通过宏DNA测序揭示饮食偏好及其营养驱动因素：以高海拔牧场中的阿尔卑斯土拨鼠（Marmota marmota L.）为例

《Ecology and Evolution》：Unveiling Diet Preferences and Their Nutritional Drivers Through Metabarcoding: The Case of Alpine Marmot (Marmota marmota L.) in High Altitude Grazed Pastures

　　摘要

本研究采用了DNA宏条形码技术，来探究夏季不同高山牧场生态系统中高山旱獭（Marmota marmota L.）的饮食组成和觅食策略。分析了来自四个不同地区的九个家庭单位的粪便样本，并进行了全面的牧场植物群和营养评估。研究确定了86种植物是旱獭饮食中的典型成分，揭示了比先前报道更为多样的饮食谱系。饮食组成在不同地点和整个夏季都有所变化，这些变化并不严格依赖于植物的可获得性。值得注意的是，特定植物在饮食中的丰度与整个牧场营养质量之间的关联，以及对某些属的差异性选择（正面或负面），表明旱獭会根据营养资源的波动采用适应性觅食策略。蛋白质含量、纤维水平和脂肪酸谱等因素影响了植物的选择。此外，牛的放牧似乎也影响了旱獭的饮食组成，这可能通过其对植物物候和营养含量的影响来实现。该研究强调了植物可获得性、营养组成和环境因素在塑造旱獭觅食行为之间的复杂相互作用。这些发现有助于我们理解高山旱獭的生态学，并对高山生态系统中的牧场管理策略具有启示意义。

1 引言

食草动物通常被认为受到食物资源的限制（White 2008），因为它们的饮食显著决定了它们的生存前景、行为和生态相互作用。可用饲料的质量或数量的不足可能会导致严重的后果，例如由于成熟年龄、最后一次繁殖年龄、幼体存活率、成年存活率和生育能力等人口参数的影响而导致种群数量减少（Dobson and Oli 2001; White 2008）。因此，能够使动物获得足够高质量食物资源的觅食行为被认为是被强烈选择的（Goldberg et al. 2020）。因此，阐明一个物种的饮食范围和首选食物对于理解其生态位和适应策略至关重要（Belovsky 1986）。大多数哺乳动物食草动物会摄取多种植物，并且可能因为不同食物中营养成分的差异而偏好某些植物（Castle et al. 2020），或者为了调节各种植物次生化合物的摄入（Torregrossa et al. 2011）。尽管广食性食草动物会食用许多不同的植物和植物部分（种子、根和叶子），但它们并不一定按其可获得性的比例来食用所有遇到的植物（Aryal et al. 2015; Goldberg et al. 2020）。小型和中型食草动物尤其倾向于选择性进食，因为它们的消化道较短，限制了摄入量。因此，这些小型食草动物常常需要在应对植物防御机制、减少搜索时间以及最大化每单位食物中所含营养之间做出权衡（Belovsky 1986）。此外，这些觅食权衡可能会随着植物防御机制、食物可获得性和营养需求的变化而季节性变化（Soininen et al. 2013）。尽管实验研究表明，高质量食物的可获得性可以减少低质量食物的摄入，但在自然环境中，任何首选食物在饮食中的比例会随着其可获得性的增加而增加，但也受到替代食物可获得性的影响（Soininen et al. 2013）。冬眠动物可能对食物数量和质量的变化特别敏感，因为它们的营养需求与非冬眠动物不同，而这些营养必须在相对较短的一年时间内获得。许多冬眠哺乳动物会季节性地表现出暴饮暴食行为，并在冬眠前改变饮食，通常转向富含特定多不饱和脂肪酸的植物或植物部分（例如种子），以增强越冬能力（Lehmer et al. 2006; Ruf and Arnold 2008）。因此，记录季节性变化的首选食物对于冬眠食草动物至关重要，这需要具有足够分类分辨率的饮食研究来检测物种水平上的食物变化。高山旱獭（Marmota marmota L.）是一种中等体型的冬眠社会性啮齿动物，栖息在西欧、中欧和东欧的高海拔开阔地区，它在高山生态系统中扮演着重要角色，既是食物链的一部分，也是“生态系统工程师”（Forti et al. 2025）。事实上，旱獭通过挖掘活动改变了土壤的物理和化学性质（Chibowski et al. 2023），并通过觅食影响植被格局。高山旱獭表现出高度同步的年度生活周期，其地上活动期很短。它们的繁殖期在雌性从冬眠中醒来后立即开始，通常从四月下旬持续到六月（Exner et al. 2003）。该物种的特征是每年只有一次繁殖事件，个体在九月到十月之间返回冬眠巢穴。考虑到它们活跃季节的时间限制大约为4-5个月，高山旱獭面临着交配、妊娠、分娩和抚育后代的重大时间压力，同时还要积累足够的质量以度过即将到来的冬眠期（Armitage 2012）。这种时间限制对高效的觅食策略施加了巨大的选择压力。因此，假设高山旱獭已经进化出偏好并食用其栖息地内最具营养优势的食物。这种选择性进食行为对于优化能量摄入和为繁殖及长期冬眠做出生理准备至关重要。了解影响高山旱獭的环境和人为因素的作用，特别是那些可能损害牧场质量或可利用性或影响该物种觅食活动的因素（Mainini et al. 1993; Uchida and Blumstein 2021），对其保护工作至关重要。因此，关于旱獭饮食组成的全面基线数据对于评估栖息地管理实践如何影响其首选食物以及制定保护栖息地的最佳策略至关重要。已知高山旱獭具有多样的饮食（Bassano et al. 1996; Massemin et al. 1996; Rudatis and Battisti 2006; Garin et al. 2008），包括来自几个植物科的叶子、花朵和果实等多种植物部分，将其归类为广食性觅食者。然而，以往的研究主要集中在法国的几个地点（Massemin et al. 1996）、比利牛斯山脉（Garin et al. 2008）和意大利阿尔卑斯山的两个地区（Bassano et al. 1996; Rudatis and Battisti 2006），使用了微观组织学技术，在某些情况下分类分辨率有限（Soininen et al. 2009），没有考虑牧场中植物的可获得性（Bassano et al. 1996; Massemin et al. 1996; Rudatis and Battisti 2006），也没有研究植物选择的驱动因素。为了更好地了解这一物种的饮食广度和最佳食物，提出了以下问题：(a) 高山旱獭的饮食有多多样？相对于栖息地中植物的可获得性，它们在特定植物物种上的选择性觅食程度如何？(b) 高山旱獭的饮食在不同地点和整个夏季有何变化？(c) 高山旱獭的饮食与植物营养组成之间有什么关系？还有哪些潜在因素影响它们的饮食选择？阐明饮食是否以及如何随季节变化将有助于确定哪些植物对高山旱獭种群的繁荣至关重要。

2 材料与方法

2.1 研究区域和动物

在当前研究中，2022年整个夏季对高山旱獭的粪便颗粒进行了全面采样（图1）。研究涵盖了位于意大利东北部Paneveggio Pale di San Martino自然公园（PNP）内四个不同海拔高度的高山牧场区域的九个家庭单位（图2）。图1：研究区域中的高山旱獭照片，由Bruno Bressan拍摄。图2：2022年夏季的研究区域地图。研究的区域包括Busabella和Fosse、Piani della Vezzana以及Venegiota。对于每个家庭单位的主要洞穴（B2、B3、B7、F1、F2、PV1、PV3、V2和V4），都标出了用于收集草样并进行植物分析的所有线性样带的起点。研究地点包括两个宏观区域：Passo Rolle（46° 17′ N, 11° 47′ E）和Val Venegia（46° 31′ N, 11° 49′ E）。Passo Rolle包括了Busabella（B）和Fosse（F）区域，分别研究了三个和两个家庭单位。这些区域位于大约1900米海拔（范围：1830–1984米），以亚高山草地为特征，周围有自然屏障，并散布着由挪威云杉（Picea abies）和欧洲落叶松（Larix decidua）幼树形成的林线生态过渡带。Val Venegia的另外两个区域，Venegiota（V）和Piani della Vezzana（PV），分别研究了两个家庭单位，海拔高度在1780到1960米之间。Venegiota紧邻Malga Venegiota（1820米海拔），主要被针叶林环绕，具有草本植被，中间有一条小溪流穿过。这两个区域都用于放牧，也有一些驴的栖息。Piani della Vezzana的地形相对均匀和平坦，草本植被中散布着孤立的树木和大小不一的岩石构造。与Busabella和Fosse更为起伏的地形相比，Venegiota和Piani della Vezzana的地形更加均匀。所有研究区域的气候特征是夏季温和、冬季严寒，雪覆盖时间通常持续6-7个月，从十一月底到五月中旬。表1列出了2022年六月份不同家庭单位中旱獭的估计数量。表1：2022年六月份不同家庭单位中的高山旱獭数量。ND表示未确定。

