 计算缩放后的等位基因频率，并使用 ade4 v1.7-22 (Bougeard 和 Dray 2018) 生成 PCA 图。基于距离矩阵使用 vegan v.2.6-8 (Anderson 2001; Warton 等人 2012) 进行了排列多变量分析 (PERMANOVA)。使用相同的方法对来自菲律宾和日本的 23 个 S. tubifer 样本的 1,098,423 个 SNP 进行了另一个 PCA，以检查这两个地点个体之间的遗传变异模式。还使用 hierfstat 包 v0.04-22 (Goudet 2005) 对两个群体进行了 FST 分析，以识别可能受到选择的异常位点。此外，使用 adegenet v2.1.10 和 dplyr v1.1.4 (Wickham 等人 2023) 计算了每个群体的观察到的和预期的杂合度、基因型一致性和等位基因频率。使用 R 包 vcfR v1.15.0 (Knaus 和 Grünwald 2016, 2017)、ape v5.7–1 (Paradis 和 Schliep 2019) 和 pegas v1.3 (Paradis 2010) 计算了核苷酸身份。使用 R 包 qqman v0.1.9 (Turner 2014) 创建了曼哈顿图，以可视化可能基于 VCFtools v1.16 中计算的 Weir 和 Cockerham FST 值而在 S. tubifer 种群之间产生差异的假想 SNP。

**2.3 共生体分析**

由于质量不佳，有五个个体被从共生体分析中移除。使用 metaSPAdes v3.15.5 (Nurk 等人 2017) 对剩余 56 个发光器官共生体群体的修剪和对齐后的细菌序列进行组装。然后使用 Prokka v1.14.6 (Seemann 2014; https://github.com/tseemann/prokka) 对每个发光器官样本的宏基因组进行注释。此分析的外群包括其他鱼类宿主的发光共生体 P. lucens 的菌株 ajapo4.1 (PYNQ01000001.1, Kaeding 等人 2007) 和 ajapo5.5 (GCA_030685555.1, Gould 和 Henderson 2023) 以及 P. leiognathi 的菌株 ljone.10.1 (ASM3071696v1) 和 lrivu.4.1 (ASM50920v1)。Roary v3.13.0（Page等人，2015年）被用于使用Prokka注释对共生体进行全基因组分析，并创建了至少在95%的样本中存在的核心基因的对齐序列。然后使用基于IQ-TREE v2.0.3中最低BIC分数的替换模型GTR+F+R4，通过1000次SH-aLRT和超快自助法复制来推断最大似然树。为了识别细菌共生体种群之间的遗传分化模式，我们使用BWA-MEM v0.7.17将每个发光器官的修剪后的读段与细菌参考基因P. mandapamensis（ASM3068539v1）对齐。这些对齐后的读段随后被用作snippy v4.6.0（Seeman 2015；https://github.com/tseemann/snippy）的输入，该工具使用最小覆盖位点的读段数量（--mincov 10）和最小差异读段比例（--minfrac 0.9）的标志来调用每个发光器官共生体的共识SNP。Snippy-core被实现用于生成所有个体的共识SNP的核心对齐序列，这被用作IQ-TREE v2.0.3的输入，以使用最大似然模型TVM+F+R7和基于1000次复制的SH-aLRT和超快自助法来创建系统发育树。

2.4 共系统发育分析

为了确定Siphamia宿主与其发光共生体Photobacterium mandapamensis之间是否存在系统发育一致性，使用了R包paco v0.4.2（Balbuena等人，2013年；Hutchinson等人，2017年）进行Procrustean共系统发育分析（PACo），这是一种基于Procrustean叠加的全局拟合方法，用于评估宿主-共生体关联对共系统发育的贡献程度。R包ape v5.7-1也被用来进行parafit分析，该分析测试宿主和共生体之间的共同进化程度。对于Siphamia，我们使用了上述从线粒体序列推断出的系统发育树，并使用了来自共生体的SNP数据生成的树。这两棵树都使用R包dendextend v1.17.1（Galili 2015）转换为树状图以进行可视化表示。

3 结果

3.1 序列数据

发光器官的全基因组测序平均每个样本产生了92,743,381个（最小值=55,591,110，最大值=140,448,218）原始读段，而过滤后的读段数量为87,431,907个（最小值=51,440,137，最大值=135,309,341）。平均而言，宿主和细菌分别占读段的78.3%（SE ±0.994%）和21.7%（SE ±0.994%）。鱼类的平均深度覆盖率为12.9，而细菌的平均深度覆盖率为983.6（表S1）。

