宿主属和栖息地利用方式决定了 Batrachochytrium dendrobatidis 系统在高度多样化的热带两栖动物群落中的分布

《Ecology and Evolution》：Host Genus and Habitat Use Shape the Distribution of Batrachochytrium dendrobatidis Lineages in a Hyper-Diverse Tropical Amphibian Community

　　**摘要**

病原体常常利用人类活动引起的生态和进化机会，对宿主群体产生深远影响。在巴西的大西洋森林中，两栖动物壶菌Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）就是这一现象的典型例子，它存在两个共存的谱系：地方性的Bd-Brazil谱系和全球性的泛动物群谱系（Bd-GPL），后者与历史上两栖动物数量的下降以及Bd的杂交事件有关。为了研究宿主分类和栖息地使用如何影响Bd谱系的分布，我们在两年时间内对3836只代表42个物种的两栖动物进行了采样，这些动物分布在水生和陆地环境中。我们通过核基因和线粒体SNP检测方法，成功地对777个Bd阳性样本中的252个进行了基因分型，以区分Bd-GPL、Bd-Brazil、杂交体以及共感染情况。研究结果表明，Bd谱系的分布与宿主属和栖息地类型存在非随机关联。尤其是属于Hylodes属的溪流栖息青蛙，其Bd-GPL和Bd-Brazil的共感染率高于大多数其他属。这种模式可能反映了它们与溪流的终生关联，这增加了它们接触多种Bd谱系游动孢子的机会。相比之下，陆地栖息地中的感染主要来自单一的Bd-GPL谱系，即使考虑到不同栖息地类型间两栖动物物种组成和宿主属的差异也是如此。这些发现表明，水生栖息地可能为Bd-Brazil提供了避难所，而Bd-GPL可能具有更强的耐旱能力。本研究的方法学局限性，包括对高负荷感染的基因分型偏好以及有限的基因组分辨率，强调了需要更高分辨率的测序方法来全面理解大西洋森林中的病原体动态。

