蝾螈的皮肤颜色受表转录组甲基化和基因表达的共同调控

《Molecular Ecology》：Skin Colour in Salamanders Is Modulated by Both Epitranscriptomic Methylation and Gene Expression

　　**摘要**

动物体色是生物学中的一个关键特征，它参与了自然选择、性选择、竞争和交流过程。两栖动物在其多种生态互动中利用了高度多样化的体色，但它们的颜色变异的分子基础相比其他脊椎动物系统来说了解得较少。尽管在多种模型中，色素沉着的遗传、结构和细胞基础越来越被理解，然而潜在的表观遗传或表观转录组效应几乎尚未被探索。火蝾螈（Salamandra salamandra）具有显著的体色模式和多态性，但由于蝾螈的基因组规模极大，传统的遗传分析方法难以应用。为了发现决定蝾螈颜色差异的位点和分子机制，我们使用了长读长直接RNA测序技术来研究RNA甲基化、基因表达及其在个体内部和个体间颜色变异中的作用。在所有成对比较中，我们发现了129个差异表达基因和281个差异甲基化基因。许多相关基因与色素沉着有关，其中一些基因直接参与黑色素的产生，如Melan-A（MLANA）、前黑色素体蛋白（PMEL）、酪氨酸酶（TYR）和酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）。我们发现差异甲基化和差异表达的转录本之间存在正相关性和显著的重叠。这些发现表明，包括基因表达和RNA甲基化在内的多种分子机制共同促进了两栖动物的颜色多样性。RNA修饰为理解非模式动物的形态变异及其对生态学的影响提供了一个有前景的研究方向。