2.2 研究设计和采样

2.1 研究区域和动物

在当前研究中，2022年整个夏季对高山旱獭的粪便颗粒进行了全面采样（图1）。研究范围涵盖了意大利东北部Paneveggio Pale di San Martino自然公园（PNP）内四个不同海拔高度的高山牧场区域的九个家庭单位（图2）。图1：研究区域中的高山旱獭照片。图2：2022年夏季的研究区域地图。研究的区域包括Busabella和Fosse、Piani della Vezzana以及Venegiota。对于每个家庭单位的主要洞穴（B2、B3、B7、F1、F2、PV1、PV3、V2和V4），都标出了用于收集草样并进行植物分析的所有线性样带的起点。研究地点包括两个宏观区域：Passo Rolle（46° 17′ N, 11° 47′ E）和Val Venegia（46° 31′ N, 11° 49′ E）。Passo Rolle包括Busabella（B）和Fosse（F）区域，分别研究了三个和两个家庭单位。这些区域位于大约1900米海拔（范围：1830–1984米），以亚高山草地为特征，周围有自然屏障，并散布着由挪威云杉和欧洲落叶松形成的林线生态过渡带。Val Venegia的另外两个区域，Venegiota（V）和Piani della Vezzana（PV），分别研究了两个家庭单位，海拔高度在1780到1960米之间。Venegiota靠近Malga Venegiota（1820米海拔），主要被针叶林环绕，具有草本植被和一条小砾石河。这两个区域都用于放牧，并有小规模的驴群。Piani della Vezzana的地形相对均匀和平坦，草本植被中散布着孤立的树木和大小不一的岩石构造。与Busabella和Fosse更加起伏的地形相比，Venegiota和Piani della Vezzana的地形更加均匀。所有研究区域的气候特征是夏季温和、冬季严寒，雪覆盖时间通常持续6-7个月，从十一月底到五月中旬。表1报告了2022年六月份不同家庭单位中旱獭的估计数量。表1：2022年六月份不同家庭单位中的高山旱獭数量。ND表示未确定。

2.2 研究设计和采样

为了阐明夏季不同高山牧场生态系统中高山旱獭（Marmota marmota L.）的饮食组成和觅食策略，进行了包括多种分析方法在内的全面研究。尽管已有研究表明，特别是在从冬眠中醒来后，旱獭可能会将动物源性食物（尤其是昆虫）纳入其饮食中（Bassano et al. 1996; Garin et al. 2008），但本研究仅关注其饮食的植物成分，因为这与牧场管理更为直接相关。数据收集时间从2022年六月初持续到八月底，每月定期对所有9个家庭单位进行采样。该方法论综合了三个主要组成部分，这些组成部分在以下段落中进行了详细描述：

2.2.1 牧场植物组成分析、植物采样和粪便收集方法
对于每个旱獭家庭单元，确定了主要的洞穴，这对应于它们的冬眠地——通常位于家庭活动范围的中心（Perrin等人，1993年）。这些主要洞穴具有明显的特征，如土堆、多个入口和高使用率（Ballová和?ibík，2015年）。为了进行全面的植物调查和分析了草本植物的组成，以评估可用饲料的质方面，我们划定了一个半径为100米的圆形采样区域，并以每个主要洞穴为中心。这种方法论依据了先前的研究，这些研究表明主要洞穴是夏季活动的焦点（Perrin等人，1993年；Ballová和?ibík，2015年；Wang和Hou，2021年），并且平均家庭活动范围（HR）很少超过100米的半径（3.14公顷）（Forti等人，2025年）。在每个家庭单元的采样区域内，设置了五条10米长的线性取样带，以代表可用的植被类型。对于PV区域，由于植被较为均匀，分别仅为PV1和PV3设置了四条和三条取样带，因此整个研究地点共设置了42条取样带。线性取样带与最大坡度呈45°角（图3），并且使用间隔70厘米的15根针标出。采用Daget-Poissonet点截距法（Daget和Poissonet，1971年）进行植物调查。物种鉴定遵循《Flora d'Italia》（Pignatti等人，2017年）的分类指南。对于每条取样带，计算了每个植物物种的相对丰度，以确定牧场的比例组成，遵循Daget和Poissonet方程（Daget和Poissonet，1971年）。这些取样带还用作估计牛粪便密度、测量草长度和收集草本植物样本进行营养成分分析的参考点。为了便于详细采样，每条取样带被划分为三个相等的部分（每个部分3.30米），分别标记为a、b和c。此外，沿着取样带还设置了三个不同的圆形区域（半径3.30米），分别标记为A、B和C，如图3所示。这种严谨的采样设计使我们能够全面评估旱獭栖息地内的植物组成、植被结构及相关的生态参数，为后续的饮食分析提供了坚实的基础。

2.2.2 实验室分析
草本植物样本在60°C下干燥24小时并研磨至平均直径为1毫米后，根据文献中报道的程序（Official Analytical Chemists协会，2003年；ANKOM Technology，2020年）分析干物质（DM）、灰分、粗蛋白（CP）、醚提取物（EE）和中性洗涤纤维（NDF）。非纤维碳水化合物（NFC）通过以下公式计算：NFC = 100—灰分—CP—EE—NDF，其中所有变量均以干物质为基础（Official Analytical Chemists协会，2003年）。草本植物脂肪组成的测定首先使用Soxhlet提取装置（OPSIS LiquidLINE，OPSIS AB，Furulund，瑞典）进行提取，溶剂为沸点范围为40°–60°C的石油醚，依据AOAC Method 2003.05（Official Analytical Chemists协会，2016年）。需要注意的是，在提取过程中样本没有完全干燥，以保持提取化合物的完整性。提取后，样本进行了转酯化反应。转酯化使用4%的甲醇硫酸溶液进行。反应混合物在维持在60°C的烤箱中过夜，以确保脂肪酸的完全转化。转酯化过程完成后，所得的脂肪酸甲酯（FAMEs）悬浮在正庚烷中，准备进行色谱分析。色谱分离采用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）方法，使用Shimadzu系统（GC-2010 Plus），配备Omegawax（Sigma-Aldrich Co. LLC., Saint Louis, USA）250柱（30米×0.25微米×0.25微米），依据Koko?ková等人（2025年）描述的方法。获得的数据以总检测脂肪酸的百分比表示。旱獭的粪便样本通过 metabarcoding 分析来检测植物成分的存在。总DNA使用Mag-Bind stool DNA 96试剂盒（Omega Bio-tek，GA，美国）根据制造商的说明进行提取。植物物种的鉴定通过测序叶绿体trnL（UAA）内含子区域来完成，使用引物A49325: 5′ CGAAATCGGTAGACGCTACG3 3′ 和 B49466: 5′ CCATTGAGTCTCTGCACCTATC 3′（Taberlet等人，2007年），参考Palumbo等人（2021年）的报告，循环条件为：初始变性步骤在95°C下2分钟；35个循环，每个循环在95°C下15秒，52°C下15秒，72°C下30秒；最终延伸步骤在72°C下5分钟。原始读数使用MICCA（v.1.7.2）软件（Albanese等人，2015年）处理。具体来说，配对末端读数使用VSEARCH（https://github.com/torognes/vsearch）合并，最小重叠长度为100，允许的最大错配数为32。使用Cutadapt v.1.18（Martin，2011年）修剪引物，并移除了长度小于100 bp且预期错误率高于0.25%的读数。使用UNOISE（https://doi.org/10.1101/081257）算法在MICCA中过滤的序列聚类为Amplicon Sequence Variants（ASV）。分类分配使用RDP分类器v. 2.13（Wang等人，2007年）针对BioAir参考数据库（Leontidou等人，2018年）进行trnL的分类。