**1 引言**

全球化在促进野生动物中新发传染病（EIDs）方面的作用日益受到重视（Cunningham等人2017；Daszak等人2001；Tazerji等人2022）。具体而言，病原体的人为传播不仅将新的病原体引入以前未受影响的地区，还促进了现有病原体新基因变异的扩散（Marie和Gordon 2023；O’Hanlon等人2018）。这一过程由贸易、旅行和栖息地改变等人类活动驱动，可能导致重大的生态和流行病学后果，包括病原体的全球扩散、区域性疾病爆发以及宿主-病原体动态的变化（Aguirre 2017）。两栖动物真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）展示了全球化如何使得一种野生动物疾病在全球范围内传播，不同地区的结果各不相同，尤其是在生物多样性丰富的生态系统中（Fisher和Garner 2020；Jenkinson等人2016；O’Hanlon等人2018；Rosenblum等人2013）。这些不同的结果反映了Bd基因型、宿主多样性和当地环境条件之间的复杂相互作用，这些因素共同决定了两栖动物群体中疾病的严重程度。Bd很可能起源于东亚，这一点从近期该地区没有两栖动物数量下降、本地宿主的高耐受性以及祖先Bd-Asia-1谱系的鉴定中可以得到证实（Bai等人2012；Bataille等人2013；Fu和Waldman 2019；O’Hanlon等人2018；Sun等人2025）。随着时间的推移，Bd分化为多个系统发育上不同的谱系，迄今为止已鉴定出至少五个主要分支（Farrer等人2011；Rosenblum等人2013）。全球性泛动物群谱系（Bd-GPL）出现的时间较晚，与除亚洲以外所有大陆上的当代两栖动物数量下降有关（Farrer等人2011；James等人2009；O’Hanlon等人2018；Scheele等人2019）。其他谱系，如Bd-Asia-2/Brazil（以下简称Bd-Brazil），具有更有限的分布范围，通常被认为是其所在地区的“地方性”病原体（Jenkinson等人2016；Rosenblum等人2013；Schloegel等人2012）。这些谱系的传播得益于人类活动，尤其是两栖动物贸易（Schloegel等人2012）。非生物因素如温度会影响Bd的生长速度、游动孢子的产生和感染性，因此在决定谱系的适应性和潜在分布方面起着关键作用（Sheets等人2021；Sun等人2025；Voyles等人2017）。目前Bd谱系的分布可能反映了入侵历史、它们适应当地环境条件的遗传能力以及克服宿主防御的能力（Belasen等人2022）。巴西是一个研究Bd生物学和进化的独特复杂系统。虽然南美洲其他国家仅存在入侵性的Bd-GPL谱系（Byrne等人2019；James等人2015；Neely等人2025；Smart等人2024），但在巴西的大西洋森林中同时存在Bd-GPL和Bd-Brazil（Byrne等人2019；O’Hanlon等人2018）。在该地区，Bd-GPL分布广泛且地理上无规律，表明该谱系是近期引入并迅速扩散的（Jenkinson等人2016）。相比之下，Bd-Brazil表现出强烈的地理和遗传结构，表明其具有相对较长的地区性地方性历史（超过100年；Jenkinson等人2016；Rodriguez等人2014）。这种历史性的地方性可能使得病原体通过与巴西两栖动物的共同进化而减弱毒性，或者，较低的毒性可能是Bd-Brazil的原始状态（Belasen等人2022；Jenkinson等人2016；Rodriguez等人2014）。这种较低的毒性表型在两项针对巴西Brachycephalus属青蛙的独立实验室研究中得到了证实，其中Bd-GPL感染导致的Bd负荷更高，宿主死亡率也更高（Greenspan等人2018；McDonald等人2023）。鉴于Bd-Brazil似乎一直存在于大西洋森林中，并且通常与较低的宿主死亡率相关，大多数证据表明1970年代和1980年代记录的两栖动物死亡事件是由Bd-GPL引起的（Carvalho等人2017；Eterovick等人2005；Heyer等人1988；Rosenblum等人2013；Toledo等人2023；Weygoldt 1989）。巴西的病原体动态因在野外发现重组杂交Bd谱系而变得更加复杂，因为之前认为Bd是严格无性的（Jenkinson等人2016；Nieuwenhuis和James 2016；Rosenblum等人2013；Schloegel等人2012）。Bd-GPL和Bd-Brazil的杂交体在本地宿主（如Brachycephalus rotenbergae）上的毒性高于任一亲本谱系（Greenspan等人2018）。有趣的是，尽管Bd-GPL在共感染中往往优于Bd-Brazil，但Bd-Brazil仍能在大西洋森林的大部分地区持续存在（Carvalho等人2023；Jenkinson等人2018）。这引发了关于Bd-Brazil如何在其相对于Bd-GPL的明显竞争劣势下持续存在的问题。Byrne等人（2022）的最新研究表明，某些Bd亚谱系可能优先感染某些北美宿主物种，包括Rana catesbeiana，这种青蛙被引入了美国西部和巴西（Lever 2003；Schloegel等人2012）。Bd基因型的宿主特异性可能对巴西大西洋森林中两栖动物物种丰富的环境中Bd的动态有重要影响，因为不同谱系可能在宿主物种间分离，从而减少竞争并使竞争力较弱的谱系（如Bd-Brazil）得以持续存在。当地的两栖动物群体包括直接在陆地上发育和在水生环境中发育的物种，它们占据多种栖息地，如溪流、池塘、树木和森林地面（Haddad等人2013）。这种多样性为测试某些Bd谱系与宿主物种、发育模式和偏好栖息地类型之间的关联提供了机会。尽管进行了大量研究，但塑造Bd-GPL、Bd-Brazil及其杂交体在这一多样化两栖动物群体中分布和持续存在的生态和进化因素仍知之甚少。在这里，我们预测Bd谱系将与某些宿主属、发育模式和栖息地类型存在非随机关联。为此，我们在两年时间内每月两次对巴西圣保罗州的一个两栖动物群体进行了采样。我们收集了3000多个皮肤拭子样本，对水生和陆地栖息地中的14对样带进行了Bd检测和定量。对于检测出Bd阳性的样本子集，我们使用了基于核基因和线粒体单核苷酸多态性（SNP）的检测方法，这些方法可以区分Bd-GPL、Bd-Brazil、杂交体和共感染情况（Carvalho等人2023；Jenkinson等人2018）。我们的研究为高度多样化的热带两栖动物群体中的宿主特异性和Bd基因型更替提供了新的见解，对理解大西洋森林中的病原体持续存在、杂交和两栖动物保护具有重要意义。

**2 材料与方法**

**2.1 研究地点和重点两栖动物物种**

所有样本均采集于2020年12月至2023年1月期间，位于巴西圣保罗州Serra do Mar州立公园—Núcleo Santa Virgínia的连续大西洋森林内。该地区由原始和次生热带沿海山地森林组成，至少包含44种青蛙（Gilbert等人2025；Haddad等人2013）。大西洋森林中的两栖动物主要表现出两种发育模式：直接在陆地上发育和在水生环境中发育的幼体。Brachycephaloidea是一个包含1000多种新世界青蛙的直接发育谱系，在大西洋森林中分布广泛（Hedges等人2008；Padial等人2014）。这类青蛙在陆地上产卵，孵化成小青蛙。该地区的大多数其他属的青蛙是在水生环境中产卵的幼体发育类型（即池塘或溪流）。少数间接发育的物种，如许多Ololygon和Dendrophryniscus物种，在凤梨科植物中繁殖并产卵，幼体在那里发育。

**2.2 野外工作**

我们在一个直径15公里的区域内建立了十对100米长的样带，以尽量减少海拔对Batrachochytrium dendrobatidis感染动态的影响（Becker和Zamudio 2011）。每对样带包括一条溪流样带和一条陆地样带。溪流样带沿着每条溪流的两岸各延伸一米，陆地样带宽两米，距离水面20至50米，并与溪流样带平行（图1）。此外，我们还使用与溪流样带相同的方法对三个不同的池塘中的两栖动物进行了采样。不同的样带对平均相隔一公里，海拔高度在901至1012米之间。由于一些青蛙是昼行性的，而另一些是夜行性的，我们在白天和晚上都进行了调查，以确保对两栖动物群体的全面代表。我们每对样带进行了为期三天的连续调查。由于后勤限制，有些样带对在每次调查中只能采样一次。