**1 引言**

动物体色是生物学中的一个关键特征，它参与了自然选择、性选择、生态竞争和交流等过程（Caro和Mallarino 2020；Endler和Mappes 2017；Hutton等人2015；Orteu和Jiggins 2020；Rudh和Qvarnstr?m 2013），使研究人员能够探讨各种进化和生态学问题。通过使用小鼠（Kingsley等人2009；Wooldridge等人2022）、人类（Sturm等人1998）和斑马鱼（Kelsh 2004）等模式系统，我们已经对体色的遗传学有了很多了解。已经确定了多种影响体色的遗传机制，包括单基因位点变化、多基因适应、超级基因和基因表达差异（Orteu和Jiggins 2020）。有趣的是，至少对于黑色素沉着现象，不同脊椎动物系统中的体色遗传学是保守的，一些基因如mc1r、PMEL和TYR在黑色素沉着中起着关键作用（Aydin等人2012；Elkin等人2023；McNamara等人2021；Monteiro等人2024；Wang等人2024）。然而，对于非模式系统中的体色遗传学研究仍有大量工作需要完成，尤其是在两栖动物方面，因为它们在色素沉着研究中代表性不足（Elkin等人2023）。两栖动物在体色上表现出显著的多样性，并在许多生态互动中利用这种多样性（Hantak和Kuchta 2018；Kuchta 2005；Lenzi-Mattos等人2005）。虽然我们知道了形成两栖动物体色的生理结构成分，但对其遗传基础的研究仍然不足（Bagnara等人1968；Goutte和Boissinot 2025；Mills和Patterson 2009；Rudh和Qvarnstr?m 2013）。两栖动物体色的变化通常归因于基因表达的变化（Kratochwil和Mallarino 2023；Orteu和Jiggins 2020；Rudh和Qvarnstr?m 2013），但由于它们的基因组规模庞大（可达约120 Gb），在分析和研究基因组适应性方面特别具有挑战性（Liedtke等人2018；Sun等人2011, 2012）。此外，两栖动物在参考基因组的可用性方面也严重不足，这使得基于参考基因组的方法对许多物种来说不可行（Hotaling等人2021；Kosch等人2024）。然而，转录组学方法为两栖动物研究提供了开发参考资源的有希望途径（Torres-Sánchez等人2025）。最近在转录组学方面的进展使研究人员能够研究表观转录组修饰（Garalde等人2018）。目前已知的RNA修饰种类超过170种（Cappannini等人2023），为探索它们在生态学和进化中的作用提供了丰富的机会。也许最常见的修饰m6A甲基化已经被证明在调节基因表达、细胞命运、mRNA翻译和降解中起着关键作用（Batista等人2014；?orovi?等人2025；Deng等人2022），并且最近的研究强调了它在疾病和生态适应等多种生物学功能中的作用（Jiang等人2021；T. Zhou等人2022）。此外，它与其他转录后修饰（如miRNA介导的基因调控和可变剪接）的相互作用突显了其在适应性特征生态学中的潜力（Ahi和Singh 2025）。更多最新证据表明，N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在色素沉着中也起着重要作用（Strowbridge等人2025；Zhao等人2023），并且可以在多种情况下影响基因表达（Xie等人2025）。在这项研究中，我们测试了m6A mRNA甲基化是否影响基因表达并有助于两栖动物的颜色多样性，特别是欧洲火蝾螈。Salamandra是一个真正的蝾螈属，包含六个物种和许多亚种，分布在整个古北界（Burgon等人2021；Gippner等人2024），以其醒目的黄黑体色而闻名（Beukema, Nicieza等人2016）。Salamandra物种和亚种在颜色和图案多态性上也表现出多样性。例如，该属内的亚种从黄色和黑色斑点或条纹到黑色素沉着不等，许多亚种还表现出不同程度的红色斑点与黑色和黄色相结合。此外，我们的模型亚种Salamandra salamandra bernardezi在种群内部表现出从祖先的黑色和黄色条纹到几乎完全黄色或完全棕色的多态性（Beukema, Nicieza等人2016；Burgon等人2020）。生态因素强烈影响了Salamandra的种内颜色多样性。火蝾螈广泛分布的黑色和黄色图案可能是通过警戒色维持的，因为它们对捕食者有毒（Beukema, Speybroeck和Velo-Antón 2016；Caspers等人2020）。局部生态条件也调节了颜色表现，例如食物可用性影响某些亚种的黄色色素沉着程度（Barzaghi等人2022）。许多物种和亚种中的红色体色反映了生态限制，如类胡萝卜素的可用性（Stuart-Fox等人2021），并且可能受到性选择的影响（Aguilar等人2023）。尽管先前的研究排除了几种关于我们模型S. s. bernardezi颜色多态性的生态假设，包括选择性交配、毒性程度和海拔适应，但几种生态过程可能有助于这种多态性的持续存在。例如，其他蝾螈类群的研究显示了与栖息地相关的选择（Fisher-Reid等人2013）和颜色形态的频率依赖性选择（Fitzpatrick等人2009）。这些生态压力共同说明了捕食者互动、资源分布和选择机制如何维持Salamandra中观察到的显著颜色变异。在我们的模型亚种S. s. bernarderzi中，对这种颜色多态性的研究表明，结构差异以及与色素相关基因（尤其是黑色素相关基因）的基因表达和选择起着作用（Burgon等人2020），但由于Salamandra的基因组规模极大（27至40 Gb，Gregory 2025），全基因组关联和相关遗传操作变得不可行。为了克服这一挑战，我们使用了Oxford Nanopore直接RNA测序（dRNAseq）来研究m6A RNA甲基化和基因表达在驱动火蝾螈（S. s. bernardezi）个体内部和个体间颜色变异中的作用，这些蝾螈表现出黑色、黄色和棕色色素沉着。为了支持这一分析，我们首先使用长读长cDNA测序生成了一个特定物种的转录组。利用这个转录组和直接RNAseq数据，我们可以同时测量甲基化和基因表达，从而评估它们对颜色变异的贡献以及它们之间的关系。