2.2.3 序列分析和分类分配
在初步序列处理之后，使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）算法对NCBI核苷酸数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）进行未识别序列的比较分析，以提高分类分辨率。对于每个粪便样本，量化了对应于不同分类单元的序列的出现次数。为了便于样本间的比较，将这些计数标准化为比例，此后称为“饮食比例”。DNA metabarcoding数据的解释容易受到潜在的技术偏差的影响（Pompanon等人，2012年；Ando等人，2018年；Littleford-Colquhoun等人，2022年；Stapleton等人，2022年）。然而，之前使用传统显微组织方法的比较研究表明，DNA metabarcoding在检测野生食草动物（尤其是野生啮齿动物）饮食中的物种方面具有更高的灵敏度和准确性（Soininen等人，2009年）。尽管如此，由于通过metabarcoding获得的定量信息基于相对读数丰度（RRA），可能存在一定的局限性，因为引物匹配不当和不同物种之间粪便丰度与实际饮食内容的相关性存在差异（Stapleton等人，2022年；Sato，2024年），我们同时使用了RRA和相对出现频率（FOO）来量化饮食数据，如Ando等人（2018年）所报告的。为了解决我们的参考库与当地植物群之间的差异，实施了一个严格的分类协调过程。这涉及将我们的序列分配与意大利北部，特别是特伦蒂诺地区的已知分类单元分布以及我们的植物组成分析数据进行了交叉参考。该地区不存在的分类单元被重新分配到更高的分类等级（例如，属A的物种B被重新分类为属A的物种B）。相反，当一个属或科在该地区仅由一个物种或属代表时，相应地进行了细化分类（例如，Bistorta sp.被重新分类为Bistorta vivipara，Celastraceae被重新分类为Parnassia sp.）。在序列最初被分配给该地区不存在的物种的情况下，它们被归类为已知在当地存在的同属物种（例如，各种Vaccinium物种被归类为Vaccinium spp.）。这种全面的序列分析和分类分配方法确保了对metabarcoding数据的稳健和生态相关的解释，使其适合于研究区域的特定植物组成。

2.3 计算和统计分析
2.3.1 植物丰度和饮食选择的分析框架
使用了MicrobiomeAnalyst平台，其工具适用于处理各种类型的数据集（https://www.microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeAnalyst/），以在科、属和物种层面处理和比较牧场组成和粪便样本的植物丰度数据。牧场数据来自Daget-Poissonet点截距法，而粪便样本数据则通过metabarcoding分析获得。数据作为OTU丰度表导入，附有分类和元数据信息。

2.3.2 数据过滤和标准化
由于潜在的污染（Ando等人，2018年）、聚合酶链反应和测序错误、标签跳跃以及生物学和技术偏差可能导致低质量或错误的序列产生，因此忽略了在所有样本中具有相同值的OTU以及在单个粪便样本中仅出现的OTU。同样的程序也应用于牧场数据。为每个研究区域的牧场数据生成了稀疏化曲线。对于粪便样本，虽然一种看似直接的解决方案是设置任意阈值来丢弃低丰度序列以减少错误，但不考虑数据模式可能会错误地消除真实的饮食序列，从而影响后续的推断（Littleford-Colquhoun等人，2022年）。因此，我们没有使用任意阈值来过滤丰度数据，而是根据Alberdi和Gilbert（2019年）提出的方法，基于丰度和出现频率计算了Hill数。Hill数是一组数学上统一的多样性指数，用于量化物种的有效数量（Hill，1973年），从而允许研究人员通过调整缩放参数q来赋予稀有分类单元更大的或更小的权重（Alberdi和Gilbert，2019年）。Hill数表示社区中的有效物种数量，其中q是决定对物种相对丰度敏感度的多样性阶数。给定D表示这种多样性：

- q = 0（物种丰富度）：0D = S。量化包含所有物种的丰富度，其中S是社区中的物种总数。
- q ≈ 1（Shannon多样性）：1D = exp(H′)。量化“典型”物种的多样性，其中H′ = ?Σ(p_i × ln(p_i))，p_i是社区中物种i的比例。这相当于Shannon熵的指数。我们在计算中使用q = 0.9999，因为数学上的限制。
- q = 2（Simpson多样性）：2D = 1/λ。量化优势物种的多样性，其中λ = Σ(p_i2)，p_i是社区中物种i的比例。这等于Simpson浓度指数的倒数。Hill数的一般公式为：qD = (Σp_iq)(1/(1?q))。随着q的增加，该指标对稀有物种的敏感度降低，而对常见物种的依赖性增加（Chao等人，2014年；Littleford-Colquhoun等人，2022年）。基于不同宏观区域和月份的饮食的出现频率和丰度数据构建了Hill数谱。对于每个宏观区域，编制了最重要物种的排名列表，考虑了两种多样性顺序：q ≈ 1（代表典型物种）和q = 2（代表优势物种）。对于每个q值，物种的重要性计算方式不同：

- 对于q ≈ 1，物种的重要性等于其在社区中的相对丰度（p_i）。
- 对于q = 2，物种的重要性计算为：Importance(i,j) = (p_ij)2/Σ(p_ij)2，其中p_ij是样本j中物种i的相对丰度。这种方法使我们能够从平衡（q ≈ 1）和以优势物种为重点（q = 2）的角度评估物种的重要性（Chao等人，2014年）。所有后续的区域和月份间的饮食比较，以及植物选择指数的计算（见下文段落）和饮食中的植物种类与牧场特征之间的相关性分析，都是使用基于Hill数（多样性指数q约为1）选出的物种列表进行的，这表示典型的物种（Littleford-Colquhoun等人，2022年）。所有数据集随后都使用了总计分缩放（Total Sum Scaling，TSS）进行了标准化处理。

2.3.3 植物选择分析

尽管认识到许多生物和方法学因素可能会影响粪便饮食样本中物种的代表性（Sato，2024年），但本研究仍试图阐明植物种类的消费是否与其在放牧环境中的可获得性有关。为此，采用了序列读数的丰度作为估计各种物种对饮食组成相对生物量贡献的代理指标。Stapleton等人（2022年）的最新研究实际上提供了实证证据，支持序列读数丰度与实际摄入植物量之间存在正相关关系，尽管这种关系较为温和。为了了解旱獭对植物的摄入是否遵循牧场中植物的可得性，在每个地区，根据Jacobs（1974年）的公式计算了平均Jacobs选择指数：
D = (r—p) / (r + p—2rp)，其中r代表饮食中某种资源的相对丰度，p代表其在环境中的相对可获得性。该指数的范围是从-1到+1，负值表示避免，正值表示偏好，接近零的值意味着资源的利用与其在环境中的丰度成比例。在计算每个地区的D值时，只包括了在牧场和/或饮食中占比至少2%的属。

2.3.4 统计分析

Reingold–Tilford热树分析（Reingold和Tilford，1981年）：该方法用于评估不同月份饮食中植物种类比例（丰度）的差异。这种方法利用分类层次结构，通过中位丰度和Wilcoxon等级和检验（p < 0.05）定量和统计地描绘群落差异。线性判别分析效应大小（LEfSe）：该技术用于识别在不同地区或月份间具有显著差异丰度的物种。p值的截止值为0.05，Log LDA分数的截止值为3.0。LEfSe执行Kruskal–Wallis检验以识别样本类之间具有显著不同值的特征（例如，植物种类），然后应用线性判别分析（LDA）来估计每个特征的效果大小相关性。Log LDA分数是LDA分析估计的效果大小的对数。较高的Log LDA分数表示特征在区分样本类别方面更为有效（Segata等人，2011年）。相关性分析：为了阐明旱獭饮食选择的驱动因素，研究了饮食组成与牧场特征之间的相关性。牧场变量包括营养组成（干物质—DM、粗蛋白—CP、醚提取物—EE、中性洗涤纤维—NDF、非纤维碳水化合物—NFC）、脂肪酸谱（饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、Omega-6脂肪酸（n6）、Omega-3脂肪酸（n3））、草的长度以及牛粪块密度。这些变量在Spearman相关性分析之前被离散化为五个类别（从1到5）。