**2.3 样品处理**

**2.3.1 DNA提取**

我们使用GMax Mini Genomic DNA试剂盒（IBI Scientific）提取DNA，并对试剂盒的方案进行了轻微修改。我们将拭子在60°C下用Proteinase K孵育过夜以增加DNA产量（Caligiuri等人2019）。我们每天随机选择样本进行提取，以减少基于样本采集日期的偏差，并在每次提取时包括一个空白对照样本。

**2.3.2 Batrachochytrium dendrobatidis定量**

为了从提取的DNA中定量Bd，我们使用了含有Bd特异性引物的qPCR检测方法（Boyle等人2004）和稀释至10^6至10^0 ITS（内部转录间隔区1）基因拷贝的合成Bd标准品（Pisces Molecular）。我们还使用了TaqMan外源性内部阳性对照试剂（IPCs）来检测PCR抑制并减少假阴性的发生。每个反应包含12.5 μL Sensi-Fast Lo-ROX主混合物（Meridian Bioscience）、1.13 μL 20 μM ITS1-3引物（CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC）、1.13 μL 20 μM 5.8S Chytr引物（AGCCAAGAGATCCGTTGTCAAA）、1.2 μL 5 μM Chytr MGB2探针（FAM标记）、1 μL 100× BSA、0.83 μL 10× Exo-IPC混合物（VIC标记）、0.17 μL Exo-IPC DNA和2.04 μL无核酸酶的水，总体积为每孔25 μL。我们在QuantStudio 3仪器上进行了单次qPCR实验，程序如下：首先在50°C下加热2分钟，然后在95°C下加热10分钟，接着进行50个循环，每个循环15秒在95°C和1分钟在60°C。每个孔中都包含一个阴性qPCR对照孔，这些对照孔均未扩增。如果某个孔的IPC未扩增，我们会对该样本重复qPCR实验。为了计算整个拭子上的Bd载量，我们将载量乘以20，然后加上1，并对计数结果进行log10转换，以纠正下游分析中非正态的残差分布。关于Bd流行率和载量与繁殖方式、栖息地类型和降水量的详细分析，可以在Gilbert等人（2025年）的研究中找到。

2.3.3 Batrachochytrium dendrobatidis基因分型
我们尝试对来自19个不同蛙属和36个物种的777个Bd阳性的两栖动物皮肤拭子样本进行基因分型。其中一些Bd阳性样本剩余的DNA太少，无法进行基因分型，因此没有被包括在内。为了区分Bd-Brazil、Bd-GPL、共感染和混合谱系，我们使用了两种基于qPCR的SNP检测方法。第一种检测方法（BdSC9_621917）针对一个核标记物，由Carvalho等人（2023年）开发并使用。第二种检测方法（Bdmt_26360）由Jenkinson等人（2018年）开发，针对一个线粒体标记物。这种方法可以识别共感染，因为任何单一的Bd基因型应该只具有一个线粒体基因型。两种检测方法都使用相同的试剂配方：5.0 μL的TaqMan Fast Advanced Master Mix（ThermoFisher），0.5 μL的20X检测液（每种探针4 μM，每种引物18 μM），2.0 μL的无核酸酶水，以及2.5 μL的模板DNA，每个孔总共10 μL。样本在QuantStudio 5仪器上的384孔板中进行检测，使用以下循环程序：60°C加热30秒，95°C加热20秒，然后进行50个循环，每个循环95°C加热1秒和60°C加热20秒，最后60°C加热30秒。每个板至少包含研究中每个代表性Bd谱系的一个孔：Bd-GPL（NAF-01）、一个混合菌株（CLFT-024-2）和Bd-Brazil（BAF-038）。每个板还包含一个野外对照拭子和一个qPCR对照，这些都没有扩增。我们通过分析每个样本中的核SNP和线粒体SNP的组合来推断Bd谱系。在核检测中，等位基因A表示Bd-GPL，而等位基因C表示Bd-Brazil。由于Bd的线粒体是单亲遗传的（Ghosh等人2021年；Jenkinson等人2018年），如果检测到多个线粒体SNP，则可以区分共感染和混合谱系。因此，即使没有核SNP的结果，也可以确定样本存在Bd-GPL和Bd-Brazil的混合感染（图2）。