**2 方法**

**2.1 动物饲养和组织采样**

成年欧洲火蝾螈Salamandra salamandra bernadezi包括纯黄色、纯棕色和黄黑条纹形态，来自格拉斯哥大学的一个长期野外来源的圈养种群（许可EA52/25）（N = 8）或在野外机会性采样（N = 4）（许可DECO/2024/8702）。圈养个体被安置在温度（13°C–18°C）和光照控制（12–12小时光照-黑暗周期）的房间中一段时间后进行组织采样。为了避免性别效应，只包括了雌性个体。圈养的蝾螈通过英国内政部批准的Schedule 1方法使用2 g/L MS-222缓冲液（pH值约为7）进行安乐死，随后破坏大脑。对于从头转录组，从单个条纹形态的个体中采集皮肤、眼睛、心脏、肝脏和肌肉样本。组织样本立即放入Trizol中进行提取。对于基因表达和甲基化分析，从每个个体的两个标记点采集皮肤组织：一个位于蝾螈的侧面（条纹个体的黑色皮肤），另一个位于侧面条纹的正上方。每种形态包括四个个体：条纹黑色和黄色、棕色或黄色。为了收集皮肤，沿着背侧-侧面条纹进行切割，并取出一块皮肤组织，将其分成两块不同的条带（例如，条纹形态的黑色或侧面条带和黄色或背侧条带），然后放入RNAlater中或立即放入Trizol中进行提取。RNAlater样本在4°C的冰箱中保存一周，最后在提取前储存在-20°C。

**2.2 RNA提取和文库制备**

使用FastPrep-24 5G（MP-biomedicals）匀浆器在Trizol中匀浆组织，设置速度为10 m/s，匀浆时间为40秒，重复四次，每次之间休息3-5分钟并放在冰上。然后根据制造商的协议使用Purelink RNA Mini Kit通过Trizol-氯仿相分离和柱层析提取总RNA，并进行DNase处理。通过凝胶电泳和纳米滴光谱仪确定RNA的数量、纯度和完整性。之后，样品在-20°C下用3 M醋酸钠和乙醇沉淀清洗并混合，然后重新悬浮在无核酸酶的H2O中。所有测序文库的最终总RNA输入浓度由Invitrogen Qubit荧光计确定（Thermo Fisher Scientific）。对于从头转录组，所有组织分别提取并按等摩尔比例混合（每种组织2685 ng）。用于文库的总RNA输入最终浓度为200 ng。使用Nanopore Technologies PCR cDNA测序试剂盒（SQK-PCS109）按照制造商的协议制备一个文库，并在ONT MinION上使用单个流动单元（FLO-MIN106）进行测序。对于皮肤颜色转录组学，从每个标记点的多个重复样本中提取皮肤组织，并在醋酸钠中清洗以获得最终总RNA输入（RNA002：500–1500 ng；RNA004：1000–3000 ng）。RNA测序文库使用Oxford Nanopore Technologies Direct RNA Sequencing Kit（SQK-RNA002）为12个样本（每种颜色形态的2个个体和每个个体的2个标记点）或SQK-RNA004为12个样本（每种颜色形态的2个个体和每个个体的2个标记点）制备。目标组织的采样在两个试剂盒之间完全平衡。我们遵循了制造商的协议，除了将RNA校准链稀释1/10。所有SQK-RNA002文库分别使用单个流动单元（FLO-MIN106）在ONT GridION或MinION上进行测序。所有SQK-RNA004文库分别使用单个流动单元（FLO-MIN004RA）在ONT MinION上进行测序。