偏好指数：在评估牧场质量时，特别是对于非反刍动物来说，高DM和NDF含量通常被认为是营养价值较低的指标（Wasserman和Chapman，2003年；White，2008年）。相反，较高的CP和EE水平（代表脂肪含量）以及NFC（主要是糖类）与高质量牧草相关（Wasserman和Chapman，2003年；White，2008年；Aryal等人，2015年）。为了阐明植物种类消费与牧场营养质量之间的关系，我们开发了一个新的偏好指数。该指数旨在识别在高质量牧场中优先消费的物种（可能有助于整体营养价值）以及在低质量牧场中消费的物种（相对于周围植被而言可能具有高于平均水平的营养价值）。选择了与至少一种关键营养变量（DM、CP、EE、NDF和NFC）具有显著相关性的植物种类（p < 0.05）。对于每个显著相关性，根据以下标准分配了一个值：

- 对于与CP、EE和NFC正相关的物种，分配一个正值，等于相关系数的绝对值。
- 对于与DM和NDF负相关的物种，分配一个负值。

这种评分系统允许细致地解释物种与牧场营养组成之间的偏好关系。具有较高正分数的物种可能与高质量牧场相关，而具有负分数的物种可能表明其消费模式与较低质量的觅食区域相关。这种方法被扩展以纳入额外的生态变量，旨在阐明植物种类消费与更广泛环境因素之间的关系。扩展后的分析包括以下参数：

- 植被结构：评估了植物种类消费与草高度之间的相关性，并按以下方式分配值：
- ○ 短草：负相关系数
- ○ 高草：正相关系数

- 牛的存在：使用牛粪块密度（以每平方米的粪块数量计）作为该地区牛存在的代理指标。相关性评分如下：
- ○ 低粪块密度：负相关系数
- ○ 高粪块密度：正相关系数

- 脂肪酸组成：评估了植物种类消费与牧场脂肪酸谱之间的关系，考虑了以下类别：
- 饱和脂肪酸（SFA）
- 单不饱和脂肪酸（MUFA）
- 多不饱和脂肪酸（PUFA）
- Omega-6脂肪酸（n6）
- Omega-3脂肪酸（n3）

对于这些脂肪酸类别，根据关系的方向使用相同系统进行评分。这种方法为评估植物种类选择与牧场营养动态之间的相互作用提供了定量框架，有助于了解高山旱獭在营养异质性景观中的觅食策略。

3 结果

在整个研究区域的牧场中，共识别出属于36个科的158种植物，其中11种的丰度至少占1%。总体而言，只有114种植物在牧场中的丰度至少占0.02%（见表S1和图S2），并被用于评估牧场中植物种类的可获得性。稀释曲线（图S1）显示出渐近行为，表明我们的采样工作捕获了每个区域植物多样性的大部分。关于高山旱獭的饮食，从四个不同地点收集了50个粪便样本：Busabella（12个）、Fosse（12个）、Piani della Vezzana（10个）和Venegiota（16个）。尽管6月的样本数量最多（23个），其次是7月（16个）和8月（11个），但在整个研究期间成功获得了所有地区的样本。通过粪便宏条形码分析，总共发现了属于48个科的119种植物（表S2），其中14种的丰度至少占1%。未分配种类的丰度为1.64%。图4显示了在粪便（图3A）和牧场（图3B）中发现的14个主要植物科的整体比例。共享科的比例不同；例如，Poaceae在牧场中最丰富（40%），但在粪便中仅排在第四位（11%），而Rosaceae在牧场中占7%，在粪便中占25%。在牧场和粪便中发现的完整科和物种列表分别列在表S1和S2中。总体而言，有些物种或属出现在所有（Alchemilla vulgaris、Centaurea spp.、Taraxacum officinale）或几乎所有收集的粪便样本中，如Carum carvi、Leontodon hispidus和Petasites albus等（表S2）。其他物种，如Schistidium spp.和Setaria verticillata，非常罕见，仅出现在50个样本中的2个中。

图4显示了在高山旱獭粪便颗粒（A）和牧场（B）中发现的14个主要植物科（丰度至少占1%）的整体比例。同时出现在A和B中的科用相同的颜色表示。每个地区的平均粪便样本丰富度（对于q = 0；0D = S）从Venegiota的48.3种到PV的50种不等（图5A），最高值（72）出现在6月的Venegiota样本中，最低值（26）出现在8月的Busabella样本中。根据丰度，q约为1（Shannon多样性）和q = 2（Simpson多样性），典型物种和优势物种的Hill数平均下降到（6-10）到（4-7），最高值出现在Piani della Vezzana（表2）。

（A）不同区域中粪便样本中物种丰度与Hill数相关的平均Hill数分布。由于重叠，Fosse的线条不可见。粗线代表平均值，浅色代表标准差。（B）不同区域中粪便样本中物种出现频率与Hill数相关的分布，其中q = 0表示丰富度，q = 1表示典型植物物种，q = 2表示饮食中的优势物种。

表2. 不同宏观区域中旱獭饮食中的典型（q ≈ 1）和优势（q = 2）物种列表，基于丰度Hill数和物种相对重要性（Imp.）、频率（Freq.）和平均丰度。

| 典型物种（q ≈ 1） | 优势物种（q = 2） |
|------------|------------|
| Alchemilla vulgaris | 0.252 |
| 0.341 | 0.252 |
| Stellaria nemorum | 0.076 |
| Taraxacum officinale | 0.065 |
| Trifolium pratense | 0.082 |
| Rhodiola rosea | 0.058 |
| Helianthemum spp. | 0.056 |
| Carum carvi | 0.145 |
| Poa alpina | 0.057 |
| Trifolium pratense | 0.037 |
| Onobrychis viciifolia | 0.151 |
| Carum carvi | 0.183 |
| Helianthemum spp. | 0.074 |
| Poa alpina | 0.064 |
| Biscutella leavigata | 0.077 |
| Prunella vulgaris | 0.055 |
| Festuca rubra | 0.032 |
| Chenopodium spp. | 0.033 |
| Ranunculus acris | 0.044 |
| Phleum pratense | 0.044 |
| Lotus corniculatus | 0.041 |
| Ranunculus acris | 0.043 |
| Crepis spp. | 0.048 |
| Helianthemum spp. | 0.621 |
| Alchemilla vulgaris | 0.299 |
| Carum carvi | 0.458 |
| Taraxacum officinale | 0.703 |
| Trifolium repens | 0.032 |
| Picea abies | 0.038 |
| Chenopodium spp. | 0.031 |
| Centaurea spp. | 0.031 |
| Ranunculus acris | 0.027 |
| Achillea millefolium | 0.026 |
| Poa alpina | 0.064 |
| Biscutella leavigata | 0.077 |
| Prunella vulgaris | 0.055 |
| Festuca rubra | 0.059 |
| Rhodiola rosea | 0.080 |
| Onobrychis viciifolia | 0.151 |
| Alchemilla vulgaris | 0.101 |
| Helianthemum spp. | 0.076 |
| Poa alpina | 0.064 |
| Biscutella leavigata | 0.077 |
| Trifolium pratense | 0.070 |
| Leontodon hispidus | 0.052 |
| Crepis spp. | 0.048 |
| Ranunculus acris | 0.043 |
| Lotus corniculatus | 0.041 |
| Total abundance | 0.621 |图6：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

不同月份中，基于q值的粪便样本中物种丰富度（A）和出现频率（B）的山丘数量分布，其中q=0表示丰富度，q=1表示典型植物物种，q=2表示饮食中的优势物种。粗线代表平均值，浅色代表标准差。展示牧场和旱獭粪便中每大区域物种丰富度的堆叠条形图分别见图S2和S3。关于粪便样本，我们考虑了86种（总体q≈1，基于出现频率）物种，以将旱獭的饮食与牧场中植物的可获得性及其他因素联系起来。图7总结了不同大区域内旱獭饮食中主要物种的频率和丰富度（丰富度至少1%）。有22种植物在至少一个大区域中的平均丰富度达到或超过了5%。Alchemilla vulgaris的平均丰富度最高，在Busabella地区达到32%，在Venezegiota地区达到27%，其次是Carum carvi（17%）在Venezegiota地区和Onobrychis viciifolia（10.7%）在Fosse地区。