2.4 统计分析
我们使用R版本4.3.0（R Development Core Team 2023）进行了所有统计分析。为了可视化不同样带之间两栖动物物种组成的差异，我们使用捕获率来估计局部蛙类物种组成。我们过滤了遭遇数据，只包括每个调查活动中被采样三次的样带对，以控制采样努力。然后，我们按样带对ID、样带类型（即陆地或水生）和采样活动对数据进行了分组，并使用vegan包中的vegdist函数计算了基于存在-缺失的Jaccard距离度量（Oksanen等人2020年）。接下来，我们使用adonis2函数对差异矩阵进行了排列多元方差分析（PERMANOVA），并使用betadisper函数比较了组间分散。然后，我们使用ape包（Paradis等人2024年）进行了主坐标分析（PCoA），并使用ggplot2（Wickham等人2022年）绘制了群落组成的差异。为了确定扩增效率超过75%的最小Bd载量（即基因分型可能成功的载量），我们使用逻辑回归模型来模拟扩增成功与Bd载量的关系。我们将核和线粒体检测的扩增结果分类为二元（成功=1，失败=0）。然后我们使用glm()函数为每种检测方法分别拟合了逻辑回归模型，并使用了二项链接。我们使用uniroot()函数确定了预测扩增概率为75%的Bd载量阈值。为了比较具有超过10个成功基因分型拭子的两栖动物属之间的Bd基因型比例差异（即Brachycephalus、Ischnocnema、Dendrophryniscus、Ololygon、Dendropsophus、Aplastodiscus、Bokermannohyla、Boana和Hylodes），我们对每个属对进行了成对卡方检验。最后，为了在控制每个样带/调查活动中两栖动物物种组成差异的情况下（通过Jaccard PCoA轴1捕获），我们使用glmmTMB包（Brooks等人2017年）运行了二元广义线性混合模型（GLMMs）。模型公式如下：is_GPL ~ PCoA1_Jac + transect_type + developmental_mode + (1|transect_id) + (1|genus)，其中响应变量is_GPL是一个二元指标，表示样本是否代表单谱系的Bd-GPL感染。我们还运行了两个额外的模型，以is_Brazil和is_Coinfection作为响应变量。我们使用DHARMa包（Hartig和Lohse 2022年）模拟了模型残差并检查了假设。

3 结果
3.1 两栖动物群落组成
蛙类物种组成因样带类型（p < 0.001）、样带对ID（p < 0.001）以及样带类型和样带对ID之间的交互作用（p < 0.001；图3；表A2）而异。不同样带对之间的蛙类物种组成差异显著（Pseudo-F = 5.476，R2 = 0.218，p < 0.001），不同样带类型之间的物种组成差异也显著（Pseudo-F = 28.072，R2 = 0.216，p < 0.001）。图3显示了使用Jaccard距离和80%置信椭圆的巴西圣保罗Serra do Mar州立公园—Núcleo Santa Virgínia的两栖动物物种组成的主坐标分析。只显示了采样努力均匀的样带。我们使用qPCR量化了总共3404个样本的Bd载量（表A3）。Bd载量范围从零到4.06 × 10^7 ITS基因拷贝。总体Bd流行率为23%，平均感染强度为3.19 × 10^5 ITS拷贝。

3.2 Batrachochytrium dendrobatidis基因分型
用于基因分型的拭子样本中的Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）载量范围从1到8.03 × 10^7 ITS拷贝。我们使用核检测成功地对274个样本进行了基因分型（效率=35.2%），使用线粒体检测成功地对382个样本进行了基因分型（效率=49.1%）。153个样本的检测结果不确定，因此被排除在下游分析之外。252个样本中存在的Bd谱系可以明确区分（总体成功率为32.4%）。核检测（Student's t检验：t = -31.208，df = 775，p < 0.001）和线粒体检测（t = -25.983，df = 775，p < 0.001）的扩增成功与较高的Bd载量相关（图4）。核检测的扩增效率超过75%的最小Bd载量约为1.34 × 10^4 ITS拷贝，线粒体检测的最低Bd载量为3.86 × 10^3 ITS拷贝。图A1显示了按谱系划分的Bd载量（ITS拷贝数）。图4显示了使用核和线粒体SNP检测未成功和成功扩增的样本之间Bd载量的分布情况。Bd载量较高的样本更有可能在两种检测中都获得成功扩增（p < 0.001）。我们检测到某些属之间Bd基因型分布的统计显著差异（图5）。与Aplastodiscus、Bokermannohyla、Brachycephalus、Dendropsophus、Ischnocnema和Ololygon相比，Hylodes的共感染可能性更高（图5）。Boana的共感染可能性也显著高于Ischnocnema（图5）。即使只考虑在水生样带上捕获的青蛙，这些结果仍然成立，除了Hylodes和Brachycephalus之间的显著差异，因为我们的样本量不足（n = 4；图A2）。图A3显示了每个属在水生和陆地样带上捕获的青蛙数量。图A4显示了所有物种的Bd谱系检测结果。图5显示了具有超过10个成功基因分型拭子的属中分配给每个Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）谱系的拭子比例。图A3中的条形图按繁殖方式对属进行了着色（棕色：陆地直接发育，绿色：植被中的幼体发育，蓝色：水生栖息地中的幼体发育）。每个属的样本数量以白色显示。Bd谱系计数的显著（p < 0.05）成对卡方比较：Aplastodiscus与Hylodes（χ2 = 10.519，p = 0.015），Boana与Ischnocnema（χ2 = 10.099，p = 0.018），Bokermannohyla与Hylodes（χ2 = 13.597，p = 0.004），Brachycephalus与Hylodes（χ2 = 10.745，p = 0.013），Dendropsophus与Hylodes（χ2 = 14.493，p = 0.002），Ischnocnema与Hylodes（χ2 = 24.600，p < 0.001）。在陆地样带上捕获的两栖动物几乎都携带Bd-GPL（图6）。即使将样带的两栖动物物种组成和宿主属作为随机效应纳入GLMM（表A4），样带类型也是预测Bd-GPL是否是唯一检测到的谱系的显著预测因子。发育模式不是单谱系Bd-GPL感染概率的显著预测因子（表A4）。没有变量显著预测单谱系Bd-Brazil感染（表A5）或共感染（表A6）的存在。