3.2 宿主分析

使用最大似然法对研究中测序的宿主的全线粒体基因组（n=57）和COI基因序列（n=88）进行了系统发育分析，这些COI基因序列包括我们的样本以及26个公开可用的其他Siphamia物种的COI序列。这两种系统发育分析都确认了本研究中研究了三个不同的物种：S. mossambica、S. tubifer和S. fuscolineata。它们都发现S. mossambica是与包含S. tubifer和S. fuscolineata的支系的姐妹群（图2）。在S. tubifer内部，有一个仅由来自日本的个体组成的支系，表明来自两个地点的个体之间存在分化。

3.3 共生体分析

在共生体样本中鉴定出了2224个核心基因，并使用这些基因推断出最大似然系统发育树（图5A）。分析中包含了Photobacterium lucens（ajapo.4.1, ajapo.5.5）、Photobacterium leiognathi（ljone.10.1, lrivu.4.1）和P. mandapamensis（Ik.8.2）的参考菌株，以确认发光器官共生体的身份。所有发光器官共生体都被强烈地归类为P. mandapamensis支系（支持度100/100）。来自日本和坦桑尼亚的共生体也形成了紧密的支系，尽管它们在宿主物种、采集深度和采样地点上存在差异。基于COI基因的系统发育树有助于解析Siphamia属内物种之间的进化关系，特别是在tubifer组内。在这棵树中，S. mossambica是S. goreni的姐妹群。也有强有力的证据表明存在一个由具有条纹发光器官的物种组成的tubifer支系，其中包括S. tubifer。然而，由于序列可用性有限，tubulata组没有明确界定。唯一的S. tubulata样本在tubifer支系中的支持度相对较低。不过，系统发育树确实显示了一个由三个澳大利亚物种组成的姐妹支系的强烈支持，这些物种都具有斑点发光器官（图2）。全基因组分析在57个Siphamia宿主体内共鉴定出15,506个SNP。对这些SNP进行的主成分分析（PCA）显示了三个物种之间的明显区别，这一点通过使用距离矩阵的排列多元方差分析（PERMOVA）得到了证实（R2=0.57，F=23.44，df=3，p=0.001）。PC1解释了46.14%的变异，主要解释了S. mossambica与其他两个物种之间的差异，而PC2解释了17.82%的变异，解释了S. fuscolineata和S. tubifer之间的差异（图S1）。当在物种水平上比较时，PC3和PC4的遗传变异分别降至0.94%和0.92%。对S. tubifer序列的单独分析在日本和菲律宾的23个个体中鉴定出了1,098,423个SNP。基于这些SNP的PCA表明，来自日本和菲律宾的S. tubifer之间存在遗传分化，这一点通过PERMOVA得到了证实（R2=0.077，F=1.74，df=1，p=0.001），尽管菲律宾群体的变异更大。PC1仅解释了数据中8.11%的变异，而PC2、PC3和PC4分别解释了7.14%、5.43%和4.69%的变异。尽管PC1解释的变异量相对较低，但它确实捕捉到了地点之间的差异，而PC2和PC3捕捉到了菲律宾群体中的大部分变异。日本群体内的变异开始由PC4解释。对两个群体之间的遗传分化分析显示，成对的FST值为0.043；然而，单个SNP的FST值分布并未显示出驱动这种分化的基因组中的明确区域（图4）。从可变位点计算出的额外群体水平统计数据显示，日本和菲律宾群体观察到的杂合度略高于哈迪-温伯格平衡所预期的杂合度。日本群体表现出较低的核苷酸多样性，表明群体结构更为紧密。相比之下，菲律宾群体显示出更高的核苷酸多样性，这与群体内的更多遗传变异一致。

3.3.1 共生体的系统发育

在共生体样本中鉴定出了2224个核心基因，并使用这些基因推断出最大似然系统发育树（图5A）。分析中包含了Photobacterium lucens（ajapo.4.1, ajapo.5.5）、Photobacterium leiognathi（ljone.10.1, lrivu.4.1）和P. mandapamensis（Ik.8.2）的参考菌株，以确认发光器官共生体的身份。所有发光器官共生体都被强烈地归类为P. mandapamensis支系（支持度100/100）。来自日本和坦桑尼亚的共生体也基于它们各自的地理位置形成了紧密的支系，而尽管宿主物种、采集深度和采样地点存在差异，菲律宾的共生体则混合在一起。