图7：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

列出在饮食中出现比例至少为0.01（1%）的植物物种及其总体频率。PV=Piani della Vezzana。如图8所示，在计算Jacobs指数时涉及的37个属中，有23个属在至少一个区域被正向选择。Alchemilla和Carum在所有区域都被正向选择，而Bistorta、Carex、Deschampsia、Festuca和Trifolium在所有区域中的摄入量都低于其可用性。Achillea、Lotus、Phleum、Poa、Prunella和Ranunculus则根据所考虑的区域被正向或负向选择。在14个在单一区域被正向选择的属中，Heracleum和Stellaria在Busabella地区被选择，Achillea、Lotus、Onobrychis、Petasites和Poa在Fosse地区被选择，Biscutella、Leontodon、Phleum、Sorbus和Vaccinium在Piani della Vezzana地区被选择，Picea和Ranunculus在Venezegiota地区被选择。

图8：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

Jacobs指数表示在每个区域内至少占2%的植物属。PV=Piani della Vezzana。为了确定旱獭的饮食在夏季的变化程度以及这种变化是否完全由植物比例引起，我们对3个月（6月、7月和8月）进行了直接比较。这些比较的结果以Reingold–Tilford热量树的形式表示（Reingold和Tilford 1981），如图9所示。

图9：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

Reingold–Tilford热量树表示不同月份（6月、7月和8月）牧场（A、C和E）和旱獭粪便样本（B、D和F）中植物丰富度的比较。彩色分支（非灰色）表示显著的统计差异（p<0.05）。季节间植物可用性的变化非常小（图8A,C,E），仅在6月发现了显著差异，其中Ranunculaceae含量较高，而Agrostis spp.和Festuca spp.含量较低。然而，饮食却发生了变化（图8B,D,F）。6月的饮食以Poaceae（Phleum spp.、Poa spp.）、Asteraceae（Petasites albus）和Pinaceae（Picea abies）的含量较高为特征；与7月相比，6月的饮食中Fabaceae（Trifolium pratense）、Pimpinella saxifraga和Heracleum spp.的含量较低。7月到8月之间，7月的饮食中Plantaginaceae（Globularia cordifolia、Plantago spp.）、Apiaceae（Carum carvi、Pimpinella spp.）、Betulaceae（Betula pendula）、Crepis spp.和Taxacacum spp.的含量较高。6月和8月之间的饮食差异最大，6月的饮食中Asteraceae（Bellis perennis）、Poaceae（Poa spp.）、Rosaceae（Potentilla anserina）、Amaranthaceae（Chenopodium spp.）和Brassicaceae（Biscutella laevigata）的含量较高。在牧场中发现的所有物种中，约有62种在不同区域间的相对丰富度存在显著差异。如图S4所示，Busabella地区的丰富度最高，包含12种植物，包括Festuca rubra、Deschampsia caespitosa、Lolium arundinaceum、Phleum pratense和Agrostis stolonifera。Fosse地区的丰富度最高，包含20种植物，包括Sesleria caerulea、Erica carnea、Carex flacca、Prunella vulgaris和Plantago media。Piani della Vezzana地区的丰富度最高，包含15种植物，包括Bistorta vivipara、Thymus pulegioides、Poa alpina、Lotus corniculatus和Scabiosa velenovskyana。最后，Venezegiota地区的丰富度最高，包含14种植物，包括Poa trivialis、Poa pratensis、Alchemilla vulgaris、Trifolium repens和Taraxacum officinale。在根据出现频率被认为是旱獭饮食中典型的86种植物中，有14种在不同区域间的丰富度存在显著差异（图10）。

图10：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

线性判别分析效应大小（LEfSe）的结果显示，来自不同区域的旱獭粪便样本中发现的植物物种的相对丰富度存在显著差异（p<0.05）。物种按它们的LDA得分降序排列。颜色反映了每个大区域的相对丰富度，红色表示最高丰富度，其次是橙色、浅蓝色和蓝色。Busabella地区没有任何一种物种的丰富度最高，而Fosse地区的饮食中Onobrychis Viciifolia、Helianthemum spp.和Pimpinella saxifraga的丰富度最高。Piani della Vezzana地区的饮食中Biscutella laevigata、Crepis spp.、Bistorta vivipara、Bellis perennis和Scabiosa columbaria的丰富度最高。最后，Venezegiota地区的饮食中Alchemilla vulgaris、Taraxacum officinale、Achillea millefolium、Ranunculus acris、Taraxacum sp.和Plantago major的丰富度最高。对于24种植物，发现粪便样本中单个植物物种的丰富度与牧场的营养特征之间存在显著的相关性（Spearman相关性，p<0.05，表S3）。如图11所示，24种植物中有17种的旱獭饮食中的相对丰富度与良好的营养质量指标呈正相关。Bistorta vivipara的丰富度与所有良好的牧场质量指标呈正相关，这些指标包括低DM和NDF以及高CP、EE和NFC。Ranunculus acris、Potentilla anserina和Poa badensis与5个良好牧场质量指标中的4个呈正相关，而其他物种与不同数量的营养指标相关。有7种植物在正向和负向指标之间表现平衡，例如Potentilla anserina和Ranunculus acris，它们与低DM和高CP相关，但也与高NDF和低脂肪相关。

图11：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

对于旱獭饮食中丰富度与牧场整体营养评分显著相关的植物物种（Spearman，p<0.05）。当DM和NDF较高时给予负分，当较低时给予正分；CP、EE和NFC则相反。CP=粗蛋白；DM=干物质；EE=醚提取物；NDF=中性洗涤纤维；NFC=非纤维碳水化合物。其余7种植物与低牧场质量指标呈正相关。值得注意的是，Pimpinella saxifraga与所有5个低质量牧场指标都呈正相关，如高DM和NDF，以及低CP、EE和NFC。不同月份和大区域的牧场平均营养成分见图S5。12种植物与草的长度和/或牛粪堆的密度相关（图12）。Achillea millefolium、Pimpinella saxifraga和Trollius europaeus与高草量和低密度牛粪堆呈正相关。相反，Crepis spp.、Ranunculus acris和Scabiosa columbaria与低草量和高密度牛粪堆呈正相关。其他物种则与草的长度或牛粪堆的密度独立相关（图12）。

图12：在图谱查看器中打开（PowerPoint）

对于旱獭饮食中丰富度与草的长度（GLnt）和牛粪堆的密度（CTLDung）显著相关的植物物种（Spearman，p<0.05）。如图S6所示，20种植物在旱獭饮食中的丰富度与饮食中某些脂肪酸（FA）类别的浓度之间存在显著的相关性（Spearman相关性，p<0.05）。14种植物与多不饱和脂肪酸（PUFAs）的浓度呈正相关，包括n-6（7种）和n-3（8种）FAs。两种植物（Larix decidua和Bistorta vivipara）与单不饱和脂肪酸（MUFAs）呈负相关。另外两种植物，Heracleum sp.和Trifolium pratense，与n-3 FAs呈负相关。

4. 讨论

这项研究有助于更好地了解高山旱獭的饮食习惯和觅食行为。通过应用DNA宏条形码技术，我们提供了有关高山旱獭饮食的有趣见解，识别出了比以往报道更多的植物物种。我们的发现表明，尽管高山旱獭表现出广泛的食性，但它们的觅食模式也受到植物营养成分、栖息地的空间变化和季节性变化的影响。此外，我们还揭示了牧场营养质量、牲畜放牧和旱獭饮食选择之间复杂相互作用的新见解。