4 讨论
我们的结果表明，在巴西大西洋森林的关注地点，Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）谱系的分布与宿主属和栖息地类型非随机相关。我们发现Bd谱系分布在流栖属Hylodes与本研究检查的大多数其他两栖动物属之间存在显著差异。具体来说，Hylodes与Bd-GPL和Bd-Brazil的共感染率显著高于Aplastodiscus、Bokermannohyla、Brachycephalus、Dendropsophus、Ischnocnema和Ololygon。我们在陆地和水生样带之间观察到了Bd谱系分布的显著模式，其中在陆地样带上捕获的两栖动物几乎都只有单谱系的Bd-GPL感染。即使考虑了两栖动物物种组成和宿主属，我们的模型也支持这一模式，这表明水生栖息地可能在这个群落中容纳了更多的Bd谱系。流栖两栖动物在巴西及更广泛的地区经历了严重的数量下降，这可能是由于它们生活在有利于Bd生长和长时间接触水生游动孢子的凉爽湿润栖息地中（Becker和Zamudio 2011；Carvalho等人2017）。这一模式解释了我们的发现，即Hylodes这一喜欢流动水的属，其蝌蚪在溪流水中发育，成年雄性会保卫溪流领地（Heyer等人1990），表现出最高的共感染率，因此成为Bd谱系多样性的储存库。这种与溪流的终生关联促进了它们持续暴露于多种谱系的游动孢子。然而，我们的数据无法区分像Hylodes这样的流栖蛙类的属特异性效应和栖息地特化，因为我们缺乏来自其他流栖属的足够重复数据以及其他地区的样本。

我们的结果表明，在巴西大西洋森林的关注地点，Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）谱系的分布与宿主属和栖息地类型非随机相关。我们发现Hylodes属与大多数其他两栖动物属相比，与Bd-GPL和Bd-Brazil的共感染率显著不同。特别是在陆地和水生样带之间，陆地样带上捕获的两栖动物几乎都只有单谱系的Bd-GPL感染。我们的模型支持这一模式，即使考虑了两栖动物物种组成和宿主属，这表明水生栖息地可能在这个群落中容纳了更多的Bd谱系。与溪流相关的两栖动物在巴西及更广泛的地区经历了严重的数量下降，这可能是由于它们生活在有利于Bd生长的凉爽湿润栖息地中，并且与水生游动孢子有长时间接触（Becker和Zamudio 2011；Carvalho等人2017）。Hylodes是一种喜欢流动水的属，其蝌蚪在溪流水中发育，成年雄性会保卫溪流领地（Heyer等人1990），它们表现出最高的共感染率，因此成为Bd谱系多样性的储存库。这种与溪流的终生关联促进了它们持续暴露于多种谱系的游动孢子。然而，我们的数据无法区分像Hylodes这样的流栖蛙类的属特异性效应和栖息地特化，因为我们缺乏来自其他流栖属的足够重复数据以及其他地区的样本。树蛙属Boana也表现出高频率的共感染。Boana faber是我们在这个属中代表最丰富的物种，是一种大型池塘繁殖的青蛙，季节性地与水相关，但在繁殖季节后会迁移到周围环境中。然而，在它们在更陆地化的栖息地中度过的时间里，B. faber经常栖息在凤梨科植物中（Neely等人2023）。这种行为可能导致像Ololygon和Dendrophryniscus这样的凤梨科植物繁殖的青蛙接触到池塘和溪流中的Bd谱系。物种对某些Bd谱系的易感性的未测量差异也可能影响了我们观察到的感染模式。由于MHC多样性（Savage和Zamudio 2011）、抗菌肽产生（Rollins-Smith 2023）和皮肤微生物组（Muletz-Wolz等人2017；Rebollar等人2020）的差异，宿主免疫反应的异质性可能导致不同蛙类对某些Bd谱系的反应不同。已知Bd谱系在耐热性上存在差异（Muletz-Wolz等人2019；Sheets等人2021；Voyles等人2017），但关于耐干燥性的差异知之甚少。目前的研究表明，水生栖息地与更高的Bd谱系多样性之间存在强烈关联，这表明水生环境可能是Bd-Brazil与Bd-GPL共存的避难所。这一模式提出了一个假设，即Bd-GPL可能更耐干燥，尽管其他解释包括陆地与水生青蛙群落之间宿主易感性和行为的差异，或谱系入侵途径的历史变化。比较不同Bd谱系对干燥抵抗力的实验测试可能是理解这里发现的关键，以及这是否是一个特定地点的现象或普遍现象。根据我们的结果，谱系竞争可能主要发生在水生青蛙上。与水的频繁接触可能会增加游动孢子从孢子囊释放后的运动能力，使它们能够在远离原始感染部位的宿主皮肤上重新感染（Berger等人2005）。这些条件也可能为不同谱系之间的重组提供充足的机会，当感染将多种基因型紧密接触时，允许进行类生殖或有性生殖，并可能导致高毒力杂交谱系的出现（Nieuwenhuis和James 2016；Samarasinghe等人2020）。此外，最近的证据表明，许多谱系的分化早于已记录的两栖动物数量下降（O'Hanlon等人2018），因此病原体特征的差异以及全球环境因素（即栖息地改变和气候变化）和复杂的入侵历史（即多次引入）可能是导致数量下降的重要但尚未被探索的因素。在解释我们的结果时，必须考虑几个方法学上的限制。首先，我们检测到的Bd谱系可能偏向于那些通常产生较高感染负荷的谱系（Bd-GPL；Jenkinson等人2018；McDonald等人2023），因为我们的分析显示基因分型成功率受到Bd负荷的强烈影响。其次，我们的基因分型方法旨在降低成本，使我们能够处理近800个样本，但牺牲了遗传分辨率。使用两种SNP检测方法无法提供足够的分辨率来区分可能存在的所有基因型。需要注意的是，这种方法无法可靠地检测潜在的F2杂交体、回交体或其他Bd谱系的杂交体，这需要更全面的基因组特征分析，如Bd捕获或全基因组测序方法（Byrne等人2017；Mulder等人2024；Rosenblum等人2013）。这种隐性的遗传多样性可能会影响我们观察到的模式，特别是在圣保罗州的杂交区域（Carvalho等人2023）。此外，我们不能排除水中的自由生活游动孢子的环境DNA可能有助于在水生青蛙中检测到多个谱系的可能性，尽管在擦拭动物之前冲洗它们应该可以减少这种误差来源的概率。总之，我们的研究表明，在一个高度多样化的热带两栖动物群落中，Bd谱系的分布可能受到宿主分类和栖息地使用的共同影响，这对理解在巴西较不具竞争力的Bd谱系的持续存在以及杂交体的出现具有重要意义。栖息在溪流中的青蛙，特别是Hylodes属的青蛙，似乎在维持地方性和入侵性病原体基因型方面起着关键作用，并可能促进谱系之间的重组。我们的研究提供了关于南美洲两种重要Bd谱系的宿主/栖息地特异性和时空动态的宝贵数据。未来的研究将从在更多地点采样和采用更高分辨率的基因分型或测序方法中受益，以揭示个体两栖动物上Bd的完整基因组多样性。这些方法可能允许更精确地识别多代杂交体和特定谱系的适应性，这些适应性可能影响宿主特异性和栖息地关联。理解这些多方面的宿主-病原体动态对于预测受到壶菌病威胁的多样化两栖动物群落中的病原体持续存在和疾病结果至关重要。