3.3.2 共生体全基因组分析

为了识别不同宿主发光器官共生体之间的遗传差异，我们还基于每个发光器官群体中基因的存在与否进行了全基因组分析（图S2）。在所有检查的发光器官中，有2224个核心基因（存在于至少95%的发光器官中），4086个壳基因（存在于15%到94%的发光器官中），以及59,207个云基因（存在于少于15%的发光器官中）。其中，37,476个是单例基因，仅存在于一个发光器官中，而976个基因存在于所有样本中。尽管核心基因系统发育包含了来自特定地点的共生体组成的支系，但在共生体的基因内容上没有发现与这些地点或其宿主物种相对应的明显模式。

3.4 共系统发育分析

对Siphamia宿主及其发光共生体P. mandapamensis的系统发育拓扑结构进行分析，没有发现共同进化的证据（图6）。支持的Paco分析显示，基于物种的不同，共同进化的信号各不相同（表S2）。tubifer群体的共同进化得到了最强烈的支持，而S. mossambica的支持最弱。包含所有物种的parafit全局测试基于1000次排列没有提供共同进化的证据（p=0.92）。

4 讨论

确定生物如何维持与水平获得的微生物共生体的特定伙伴关系仍然是共生研究中的一个关键问题，特别是在海洋系统中。尽管海洋环境的高连通性和海洋细菌的扩散潜力应该预测伙伴选择的放松和共生体的切换，但许多海洋生物仍然与其微生物伙伴保持一定程度的特异性（Troussellier等人，2017年）。维持这种特异性需要研究宿主和共生体之间的进化关系以及控制共生体获取的生态机制。Siphamia-Photobacterium关联提供了一个独特的机会来研究这些动态，结合了在不同宿主中的高特异性、广泛的地理分布和可能影响宿主扩散和共生体可用性的栖息地依赖性。我们对tubifer组中的三个Siphamia物种及其共生体的基因组分析揭示了地理、生态和进化因素如何相互作用，塑造了这种兼性海洋共生的特异性。为了理解发光共生是如何进化和持续存在的，我们首先研究了宿主及其生物地理分布之间的进化关系。我们的系统发育分析表明，S. mossambica是与S. fuscolineata和S. tubifer这两个密切相关的姐妹群的姐妹群。将其他Siphamia物种纳入COI基因分析中，支持了这些物种都属于较新衍生的tubifer组。在tubifer组内，S. tubifer的分布范围最大，与S. mossambica和S. fuscolineata的分布范围有重叠（Gon和Allen，2012年）。相比之下，S. mossambica是西印度洋的特有种，分布范围较窄，并且在地理上与其他物种隔离。tubifer组的成员通常与海胆（或其他棘皮动物）宿主相关联（Gon和Allen，2012年）。本研究中的所有三个Siphamia物种都与海胆形成了关联，但每个物种都是从不同的物种中采集的。siphamia tubifer 更倾向于选择长刺的海胆（Diadema setosum），而 S. fuscolineata 则在比其他物种更深的深度（>30米）与火海胆（Astropyga radiata）共同出现。这种对海胆种类的不同选择以及它们所处深度的差异可能是由于生态位划分导致的 S. tubifer 和 S. fuscolineata 的分化。相比之下，属于 tubulata 组的物种在底物利用上更为广泛，包括珊瑚、海草、沙子和碎石（Gon 和 Allen 2012）。尽管关于这一属的物种的进化历史了解甚少，部分原因在于缺乏相关的遗传数据，但这些物种与澳大利亚物种的姐妹群共享一种点状发光器官结构，这表明这种结构可能是祖先特征，而 tubifer 组中的条纹状结构则是更衍生的特征。这些不同颜色结构对共生关系的功能意义尚不清楚。需要进一步研究 tubulata 组及其发光共生体，以了解该组的进化历史和物种形成的潜在驱动因素以及共生关系的特异性。除了分析 siphamia 物种间的遗传差异外，我们还研究了分布最广的 siphamia 物种内的种群差异。所研究的两个 S. tubifer 种群来自受黑潮影响的区域，黑潮是一股从菲律宾东海岸流向日本东海岸的主要海洋电流（Barkley 1970）。尽管受到黑潮的影响，我们的研究结果显示这两个种群之间的遗传结构较为中等。我们估计的两个种群之间的 FST 值略高于另一类具有相似浮游幼体发育期的珊瑚鱼（Ackiss 等人 2018），不过不均衡的采样可能影响了我们的估计结果。这种中等程度的遗传分化可能是由于两个种群之间存在部分隔离造成的。这也可能是因为菲律宾的 S. tubifer 种群与其他邻近地区的联系更为紧密，而冲绳位于其分布范围的最北端（Gon 和 Allen 2012）。未来如果能够进行更广泛的地理采样，并在整个地区及黑潮沿线获取更大规模、更均匀的 S. tubifer 种群样本，将有助于揭示驱动这种广泛分布物种种群间联系的机制。除了对 siphamia 物种间的遗传差异进行分析外，我们还研究了最广泛分布的 siphamia 物种内的种群水平差异。