**2.3 转录组组装和注释**

测序后产生了1150万个读长，范围从200到78,225 bp（n50：912），原始fast5文件被转换为pod5文件，并使用Dorado v0.7.2（Vella 2022）进行碱基调用，最小Qscore为9。鉴定引物和测序适配器后，修剪读长并用Pychopper v. 2（ONT）进行定向。然后使用Kraken2（Wood等人2019）处理碱基调用数据，该软件包含细菌和病毒的定制数据库。接下来，通过将rRNA与SortMeRNA标准数据库对齐去除rRNA（使用minimap2 v2.28（Kopylova等人2012；Li 2018）。最后，使用FastQC v0.12.1（Andrew 2010）和multiQC v1.27（Ewels等人2016）对fastq文件进行质量控制。质量控制后的fastq文件使用RNAbloom2 v2.0.1（Nip等人2023）组装成转录本，所有设置均为默认值，除了k-mer长度，该长度在k-mer长度（19、25、31、41、51和61）之间进行了迭代。RNAbloom2进行了长读长错误校正、数字标准化、在低读长区域修剪和分割读长、单元igs抛光，最后使用重叠图谱组装转录本（Nip等人2023）。为了比较不同k-mer长度的组装，我们对单个组装进行了质量控制评估。首先，我们使用transrate v1.0.3（Smith-Unna等人2016），它提供了多种质量控制统计信息，如序列数量（转录本数量）、开放阅读框数量和n50等。接下来，我们使用Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs（BUSCO）v6.0.0（Tegenfeldt等人2025）根据保守的直系同源物内容（eukaryota_odb10和tetrapoda_odb10）评估组装转录组的完整性。在确定了最佳组装k-mer长度（19）之后，我们对104,780个转录本进行了最终组装，并使用了两种不同的方法进行注释。在第一种注释方法中，我们搜索了组装后的转录本中的开放阅读框，并通过TransDecoder v5.5.0（Haas 2024）预测了潜在的编码序列，从而生成了一个CDS文件。然后，该CDS文件被用作EggNOG-mapper v2.1.12（Cantalapiedra等人2021）的输入。EggNOG-mapper使用blastx模式进行蛋白质比对，设置为超灵敏度，并且采用了15的移码参数，这是针对纳米孔长读长数据推荐的设置。在第二种注释方法中，我们使用了一个名为RNAsamba v0.2.5（Camargo等人2020）的神经网络分类模型来预测组装转录本的编码潜力。预测完成后，这些编码转录本被翻译成氨基酸序列，然后再次用作EggNOG-mapper v2.1.12的输入。EggNOG-mapper同样使用blastp模式进行蛋白质比对，设置同样为超灵敏度，并采用了15的移码参数。对于那些没有通过这两种方法注释但具有差异表达和/或甲基化的转录本，我们随后使用NCBI的非冗余（nr）数据库进行了进一步的注释。

2.4 直接RNA测序的碱基调用和质量控制

原始的fast5（RNA002）和pod5（RNA004）文件首先通过slow5tools（Samarakoon等人2023）转换为slow5格式，以便更高效地处理和计算。然后使用Dorado basecaller v0.7.2（Vella 2022）对这些slow5文件进行碱基调用。碱基调用之后，使用Nanoplot v.1.19.0（De Coster和Rademakers 2023）对样本进行了质量控制。接下来，使用Minimap2 v.2.28（Li 2018）将样本与从头组装的转录组进行了比对。

2.5 直接RNA差异表达分析

比对完成后，使用Salmon v1.10.1（Patro等人2017）确定了转录本的数量，并使用了–ont标志。差异表达分析是通过R v4.3.2（R Core Team 2023）中的EdgeR v3.20（Chen等人2025）进行的，并根据sva R包v3.5.0（Zhang等人2020）中的CombatSeq进行了批次校正，以及limma R包v3.58.1（Ritchie等人2015）中的DuplicateCorrelation函数，以考虑个体内的重复实验（两个独立的标准）。由于条纹个体的黄色皮肤与纯黄色表型之间存在预期的表达差异（两个独立的标准），我们在黄色皮肤与棕色皮肤的比较中排除了条纹个体的黄色皮肤样本（见支持信息）。所有的差异表达图都是使用ggplot2 v3.5.1（Wickham 2011）创建的。图中标出的基因是通过文献搜索和国际色素细胞学会（IFPCS）的颜色基因表（https://www.ifpcs.org/colorgenes/）确定的与色素沉着直接相关的基因，该表描述了小鼠及其人类和斑马鱼中的颜色基因。