作者贡献：
Shannon Buttimer：概念化（平等），数据管理（平等），正式分析（主导），调查（平等），方法学（平等），可视化（主导），写作——初稿（主导），写作——审阅和编辑（平等）。
Wesley J. Neely：正式分析（平等），调查（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
Jack M. Boyette：正式分析（平等），调查（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
Carolina Lambertini：调查（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
Renato Martins：调查（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
Karen A. Paniagua Torres：调查（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
David Rodriguez：方法学（平等），资源（平等），监督（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
C. Guilherme Becker：概念化（平等），资金获取（主导），方法学（平等），项目管理（主导），资源（平等），监督（主导），写作——初稿（支持），写作——审阅和编辑（平等）。

致谢：
感谢Parque Estadual Serra do Mar—Núcleo Santa Virgínia和Funda??o Florestal的工作人员和管理人员在后勤支持和使用公园方面的帮助。感谢所有协助野外工作的人，包括Vanessa Marshall和Ross Whetstone。感谢Veronica Saenz在实验室工作方面的帮助。资金由美国国家科学基金会对C.G.B.提供的资助（DEB-2227340, DEB-2413542, BII-2120084）。研究许可由SISBIO-Brasil（#74576-6）、SISGEN（#AC2FB2, #AC88222）、Funda??o Florestal do Estado de S?o Paulo（IF.003838/2020-26）和CEUA（#01/2020, #08/2021）提供。

这项工作得到了美国国家科学基金会的支持（BII-2120084, DEB-2227340, DEB-2413542）。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

附录A

表A1. 每次采样活动中遇到的青蛙数量总结。
| 活动 | 季节 | 日期范围 | 样本数量 |
|------|------|--------|---------|
| 1 | 湿季 | 2020年12月2日至12月15日 | 224 |
| 2 | 湿季 | 2021年2月10日至2月20日 | 203 |
| 3 | 干季 | 2021年6月17日至6月20日 | 86 |
| 4 | 干季 | 2021年7月27日至8月6日 | 198 |
| 5 | 干季 | 2021年9月13日至9月27日 | 579 |
| 6 | 湿季 | 2021年10月11日至12月4日 | 586 |
| 7 | 湿季 | 2022年2月11日至2月22日 | 332 |
| 8 | 干季 | 2022年5月3日至5月13日 | 316 |
| 9 | 干季 | 2022年7月10日至7月29日 | 305 |
| 10 | 湿季 | 2022年10月12日至11月26日 | 543 |
| 11 | 湿季 | 2023年1月10日至1月21日 | 464 |