对共生体的基因组分析证实，这种共生关系的特异性在多个宿主物种及整个印度-太平洋地区都得到了保持。所有三种宿主物种都与 P. mandapamensis（P. leiognathi 的一个亚种）形成了严格的共生关系，这支持了先前的研究结果，即这种共生关系在整个 siphamia 属中高度保守（Gould 等人 2021）。相比之下，大多数发光鱼类和鱿鱼物种并未表现出这种程度的特异性（Dunlap 等人 2007）。甚至有研究发现，在同一条发光器官中同时存在 P. leiognathi 和 P. mandapamensis（Kaeding 等人 2007）。目前仍不清楚 siphamia 是如何从环境中识别并严格选择 P. mandapamensis 的，也不清楚它们能否区分 P. mandapamensis 与其亲缘关系较近的 P. leiognathi。siphamia 宿主之间观察到的这种高度特异性引发了关于精确伙伴识别机制的有趣问题。Photobacterium leiognathi 和 P. mandapamensis 在印度-太平洋地区的分布有重叠，这两种细菌都可以作为发光鱼类的共生体。它们具有很高的遗传相似性（平均核苷酸同一性为 96.5%；Gould 和 Henderson 2023），并且在 16S rRNA 基因上无法区分，这导致它们的分类学地位多年来多次发生变化（Boisvert 等人 1967；Hendrie 等人 1970；Reichelt 和 Baumann 1975；Urbanczyk 等人 2013）。比较 P. mandapamensis 和 P. leiognathi 的发光基因后发现，lux 操作子存在差异，P. mandapamensis 中含有 luxF 基因，而 P. leiognathi 中则没有（Ast 和 Dunlap 2004）。此外，两种菌株在 II 型分泌系统上也存在差异（Gould 和 Henderson 2023）。目前尚不清楚宿主是否利用这些差异来区分这两种共生体。确定这些因素是否影响宿主识别和选择 P. mandapamensis 的能力将有助于揭示调控这种共生关系特异性的分子机制。除了涉及特异性的遗传机制外，宿主的行为和生态学也可能起着重要作用。siphamia 宿主会通过粪便将多余的共生体释放到自由环境中（Dunlap 和 Nakamura 2011），这可能会增加周围海水中 P. mandapamensis 的局部密度。当 siphamia 幼体在成年鱼群附近定居时，它们遇到 P. mandapamensis 的机会更大，而在开阔海域中，Photobacterium 的相对丰度较低（Troussellier 等人 2017）。这种局部富集现象也有助于解释在本研究及其他研究中观察到的 P. mandapamensis 的生物地理分布模式（Gould 和 Dunlap 2019；Gould 等人 2023）。未来关于宿主鱼类对自由生活共生体种群影响的研究将有助于我们更好地理解局部富集在共生体获取和特异性中的作用。虽然这些生态机制可能促进特异性，但我们对共生体的基因组分析揭示了更复杂的情况。来自坦桑尼亚、菲律宾和日本的 Photobacterium 共生体主要形成了各自的进化支系，然而对来自这些地区的共生体全基因组的比较分析并未发现基因内容的明显差异。这种功能上的缺乏可能反映了我们基于整个发光器官中基因存在与否进行的全基因组测序方法的局限性，该方法并未比较单个分离株的基因组差异。然而，之前对从鱼类发光器官中分离出的 P. mandapamensis 菌株的全基因组分析显示，其全基因组结构相似，包含大量“云基因”（Gould 和 Henderson 2023）。尽管如此，在分离株水平上分析基因组可能有助于揭示不同地点或宿主物种之间具体的遗传差异。与观察到的地理分化模式相反，来自菲律宾不同深度（约 3 米和 30 米）的两个不同宿主物种（S. tubifer 和 S. fuscolineata）的发光器官中的共生体并未显示出系统发育分化。对于这一现象，有两种可能的解释：要么是两种宿主的幼体从相似的环境细菌池中获取了发光共生体，要么是局部洋流促进了该地区不同深度之间海洋细菌的扩散和混合。需要详细研究共生体在环境中的分布以及宿主获取共生体的空间生态学机制，以确定这两种假设中哪一种成立。尽管共生体存在地理结构，但我们的全球拟合测试并未发现 siphamia 宿主与其发光共生体之间存在共同进化。然而，procrustean 方法仅在 S. tubifer 中发现了谱系特异性的一致性，表明存在部分共同进化。S. tubifer 可能对其共生体的选择更为严格，这导致其特异性高于本研究观察到的其他 siphamia 物种。在印度-太平洋地区进一步采样 S. tubifer 将有助于确定这种部分共同进化是否普遍存在。总体而言，这些发现与其他发光鱼类的研究结果一致，后者并未观察到共同进化（Dunlap 等人 2007）。不过，那项研究关注的是更广泛的宿主和共生体系统发育范围，而我们仅关注了 tubulata 组的 siphamia 宿主及其细菌亚种。这种亚种水平的共生体多样性可能不足以检测到共同进化的迹象。普遍缺乏共同进化也可能反映了共生体的兼性特征。Photobacterium mandapamensis 可以在自由环境中存活，不需要依赖宿主进行生存或繁殖（Urbanczyk 等人 2011）。虽然在其他类似的兼性共生关系中也有共同进化的描述（例如鱿鱼-Aliivibrio 模型（Nishiguchi 1998）），但我们的研究发现共生体的遗传分化与宿主的分化并不一致。相反，共生体的遗传结构似乎受地理因素驱动，而宿主的分化可能由上述的生态位划分等因素引起。总之，我们对 tubulata 组 siphamia 物种及其发光共生体的基因组分析表明，这种共生关系在整个印度-太平洋地区高度保守。这是首次对 S. mossambica 和 S. fuscolineata 的发光器官共生体进行表征的研究，证实了与 S. tubifer 一样，所有宿主都仅与 P. mandapamensis（P. leiognathi 的一个亚种）形成共生关系。对于宿主本身，我们能够确定 siphamia tubifer 支系的进化关系，并发现日本和菲律宾的 S. tubifer 种群之间存在中等程度的遗传分化。我们还发现了共生体的系统地理结构，但未发现宿主-共生体共同进化的证据。这表明包括宿主鱼类对共生体的局部富集在内的生态过程有助于促进这种共生关系的特异性。这些发现挑战了“一切生物无处不在”的海洋微生物生态学范式，展示了即使海洋细菌具有高度扩散潜力，宿主生态学仍能促进共生关系的特异性。