4.1 高山旱獭的饮食有多多样化？旱獭在多大程度上会根据栖息地中特定植物物种的可用性进行选择性觅食？本研究是首次应用DNA宏条形码技术来表征高山旱獭的饮食。通过饮食中的读取次数，我们在物种水平上识别了植物物种的频率和丰富度，并在属水平上比较了粪便样本和牧场中发现的属的比例。以往对高山旱獭饮食习惯的研究依赖于粪便材料的显微镜分析（Bassano等人1996年；Massemin等人1996年；Rudatis和Battisti 2006年；Garin等人2008年），这允许量化饮食中的植物科；而定性描述仅限于物种水平。用于识别粪便样本中植物物种的技术差异解释了为什么在我们的研究中检测到的科（34个）、属（70个）和物种（86个）的数量显著多于以前的报告（Bassano等人1996年主要属于7个科的11种；Massemin等人1996年；Rudatis和Battisti 2006年10-17个科的32种；Garin等人2008年）。这一发现值得注意，因为牧场中观察到的物种数量差异显著较小，从我们研究中的158种（36个科）到Bassano等人1996年的70种；Massemin等人1996年；Rudatis和Battisti 2006年的28-30种；Garin等人2008年的30-38种不等。在其他旱獭物种的研究中也观察到了类似的结果。值得注意的是，Chovancová和?oltésová（1988年）和Kar?（2006年）在Tatra旱獭（Marmota marmota latirostris K.）的饮食中发现了9-11种植物，而Aryal等人（2015年）在喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana H.）的粪便中检测到了17种植物，尽管这些动物使用的牧场中有78种植物。这些结果表明高山旱獭具有高度广泛的食性。先前研究（Bassano等人1996年；Massemin等人1996年；Rudatis和Battisti 2006年；Garin等人2008年）关于饮食广度的结果与基于丰富度的典型物种数量更为一致，平均每个区域有7-11种植物（表2）。Alchemilla vulgaris在所有区域的粪便材料中都是优势物种，其次是Trifolium pratense、Carum carvi和Heliantemum spp.，这些物种在两个不同区域的饮食中都是优势物种。值得注意的是，所有基于丰富度的优势物种（q=2）都是草本植物，例外的是Piani della Vezzana中的Poa alpina属于Poaceae，以及Venezegiota中的Picea abies。如果考虑到q≈1时包括的物种（表2），饮食中属于Poaceae的其他植物只有Busabella中的Festuca rubra和Venezegiota中的Phleum pratense以及Piani della Vezzana中的Poa alpina。这一结果证实了草本植物构成了高山旱獭和其他旱獭物种饮食的主要部分（表2），这也得到了其他作者（Bassano等人1996年；Massemin等人1996年；Garin等人2008年；Ballová和?ibík 2015年）的报道，并且本研究强调了Rosaceae、Asteraceae和Apiaceae在饮食中的高比例。然而，基于丰富度的典型物种平均只占饮食的62%-70%（表2），其余38%-30%由多种数量较少的物种组成。因此，为了更深入地探讨饮食与其驱动因素之间的关系，选择了基于出现频率的典型物种列表（86种）。在这些植物物种中，有17种没有在牧场中被检测到（见表S2），这可能是因为它们在牧场植物组成中的数量较少，使用Daget-Poissonet方法进行记录时难以发现，而该方法往往会低估稀有物种的分布（Gusmeroli 2012）。尽管众所周知，出现频率数据比数量数据的信息量要少（Alberdi and Gilbert 2019），但在本研究中，除了少数例外，数量较多的物种也显示出较高的出现频率（图7）。然而，高山旱獭的饮食组成可能包含比我们发现更多的植物物种，因为目前使用的方法仅基于trnL基因区域来检测和量化饮食中的植物分类单元，正如Goldberg等人（2020）所阐述的，这可能导致一些物种被遗漏。粪便中trnL基因的序列丰度取决于相应物种的叶绿体密度及其植物组织的可消化性，因此直接将粪便中的植物组成与摄入饮食的植物组成进行关联是不确定的（Palumbo等人2021）。尽管如此，由于植物物种的数量与其在粪便样本中的频率大致相符（表S2和图8），除了少数例外，我们仍然使用这一指标来比较饮食中植物属的比例是高于还是低于其在牧场中的比例，并将这种比较表示为Jacob指数。高分辨率的属级分析显示，高山旱獭在不同区域对不同植物属的选择模式存在差异，这可能是由于替代属的可用性不同（Soininen等人2013）。在给定区域饮食中占主导地位的物种（q=2）中，那些在该区域被积极选择的物种（Jacob指数为正）的植物，例如在所有区域都出现的Alchemilla，在Fosse和Venegiota出现的Carum，在Fosse出现的Onobrychis，在Piani della Vezzana出现的Biscutella，可能具有更优越的营养价值或适口性。相反，在Piani della Vezzana占主导地位但Jacob指数为负的属，如Trifolium和Poa，在牧场中相对较多（图S4），但由于营养价值较低或含有不希望的次生化合物，因此较少被选择（Carlsen and Fomsgaard 2008）。这种选择性进食行为证实了饮食中植物家族比例与牧场中发现的植物家族比例之间的差异，如图4所示。

4.2 高山旱獭的饮食在不同地点和整个夏季的变化有何不同？根据我们的研究结果，生活在研究区域的高山旱獭在组成饮食的主要和典型植物物种以及某些物种的出现频率方面存在差异（表2和图7）。如图S4所示，尽管不同宏观区域在超过一半的检测到的植物物种（114种中的62种）的相对数量上有显著差异，但在旱獭饮食中的数量只有14种存在差异（图10），这表明饮食之间的差异并不完全与牧场之间的差异有关，也可能是由于各地区发生的不同选择行为所致。在14种在不同区域数量上存在差异的物种中，Crepis属在饮食中的变化遵循了牧场中的差异；8种物种（Helianthemum属、Onobrychis viciifolia、Biscutella laevigata、Achillea millefolium、Bellis perennis、Pimpinella saxifraga、Taraxacum属和Scabiosa columbaria）在不同宏观区域的饮食中的比例不同，尽管它们在牧场中的比例没有差异。其余5种物种（Alchemilla vulgaris、Bistorta vivipara、Taraxacum officinale、Ranunculus acris和Plantago major）的选择也有所不同，因为它们在牧场中的差异与粪便中的差异不匹配。选择不仅发生在那些在饮食中不同的物种上，也发生在那些在牧场中比例不同但在饮食中比例相同的物种上。这些发现与Soininen等人（2013）对田鼠的研究结果一致，他们在研究中发现植物功能组（杂草和草本植物）内的不同科和物种被不同程度地消耗和选择。虽然我们的研究结果表明高山旱獭的饮食在不同地点存在显著的空间变化，但同样重要的是要考虑这些饮食模式随时间的变化。从晚春到夏末的季节性变化为旱獭的觅食行为增加了另一层复杂性。通过研究这些时间变化，我们可以更全面地了解高山旱獭如何适应环境中的空间和季节性变化。关于时间变化，牧场的植物组成在整个夏季并没有表现出一致的变化。最大的变化发生在6月和7月之间，而在7月和8月之间的变化较为不明显（图10）。只有Agrostis stolonifera和Ranunculus montanus在整个夏季的数量显示出统计学上的显著变化。这些发现表明，尽管大多数物种的相对数量在整个夏季保持稳定，但它们的物候阶段和营养特征可能会发生变化。实际上，可用植物的物候阶段随时间显著变化，Garin等人（2008）的研究表明，6月和7月之间，非繁殖性植物的生长明显减少，随后随着季节的进展逐渐减少。相反，开花和结果植物的数量在7月达到峰值，到了9月几乎消失。正如其他作者所报道的，不同月份对牧场的营养平衡有不同的贡献（Aryal等人2015），总体而言，草本植物的营养成分在生长季节末期减少（Soininen等人2013）。大多数草类的蛋白质含量随着生长季节的进展而减少，但像其他啮齿动物一样，高山旱獭在夏末时期更倾向于选择禾本科种子，这与大多数草本植被的叶子和茎秆结构的衰老相吻合（Rudatis和Battisti 2006；Goldberg等人2020）。如图S5所示，并且文献中也有所报道（Aryal等人2015；Goldberg等人2020），牧场在6月以及早春和初夏的蛋白质、脂肪和糖的含量较高，而在7月和8月通常减少。