表A2. 使用Jaccard距离的PERMANOVAs比较不同样带对ID和样带类型的青蛙物种组成。
| 解释变量 | Pseudo-F | R | p |
|--------|--------|---------|---------|
| Jaccard | 6.947 | 0.202 | <0.001 |
| 样带对ID | 22.077 | 0.128 | <0.001 |
| 样带类型 | 4.694 | 0.136 | <0.001 |
| 样带对ID × 样带类型 | 4.694 | 0.136 | <0.001 |

注：加粗的值具有统计学意义（p < 0.05）。

表A3. 巴西圣保罗每个采样两栖动物物种的Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）流行率和感染强度。
| 样本数量 | 感染数量 | 平均Bd流行率（95% CI） | 平均Bd感染强度（95% CI） |
|--------|---------|-----------------|-----------------|
| Adenomera marmorata | 3 | 0.00 (0.00, 0.69) | — |
| Aplastodiscus albosignatus | 8 | 4 | 0.50 (0.22, 0.78) | 6.2 × 10^3 (0, 1.7 × 10^4) |
| Aplastodiscus arildae | 34 | 13 | 0.38 (0.23, 0.56) | 6.2 × 10^5 (0, 1.9 × 10^6) |
| Aplastodiscus leucopygius | 33 | 12 | 0.36 (0.21, 0.55) | 1.8 × 10^4 (0, 3.7 × 10^4) |
| Boana bandeirantes | 82 | 25 | 0.30 (0.21, 0.42) | 2.6 × 10^4 (0, 6.0 × 10^4) |
| Boana faber | 49 | 27 | 0.55 (0.40, 0.69) | 1.6 × 10^5 (0, 3.5 × 10^5) |
| Boana pardalis | 3 | 2 | 0.67 (0.13, 0.98) | 7.0 × 10^6 (0, 9.4 × 10^7) |
| Bokermannohyla circumdata | 48 | 16 | 0.33 (0.21, 0.49) | 2.3 × 10^4 (0, 5.6 × 10^4) |
| Bokermannohyla hylax | 116 | 37 | 0.32 (0.24, 0.41) | 2.1 × 10^5 (0, 5.0 × 10^5) |
| Brachycephalus pitanga | 1512 | 170 | 0.11 (0.10, 0.13) | 5.8 × 10^5 (0, 1.5 × 10^6) |
| Cycloramphus sp. | 10 | 5 | 0.50 (0.24, 0.76) | 8.1 × 10^3 (0, 2.2 × 10^4) |
| Dendrophryniscus haddadi | 278 | 38 | 0.14 (0.10, 0.18) | 7.6 × 10^4 (4.7 × 10^3, 1.5 × 10^3) |
| Dendropsophus elegans | 5 | 1 | 0.20 (0.01, 0.70) | 9.2 × 10^2 |
| Dendropsophus microps | 62 | 26 | 0.42 (0.30, 0.55) | 2.8 × 10^4 (0, 6.0 × 10^4) |
| Dendropsophus minutus | 70 | 31 | 0.44 (0.33, 0.57) | 6.6 × 10^4 (0, 1.4 × 10^5) |
| Dendropsophus seniculus | 1 | 0 | 0.00 (0.00, 0.95) | — |
| Fritziana fissilis | 6 | 0 | 0.00 (0.00, 0.48) | — |
| Fritziana ohausi | 5 | 3 | 0.60 (0.17, 0.93) | 1.5 × 10^3 (0, 7.9 × 10^3) |
| Haddadus binotatus | 25 | 4 | 0.16 (0.05, 0.37) | 2.6 × 10^5 (0, 5.4 × 10^5) |
| Hylodes asper | 9 | 6 | 0.67 (0.31, 0.91) | 8.5 × 10^3 (0, 2.6 × 10^4) |
| Hylodes phyllodes | 169 | 69 | 0.41 (0.33, 0.49) | 6.8 × 10^4 (0, 1.4 × 10^5) |
| Ischnocnema henselii | 232 | 95 | 0.41 (0.35, 0.48) | 8.6 × 10^5 (0, 1.8 × 10^6) |
| Ischnocnema nigriventris | 8 | 1 | 0.13 (0.01, 0.53) | 3.3 × 10^6 |
| Ischnocnema parva | 86 | 12 | 0.14 (0.08, 0.23) | 3.3 × 10^2 (0, 8.4 × 10^2) |
| Ischnocnema aff. lactea | 1 | 0 | 0.00 (0.00, 0.95) | — |
| Leptodactylus paranaru | 9 | 7 | 0.78 (0.40, 0.96) | 3.7 × 10^4 (0, 1.1 × 10^5) |
| Ololygon aff. brieni | 90 | 34 | 0.38 (0.28, 0.49) | 1.7 × 10^4 (1.4 × 10^3, 3.3 × 10^4) |
| Ololygon aff. littoralis | 8 | 2 | 0.25 (0.04, 0.64) | 6.7 × 10^2 (0, 6.6 × 10^3) |
| Ololygon flavoguttata | 69 | 35 | 0.51 (0.39, 0.63) | 2.5 × 10^5 (0, 5.3 × 10^5) |
| Ololygon perpusilla | 76 | 26 | 0.34 (0.24, 0.46) | 1.1 × 10^5 (0, 2.6 × 10^5) |
| Phrynomedusa dryade | 19 | 14 | 0.74 (0.49, 0.90) | 4.7 × 10^4 (0, 1.0 × 10^5) |
| Physalaemus cuvieri | 1 | 1 | 1.00 (0.05, 1.00) | 2.1 × 10^3 |
| Physalaemus olfersii | 29 | 8 | 0.28 (0.13, 0.47) | 3.4 × 10^5 (0, 8.7 × 10^5) |
| Proceratophrys belzebul | 2 | 0 | 0.00 (0.00, 0.80) | — |
| Proceratophrys boiei | 92 | 17 | 0.18 (0.11, 0.28) | 3.2 × 10^3 (0, 7.1 × 10^3) |
| Rhinella icterica | 55 | 15 | 0.27 (0.17, 0.41) | 3.6 × 10^3 (0, 8.3 × 10^3) |
| Rhinella ornata | 9 | 3 | 0.33 (0.09, 0.69) | 4.8 × 10^3 (0, 1.2 × 10^4) |
| Scinax crospedospilus | 4 | 1 | 0.25 (0.01, 0.78) | 2.8 × 10^6 |
| Scinax fuscovarius | 1 | 1 | 1.00 (0.05, 1.00) | 1.6 × 10^2 |
| Scinax hayii | 45 | 15 | 0.33 (0.20, 0.49) | 2.1 × 10^3 (7.8 × 10^3) |
| Trachycephalus imitatrix | 1 | 0 | 0.00 (0.00, 0.95) | — |
| Vitreorana parvula | 39 | 5 | 0.13 (0.05, 0.28) | 5.5 × 10^2 (0, 1.4 × 10^3) |
| 总计 | | 3404 | 0.23 (0.22, 0.24) | 3.2 × 10^5 (8.5 × 10^4, 5.5 × 10^5) |