作者贡献：
Emily E. Neff：数据管理（主导）、正式分析（平等参与）、调查（平等参与）、验证（主导）、可视化（主导）、初稿撰写（主导）、审稿和编辑（平等参与）。
Alison L. Gould：概念构思（主导）、数据管理（协助）、正式分析（平等参与）、资金获取（主导）、方法学设计（主导）、验证（协助）、审稿和编辑（平等参与）。

致谢：
作者感谢加州科学院比较基因组学中心的 Athena Lam、Lynn Bonomo 和 Grace Kim 在实验室方面的支持。同时感谢 Joe Russack、Jim Henderson、Elora López-Nandam 和 Jennifer Hoey 在技术支持方面的帮助。感谢 Luiz A. Rocha、Emma Román 和 Ana Gaisiner 在标本采集方面的合作。最后，我们也感谢琉球大学热带生物圈研究中心提供的研究设施。本文的发表部分得到了 Temple 大学图书馆开放获取出版基金的资助。

资金支持：
本研究得到了美国国立卫生研究院（10.13039/100000002, DP5-OD026405）的支持。

利益共享声明：
本研究产生的收益来自我们在公共数据库上共享数据和结果。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
所有原始序列读段已存放在 SRA（BioProject PRJNA1296345）中。用于这些分析的所有生物信息学脚本均可在以下仓库获取：https://github.com/emilyn16/Geographic-Structure-Without-Co-Divergence。