4.3 高山旱獭的饮食与植物营养成分之间有什么关系，还有哪些潜在因素影响它们的饮食选择？虽然早期关于哺乳动物食草动物食物选择的研究表明，偏好食物的绝对和相对可用性可能会增加其消耗量（Soininen等人2013；Goldberg等人2020），但植物选择也可能与不同可利用植物部分中的营养成分（Aryal等人2015）、适口性和可消化性有关。尽管一些作者认为某些偏好，如旱獭更喜欢杂草而非禾本科植物，似乎与这两种植物类型的营养价值有关（Carey和Moore 1986），但目前还没有数据来支持这一观点。Garin等人（2008）指出，杂草通常含有较高的营养成分（特别是磷、钙、钠，可能还有蛋白质），而细胞壁成分（纤维）的含量较低，而Stallman和Holmes（2002）则认为选择杂草而非禾本科植物可以归因于杂草更高的水分含量。据我们所知，只有Aryal等人（2015）尝试将旱獭的饮食选择与植物的营养成分联系起来，他们发现食物植物中的大量营养元素含量与其在饮食中的比例呈正相关。同样，也有报道指出塔尔巴干旱獭（Marmota sibirica R.）在活跃季节的前半段避免高纤维素含量的植物，主要食用草本植物，而在后半段主要食用草本植物（Ballová和?ibík 2015）。本研究首次证明，在高山旱獭中，某些植物物种在饮食中的丰富程度随着每个家族单位使用的牧场的总体营养价值以及夏季月份的变化而增加。当牧场富含蛋白质和糖分且干物质含量低时（图11），某些物种在旱獭饮食中的数量会增加。相反，当牧场缺乏这些营养成分且纤维含量较高时，旱獭的饮食则会包含更多其他物种。由于旱獭在冬眠后恢复瘦体重和为下一次冬眠准备脂肪存量的活跃季节较短，因此它们会选择高能量的植物（Aryal等人2015），可以合理假设在牧场营养价值较高时饮食中更丰富的植物物种要么是那些积极贡献这种价值的植物（通常具有高糖、蛋白质和脂肪含量，纤维和干物质含量低），要么是在那个有利时期才达到足够营养价值的植物。最优觅食理论预测，当食物充足时，个体更有可能做出选择并选择高质量的食物（Goldberg等人2020）。通过将属选择的结果与牧场质量的相关结果进行对比，可以看出Alchemilla vulgaris、Crepis属和Taraxacum属被积极选择，这很可能是由于它们的蛋白质含量（图9和10）。相比之下，Bistorta vivipara、Potentilla anserina、Poa badensis以及在某些地区Ranunculus acris和Phleum pratense在牧场整体质量较高时更受青睐，这可能对应于营养上有利的物候阶段。相反，当牧场营养质量较差时更被消耗的物种可能是在这种条件下表现出高于平均水平的营养特性的植物，如Helianthemum属和Heracleum属。虽然平均来看这些植物的营养价值不高，但由于它们的物候阶段或内在特性，它们可能是最不理想的选项，如Carex flacca（图9和10）。与其他小型到中型后肠发酵动物一样，高山旱獭依赖于低纤维和高能量的食物（Hume等人1993；Wasserman和Chapman 2003）。Holmes（1984）进一步证实了饮食中蛋白质的重要性，他记录了灰旱獭（Marmota caligata）在特定草地的利用增加了六倍。这种增加的利用与这些地区植被中蛋白质含量的提高11%相关。高山旱獭像其他啮齿动物一样，能够在春季和初夏选择它们喜欢的杂草和草本植物，但随着夏季的進行，必须摄入较少营养价值的（但常见的）草类，以确保它们获得足够的能量度过冬季（Rudatis和Battisti 2006；Goldberg等人2020）。正如文献中所报道的（Aryal等人2015；Goldberg等人2020），牧场在6月以及早春和初夏的蛋白质、脂肪和糖的含量较高，而在7月和8月通常会减少。

高山旱獭的饮食与植物营养成分之间存在什么关系？此外，还有哪些其他潜在因素影响它们的饮食选择？尽管早期关于哺乳动物食草动物食物选择的研究表明，某种首选食物的绝对和相对可用性可能会增加其消耗量（Soininen等人2013；Goldberg等人2020），但植物选择也可能与每种植物的营养成分（Aryal等人2015）、适口性和可消化性有关。尽管一些作者认为，例如旱獭偏爱杂草而非禾本科植物，这似乎与这两种植物类型的营养价值差异有关（Carey和Moore 1986），但目前还没有数据来支持这一观点。Garin等人（2008）指出，杂草通常含有较高的营养成分（特别是磷、钙、钠和可能的蛋白质），而细胞壁成分（纤维）的含量较低，而Stallman和Holmes（2002）则认为选择杂草而非禾本科植物可以解释为杂草含有较高的水分。据我们所知，只有Aryal等人（2015）尝试将旱獭的饮食选择与植物的营养成分联系起来，他们发现食物植物中的大量营养元素含量与其在饮食中的比例呈正相关。同样，也有报道指出塔尔巴干旱獭（Marmota sibirica R.）避免高纤维素含量的植物，导致它们在活跃季节的前半段主要食用草本植物，后半段主要食用草本植物（Ballová和?ibík 2015）。本研究首次证明，在高山旱獭中，饮食中某些植物物种的丰富程度随着每个家族单位使用的牧场的总体营养价值和夏季月份的变化而增加。当牧场富含蛋白质和糖分且干物质含量低时（图11），某些物种在旱獭饮食中的数量会增加。相反，当牧场缺乏这些营养成分且纤维含量较高时，旱獭的饮食会包含更多其他物种。由于旱獭在冬眠后恢复瘦体重和为下一次冬眠储备脂肪的活跃季节较短，它们会倾向于选择高能量的植物（Aryal等人2015），因此可以合理假设，在牧场营养价值较高时饮食中更丰富的植物物种要么是那些积极贡献这种价值的植物（通常具有高糖、蛋白质和脂肪含量，纤维和干物质含量低），要么是在那个有利时期才达到足够营养价值的植物。最优觅食理论预测，当食物充足时，个体更有可能进行选择性消费，并应选择高质量的食物（Goldberg等人2020）。通过将属选择的结果与牧场质量的相关结果进行对比，可以看出Alchemilla vulgaris、Crepis属和Taraxacum属被积极选择，很可能是因为它们的蛋白质含量（图9和10）。相比之下，当牧场整体质量较高时，Bistorta vivipara、Potentilla anserina、Poa badensis以及在某些地区Ranunculus acris和Phleum pratense可能更受青睐，这可能对应于营养上有利的物候阶段。相反，当牧场营养质量较差时更被消耗的物种可能是那些在这些条件下表现出高于平均水平的营养特性的植物，如Helianthemum属和Heracleum属。然而，尽管从平均来看这些植物的营养价值并不特别高，但由于它们的物候阶段或内在特性，它们可能是最不理想的选择，如Carex flacca（图9和10）。与其他小型到中型后肠发酵动物一样，高山旱獭依赖低纤维和高能量、高蛋白质的食物（Hume等人1993；Wasserman和Chapman 2003）。Holmes（1984）进一步证实了饮食中蛋白质的重要性，他记录了灰旱獭（Marmota caligata）在特定草地斑块中的利用增加了六倍。这种增加的利用与这些地区植被中蛋白质含量的提高11%相关。与其他啮齿动物一样，高山旱獭能够在春季和初夏选择它们喜欢的杂草和草本植物，但随着夏季的进展，它们必须摄入较少营养价值的（但常见的）草类，以确保获得足够的能量度过冬季。这与其他啮齿动物的研究结果一致，除了食物的可获得性外，其他高质量食物的可获得性也会影响饮食中的植物组成，食物偏好与植物的营养价值有关（Soininen等人2013）。总体而言，这些结果表明高山旱獭表现出灵活的觅食生态，主要受牧场营养特性的驱动。虽然植物的营养成分在塑造高山旱獭的饮食中起着关键作用，但必须认识到饮食选择受到多种因素的复杂影响。我们关于植物营养成分与旱獭饮食之间关系的发现提供了有价值的见解，但它们并不能完全解释观察到的觅食行为模式。为了获得更全面的理解，我们必须考虑可能影响高山旱獭食物资源和质量的其他环境和生态因素。季节性不是影响牧场营养价值变化的唯一因素，因为植物组成和牲畜的放牧程度也会在同一季节内导致不同区域之间的营养差异（图S5）。放牧牲畜会影响植物的可用性和物候阶段，特别是通过刺激大多数植物物种新芽的生长（Li等人2019）。然而，放牧会促进具有开花部分的杂草的开花阶段（Li等人2019）。草类具有显著的再生能力。因此，当受到放牧时，这些饲料物种的蛋白质浓度和适口性即使在生长季节接近尾声时也能保持较高水平（Radonjic等人2019）。Cattle放牧对旱獭饮食的可能影响通过某些植物在饮食中的数量与牧草长度和粪便块密度之间的显著相关性得到了证实，后者是牲畜存在的指示器。高密度的粪堆和较短的草本植物可以解释为有放牧活动，这有利于岩羊饮食中包含Crepis spp.、Scabiosa columbaria、Ranunculus acris、Bistorta vivipara（仅限于较短的草本植物）和Trifolium pratense（仅限于高密度的粪堆）。值得注意的是，岩羊饮食中的Bistorta vivipara和Ranunculus acris也与牧场中较低的干物质含量和较高的蛋白质含量相关，这通常是植物处于幼年阶段的特征，这种状态可能受到初夏（六月）或放牧活动的影响（Li等人，2019年）。Crepis spp.因其高蛋白质含量而存在于岩羊的饮食中（图11），并且在Venegiota和Piani della Vezzana地区也有发现（图10），这些地方的牛群数量较多。相反，当牧场质量较低且粪堆数量较少时，Pimpinella saxifraga、Gypsophila spp.和Carex flacca在岩羊的饮食中更为常见（图11和图12）。这可能是因为在这些特定环境中，尽管粪堆的肥料效果较低，但这些植物的营养价值相对较高。尽管关于高山牧场中单个植物的营养成分的文献数据较少，但Jayanegara等人（2011年）报告的Achillea millefolium含有16.7%–21.5%的蛋白质，并且其存在与草本植物的高度相关，而粪堆数量较少，这也支持了这一假设。因此，这些结果可以证实家畜放牧与岩羊饮食组成之间可能存在相互作用，这一现象在其他啮齿动物（如田鼠）中也有研究（Soininen等人，2013年）。草本植物的高度不仅影响饮食的营养成分，还可能影响家畜和岩羊之间的种间竞争（Ballová和?ibík，2015年）。与M. marmota latirostris亚种不同，后者更喜欢在高大草类草原和属于Calamagrostion villosae及Trisetion fusci联盟的茂密草本植物群落中觅食（Chovancová和?oltésová，1988年；Kar?，2006年），黄腹岩羊的觅食地点偏好与植被密集、高耸的区域呈相反相关（Carey和Moore，1986年）。在植被密集的栖息地中，岩羊在觅食时必须提高警觉性并减少食物摄入量（Ballová和?ibík，2015年）。选择哪些植物进入岩羊饮食的因素还可能包括不同植物种类的脂肪酸含量和植物所处的物候阶段。多不饱和脂肪酸，特别是亚油酸和亚麻酸，对某些冬眠哺乳动物（Ruf和Arnold，2008年）至关重要，一些植物种子或花朵中含有高水平的多不饱和脂肪酸（Garin等人，2008年）。心脏肌细胞膜中n-6多不饱和脂肪酸与n-3多不饱和脂肪酸的比例升高似乎能保护心脏免受心律失常的影响，而在非冬眠的低温生物中，这种问题是由于细胞质钙水平显著升高引起的（Ruf和Arnold，2008年）。尽管n-6多不饱和脂肪酸磷脂被认为能在低温下稳定心脏功能，但长链（≥C18）的n-3多不饱和脂肪酸可能增强氧化能力（Arnold等人，2011年）。岩羊饮食中某些植物的丰富性与牧场中的多不饱和脂肪酸及n-3和n-6多不饱和脂肪酸含量呈正相关，而在其他情况下，当牧场中的多不饱和脂肪酸含量较低时，这些植物则更为常见，且与饱和脂肪酸（SFA）呈正相关。虽然n-3和n-6多不饱和脂肪酸在细胞膜层面的作用已经明确，但它们作为饮食成分的作用仍不确定。一些研究表明，自由活动的阿尔卑斯岩羊的膜重组在很大程度上独立于直接的饮食摄入（Arnold等人，2011年），并且这些动物在整个年度内其白色脂肪组织中的脂肪酸组成保持稳定，不受饮食中脂肪酸变化的影响（Cochet等人，1999年）。