2.6 直接RNA差异甲基化

比对完成后，使用f5c v1.5（Gamaarachchi等人2020）生成了eventalign文件。接下来，使用m6anet v2.1.0（Hendra等人2022）检测了每个个体文库中的m6A甲基化情况。我们使用自定义的shell脚本生成了每个转录本的甲基化计数数据（见支持信息）。然后，使用自定义的R脚本将不同样本的甲基化结果合并在一起。最后，使用R v4.3.2（R Core Team 2023）中的EdgeR v3.20（Chen等人2025）进行了差异甲基化分析，并根据sva R包v3.5.0（Zhang等人2020）中的CombatSeq进行了批次校正，以及limma R包v3.58.1（Ritchie等人2015）中的DuplicateCorrelation函数，以考虑个体内的重复实验（两个独立的标准）。由于条纹个体的黄色皮肤与黄色表型之间存在甲基化差异（两个独立的标准），我们在黄色皮肤与棕色皮肤的比较中排除了条纹个体的黄色皮肤样本（见支持信息）。所有的差异甲基化图、表达与甲基化之间的散点图以及UpSet图都是使用ggplot2 v3.5.1（Wickham 2011）创建的。图中标出的基因是通过文献搜索确定的与色素沉着直接相关的基因，并包含在国际色素细胞学会（IFPCS）的颜色基因表（https://www.ifpcs.org/colorgenes/）中，该表描述了小鼠及其人类和斑马鱼中的颜色基因。

2.7 直接RNA差异表达与差异甲基化之间的重叠

在差异表达和差异甲基化分析之后，我们研究了这两个过程之间的重叠情况。使用ggplot2 v3.5.1，我们在R v4.3.2中绘制了所有成对比较的差异甲基化与差异表达的关系，包括条纹表型中黄色皮肤与黑色皮肤的情况，数据集包括所有转录本或仅包含表达和甲基化log2(FC)值大于1或小于-1的转录本。接下来，我们使用线性模型评估了这两个变量之间的关系（图4和S3；表S2–S4），也是在R v4.3.2中进行的。最后，我们使用Fisher的精确检验来评估显著差异表达和甲基化转录本之间的统计重叠（表S5）。

3 结果

3.1 转录组组装质量控制

通过遍历不同的k-mer长度（19、25、31、41、51和61），我们得到了包含104,780至107,943个转录本的组装结果，其中14,972至16,751个包含开放阅读框（ORFs）。组装的连续性在各种k-mer大小下都是一致的，n50值在1100至1108 bp之间（表S1）。最后，我们使用BUSCO对转录组组装的完整性进行了评估，所有k-mer长度的数据库得到了相对相似的BUSCO结果（图S5和S6）。完成评估后，我们选择了k-mer长度为19作为最终组装和后续分析的参数。这个选择基于组装的性能，它在四足动物水平上获得了最高的BUSCO分数，在真核生物水平上获得了第二高的分数。此外，它还产生了最多的预测开放阅读框（16,751个）和第二高的N50值（1107），显示出对编码序列和整体连续性的更好检测。参考转录组可在Enlighten仓库中获得（见数据可用性）。

3.2 测序统计和比对

总共准备了24个直接RNA测序文库，涵盖了三种颜色表型：黑色和黄色条纹、完全黄色和完全棕色。每个皮肤样本的测序产生了4300万个总读长（RNA002：平均=1.04 M；RNA004：2.60 M），RNA002的N50值为785 bp，RNA004的N50值为1043 bp，RNA002的中位读长质量为16.5，RNA004的中位读长质量为15.0。与从头组装的转录组的比对结果显示，RNA002的平均比对率为78.4%，RNA004的平均比对率为92.7%。