注：Bd感染强度以每个拭子上的ITS拷贝数表示。对于阳性拭子少于两个的物种，未显示平均Bd感染强度的置信区间（CI）。加粗的值具有统计学意义（p < 0.05）。

表A4. 二项式广义线性混合模型预测单一谱系Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）-GPL感染的结果。
| 解释变量 | 估计值 | Z | p |
|--------|---------|---------|---------|
| Bd-GPL存在/不存在 | -1.078 | -0.937 | 0.3489 |
| 样带类型（水生） | -1.716 | -1.963 | 0.0497 |
| 发育模式（陆生） | 0.585 | 0.666 | 0.5051 |

注：固定效应包括物种组成（Jaccard PCoA轴1）和样带类型。样带对ID和宿主属作为随机效应包括在内。加粗的值具有统计学意义（p < 0.05）。

表A5. 二项式广义线性混合模型预测单一谱系Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）-Brazil感染的结果。
| 解释变量 | 估计值 | Z | p |
|--------|---------|---------|---------|
| Bd-Brazil存在/不存在 | 2.187 | 1.823 | 0.0682 |
| 样带类型（水生） | 22.926 | 0.001 | 0.9994 |
| 发育模式（陆生） | -0.307 | -0.477 | 0.6333 |

注：固定效应包括物种组成（Jaccard PCoA轴1）和样带类型。样带对ID和宿主属作为随机效应包括在内。

图A1：显示在成功基因分型的拭子上检测到的Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）ITS基因拷贝数量的箱形图。请注意，不同Bd谱系之间的ITS拷贝数可能存在显著差异（Longo等人2013；Rebollar等人2017）。

图A2：堆叠条形图显示仅在水生样带上发现的青蛙中分配给每个Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）谱系的样本比例。属名按繁殖模式着色（棕色：陆生直接发育，绿色：植被中的幼虫发育，蓝色：水生栖息地中的幼虫发育）。每个属的样本数量以白色显示。Bd谱系计数的显著（p < 0.05）成对卡方比较：Aplastodiscus与Hylodes（χ2 = 9.791, p = 0.007），Boana与Ischnocnema（χ2 = 8.254, p = 0.041），Bokermannohyla与Hylodes（χ2 = 12.679, p = 0.002），Dendropsophus与Hylodes（χ2 = 13.650, p = 0.001），Ischnocnema与Hylodes（χ2 = 20.322, p < 0.001），Hylodes与Ololygon（χ2 = 8.696, p = 0.013）。

图A3：堆叠条形图显示在每个样带类型上捕获的青蛙数量，这些青蛙来自具有n = 10个或更多成功基因分型拭子的属。属名按繁殖模式着色（棕色：陆生直接发育，绿色：植被中的幼虫发育，蓝色：水生栖息地中的幼虫发育）。

图A4：堆叠条形图显示所有青蛙物种及其分配的Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）基因型的数量。属名按繁殖模式着色（棕色：陆生直接发育，绿色：植被中的幼虫发育，蓝色：水生栖息地中的幼虫发育）。

数据可用性声明：
支持本研究发现的数据和代码可在Figshare上公开获取（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29695307）。