4.4 方法学考虑
尽管本研究有助于我们更深入地了解阿尔卑斯岩羊的动态饮食选择，并强调了营养因素在塑造其觅食决策中的重要性，但我们也要承认本研究方法存在某些局限性。与显微组织技术相比，DNA宏条形码技术在区分动物所消耗的具体植物成分（种子、根或叶片）方面存在根本性不足，因此无法揭示季节性变化对不同植物部分利用情况的影响。由于无法考虑不同植物种类或其各组成部分之间的消化率差异，本研究可能低估了岩羊对高宏量营养素含量植物的偏好，尤其是如果这些资源主要以花朵结构或多肉果实的形式存在时，因为这些通常更容易被消化。此外，可用于分析的粪便样本数量受到野外收集这些样本的挑战限制。

5 结论
我们的研究发现，阿尔卑斯岩羊的饮食范围非常多样，至少包括86种植物，这些植物在时间和空间上存在变化。结果还表明，这些植物在岩羊饮食中的比例变化取决于牧场的营养组成，并不严格依赖于它们的可获得性。这一观察表明，岩羊采取了一种策略性方法，结合非最佳食物来源和变化但互补的宏量营养素比例来构建均衡的饮食。此外，牧场的营养质量会受到时间变化的影响，这种变化不仅由季节性变化驱动，还受到家畜放牧活动的影响。尽管要全面了解季节性饮食变化和觅食偏好，需要详细了解不同植物物候阶段的营养成分，但在快速变化的景观背景下，理解季节性饮食组成、资源可用性和生态相关物种（如阿尔卑斯岩羊）的觅食偏好之间的复杂关系至关重要。这种知识对于制定适应性牧场管理策略至关重要，特别是在考虑人为干扰对植物和动物群落潜在影响的情况下。作者贡献
Giorgio Marchesini：概念构思（主导）、数据管理（平等参与）、调查（平等参与）、方法论（平等参与）、撰写原始草稿（主导）。Elena Basso：数据管理（平等参与）、调查（平等参与）、方法论（平等参与）、撰写——审阅和编辑（协助）。Cristina Pornaro：概念构思（平等参与）、数据管理（平等参与）、调查（主导）、撰写——原始草稿（平等参与）。Piergiovanni Partel：概念构思（协助）、资金获取（主导）、调查（平等参与）、撰写——审阅和编辑（协助）。Gilberto Volcan：调查（平等参与）、方法论（协助）、撰写——审阅和编辑（协助）。Enrico Dorigatti：调查（平等参与）、撰写——审阅和编辑（协助）。Rudi Cassini：方法论（主导）、撰写——审阅和编辑（协助）。Erica Marchiori：调查（平等参与）、撰写——审阅和编辑（协助）。Salvatore Raniolo：数据分析（平等参与）、撰写——审阅和编辑（主导）。Massimo Pindo：数据管理（平等参与）、调查（平等参与）、撰写——审阅和编辑（协助）。Andrea Squartini：数据管理（平等参与）、数据分析（主导）、撰写——审阅和编辑（协助）。致谢
我们感谢Paneveggio Pale di San Martino自然公园的支持。感谢所有参与研究的帕多瓦大学学生，特别是Caterina Byloos、Matteo Arseni、Matteo Scarpiello和Giacomo Mingoia。没有他们的贡献，这项研究就无法完成。本研究得到了Paneveggio Pale di San Martino自然公园（资助号2022）和帕多瓦大学动物医学、生产和健康系（DOR 2022）的支持。开放获取出版由Padova大学提供，作为Wiley - CRUI-CARE协议的一部分。资金支持
本工作得到了帕多瓦大学动物医学、生产和健康系（DOR 2022）以及Paneveggio Pale di San Martino自然公园（2022）的支持。利益冲突
作者声明没有利益冲突。数据可用性声明
序列读取数据、其元数据和牧场数据存放在UNIPD研究数据仓库中（https://researchdata.cab.unipd.it/1692/）。统计分析使用Microbiome Analyst软件进行（https://www.microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeAnalyst/）。计算Hill数的R代码可在Alberdi和Gilbert（2019）的论文中找到，链接为：https://doi.org/10.1111/1755-0998.13014。