3.3 直接RNA差异表达

我们共识别出129个差异表达（DE）转录本（假发现率[FDR] < 0.1；log2[FC变化] > 1或< -1），涵盖了黄色、黑色和棕色皮肤样本的所有成对比较（n = 24，涉及12个个体）。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中，我们发现了11个DE转录本，其中7个下调转录本映射到5个基因，4个上调转录本映射到2个基因（表S6）。与其他比较相比，这个数量较少可能是因为这次比较包括了个体内和个体间的比较，即比较了4个来自条纹个体的黑色皮肤样本与12个来自条纹和完全黄色个体的黄色皮肤样本。这些基因中有一些已知与色素沉着直接相关。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中下调的5个基因中，有4个与黑色素生成有关：PMEL、TYRP1、MLANA和TYR的一个异构体（图1）。黑色素是一种已知能加深皮肤、毛发和鳞片颜色的色素（McNamara等人2021）。此外，在黄色皮肤中上调的2个基因之一，Diacylglycerol O-acyltransferase 2（DGAT2）（图1），与类胡萝卜素代谢有关（Ahi等人2020）。类胡萝卜素是许多动物（包括其他爬行动物）黄色色素形成的原因（Toews等人2017；Andrade等人2019；Recknagel等人2024）。图1在图形查看器中打开。

3.4 直接RNA差异甲基化

比对完成后，使用f5c v1.5（Gamaarachchi等人2020）生成了eventalign文件。接下来，使用m6anet v2.1.0（Hendra等人2022）检测了每个个体文库中的m6A甲基化情况。我们使用自定义的shell脚本生成了每个转录本的甲基化计数数据（见支持信息）。然后，使用自定义的R脚本将不同样本的甲基化结果合并在一起。最后，使用R v4.3.2（R Core Team 2023）中的EdgeR v3.20（Chen等人2025）进行了差异甲基化分析，并根据sva R包v3.5.0（Zhang等人2020）中的CombatSeq进行了批次校正，以及limma R包v3.58.1（Ritchie等人2015）中的DuplicateCorrelation函数，以考虑个体内的重复实验（两个独立的标准）。由于条纹个体的黄色皮肤与黄色表型之间存在甲基化差异（两个独立的标准），我们在黄色皮肤与棕色皮肤的比较中排除了条纹个体的黄色皮肤样本（见支持信息）。所有的差异甲基化图、表达与甲基化之间的散点图以及UpSet图都是使用ggplot2 v3.5.1（Wickham 2011）创建的。图中标出的基因是通过文献搜索确定的与色素沉着直接相关的基因，并包含在国际色素细胞学会（IFPCS）的颜色基因表（https://www.ifpcs.org/colorgenes/）中，该表描述了小鼠及其人类和斑马鱼中的颜色基因。

3.5 直接RNA差异表达与差异甲基化之间的重叠

在差异表达和差异甲基化分析之后，我们研究了这两个过程之间的重叠情况。使用ggplot2 v3.5.1，我们在R v4.3.2中绘制了所有成对比较的差异甲基化与差异表达的关系，包括条纹表型中黄色皮肤与黑色皮肤的情况，数据集包括所有转录本或仅包含表达和甲基化log2(FC)值大于1或小于-1的转录本的数据集。接下来，我们使用线性模型评估了这两个变量之间的关系（图4和S3；表S2–S4），也是在R v4.3.2中进行的。最后，我们使用Fisher的精确检验来评估显著差异表达和甲基化转录本之间的统计重叠（表S5）。

3.1 转录组组装质量控制

通过遍历不同的k-mer长度（19、25、31、41、51和61），我们得到了由104,780至107,943个转录本组成的组装结果，其中14,972至16,751个包含开放阅读框（ORFs）。组装的连续性在不同k-mer大小下保持一致，n50值在1100至1108 bp之间（表S1）。最后，我们使用BUSCO对转录组组装的完整性进行了评估，所有k-mer长度的数据库得到了相对相似的BUSCO结果（图S5和S6）。完成评估后，我们选择了k-mer长度为19作为最终组装和后续分析的参数。这一选择基于组装的性能，它在四足动物水平上获得了最高的BUSCO分数，在真核生物水平上获得了第二高的分数。此外，它还产生了最多的预测开放阅读框（16,751个），以及第二高的N50值（1107），表明编码序列的检测和整体连续性得到了改善。参考转录组可在Enlighten仓库中获得（见数据可用性）。

3.2 测序统计和比对

共准备了24个直接RNA测序文库，涵盖了三种颜色表型：黑色和黄色条纹、完全黄色和完全棕色。每个皮肤样本的测序产生了4300万个总读长（RNA002：平均=1.04 M；RNA004：2.60 M），RNA002的N50值为785 bp，RNA004的N50值为1043 bp，RNA002的中位读长质量为16.5，RNA004的中位读长质量为15.0。与从头组装的转录组的比对结果显示，RNA002的平均比对率为78.4%，RNA004的平均比对率为92.7%。

3.3 直接RNA差异表达

我们共识别出129个差异表达（DE）转录本（假发现率[FDR] < 0.1；log2[FC变化] > 1或< -1），涵盖了所有黄色、黑色和棕色皮肤样本的成对比较（n = 24，涉及12个个体）。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中，我们发现了11个DE转录本，其中7个下调转录本映射到5个基因，4个上调转录本映射到2个基因（表S6）。与其他比较相比，这个数量较少可能是因为这次比较包括了个体内和个体间的比较，即比较了4个来自条纹个体的黑色皮肤样本与12个来自条纹和完全黄色个体的黄色皮肤样本。这些基因中有一些已知与色素沉着直接相关。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中下调的5个基因中，有4个与黑色素生成有关：PMEL、TYRP1、MLANA和TYR的一个异构体（图1）。黑色素是一种已知能加深皮肤、毛发和鳞片颜色的色素（McNamara等人2021）。此外，在黄色皮肤中上调的2个基因之一，Diacylglycerol O-acyltransferase 2（DGAT2）（图1），与类胡萝卜素代谢有关（Ahi等人2020）。类胡萝卜素是许多动物（包括其他爬行动物）黄色色素形成的原因（Toews等人2017；Andrade等人2019；Recknagel等人2024）。图1在图形查看器中打开。

3.4 直接RNA差异甲基化

我们共识别出281个差异甲基化（DM）转录本（FDR < 0.1；log2[FC] > 1或< -1）。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中，我们发现了55个DM转录本，其中52个是低甲基化转录本，映射到47个基因，3个是高甲基化转录本，映射到3个基因（表S7）。在这次比较中，两个低甲基化基因与黑色素生成有关，包括Notch受体1（NOTCH1）和TYRP1（图2）。有趣的是，TYRP1在这次比较中也表现出差异表达（图1和图2）。图1在图形查看器中打开。

3.5 直接RNA差异m6A甲基化

我们共识别出281个差异甲基化（DM）转录本（FDR < 0.1；log2[FC] > 1或< -1）。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中，我们发现了55个DM转录本，其中52个是低甲基化转录本，映射到47个基因，3个是高甲基化转录本，映射到3个基因（表S7）。在这次比较中，两个低甲基化基因与黑色素生成有关，包括Notch受体1（NOTCH1）和TYRP1（图2）。图2在图形查看器中打开。

3.6 直接RNA差异m6A甲基化分析

我们共识别出281个差异甲基化（DM）转录本（FDR < 0.1；log2[FC] > 1或< -1）。在黄色皮肤与黑色皮肤的比较中，我们发现了55个DM转录本，其中52个是低甲基化转录本，映射到47个基因，3个是高甲基化转录本，映射到3个基因（表S7）。在这次比较中，两个低甲基化基因与黑色素生成有关，包括Notch受体1（NOTCH1）和TYRP1（图2）。图2在图形查看器中打开。

3.7 差异表达与差异m6A甲基化之间的关系

虽然基因表达和甲基化的分子机制在影响颜色表型方面通常是功能相关的，但这在研究中很少被展示（Strowbridge等人2025）。为了评估在不同成对比较中差异表达和甲基化转录本之间的重叠情况，我们检查了转录本集合之间的交集（图3）。我们发现大多数转录本是特定比较独有的，这从高集合大小和大多数成对组合中相对较低的交集大小可以看出。值得注意的是，大多数交集涉及与黑色皮肤比较共有的转录本，即“棕色与黑色甲基化”和“黄色与黑色甲基化”之间的交集（图3），表明黑色皮肤的甲基化具有一致性。有趣的是，“棕色与黑色甲基化”既有最大的集合大小也有最大的交集大小，这表明尽管棕色和黑色皮肤之间的表达差异相对较小，但甲基化在这两种相似的黑色素颜色之间的表型差异中起着重要作用。这也从该比较中差异甲基化的许多黑色素相关转录本数量上得到了证实（图2）。此外，“黄色与棕色表达”也有较大的集合大小和交集大小，表明表达差异在很大程度上导致了这种比较的结果（图1和图3）。

为了进一步探究特定转录本和基因的差异表达与差异m6A甲基化之间的关系，我们绘制了log2(FC)的图表（图4；图4中并未标记出图1和图2中的所有基因，因为一些差异表达的转录本在甲基化数据中未被检测到）。我们拟合了线性模型来比较甲基化和表达的log2倍数变化。所有三个成对比较都显示出了统计学上显著的正面关联，无论是否包括了log2(FC) < 1或> -1的转录本，这表明增加的甲基化往往伴随着表达的增加（图4和S3；表S2和S3）。这种关系的强度在完整数据集中的不同成对比较中有所不同（图4）：黄色与黑色皮肤（β = 0.122，p = 1.60 × 10^-74，R2 = 0.057），棕色与黑色皮肤（β = 0.181，p = 2.19 × 10^-141，R2 = 0.107），以及黄色与棕色皮肤（β = 0.240，p = 6.72 × 10^-157，R2 = 0.144）。此外，由于我们的研究设计，我们还可以在个体内部测试不同皮肤颜色之间的差异，即在条纹形态中的黄色与黑色（图S4；表S4），我们发现差异甲基化与转录本表达之间存在微妙但显著的正面关联（β = 0.074，p = 3.43 × 10^-24，R2 = 0.018）。尽管这些差异甲基化与基因表达之间的相关性R2值较低，但在两个维度上都显著受影响的转录本显示出一致的方向性模式：高甲基化与上调相关，低甲基化与下调相关。

散点图比较了黄色、黑色和棕色皮肤的所有成对比较中的基因表达和m6A甲基化。基因名称后的罗马数字表示异构体编号。被认为“显著”的基因在每次比较中都表现出显著的差异表达和差异甲基化，并用更深的颜色表示。散点图上标出的基因是通过文献搜索和国际色素细胞学会（IFPCS）的颜色基因表确定的，该表描述了小鼠及其人类和斑马鱼同源物的颜色基因。每个图中都包含了一条拟合的线性模型线，以说明甲基化和表达之间的总体趋势。我们还在相关性分析中检查了候选的色素基因。一些色素相关基因在基因表达和/或m6A甲基化方面都表现出上调和下调（log2[FC] > 1或< -1）。在黄色与黑色皮肤中，MLANA、PMEL和TYRP1在黄色皮肤中都表现出低甲基化和下调。然而，NOTCH1虽然表现出低甲基化，但其log2(FC)值介于-1和1之间。在棕色与黑色皮肤中，GPNMB.I、PMEL、TYR.II和TYRP1在棕色皮肤中都表现出低甲基化和下调。然而，ATOX1、ATP7A和NOTCH1虽然表现出低甲基化，但其log2(FC)值介于-1和1之间。最后，在黄色与棕色皮肤中，PMEL和MLANA表现出低甲基化和下调，而ATOX1和GPNMB.I表现出高甲基化和上调。此外，为了量化差异表达和甲基化转录本之间的重叠程度是否超出预期，我们对所有成对形态比较进行了Fisher精确检验（表S5）。在每种情况下都观察到了显著的富集现象：黄色与黑色（比值比 = 37.72，p = 0.029），棕色与黑色（比值比 = 112.47，p = 9.26 × 10^-18），以及黄色与棕色（比值比 = 37.73，p = 8.57 × 10^-16），表明具有差异甲基化的转录本也更有可能表现出差异表达。

4 讨论
在这项研究中，我们利用了一项新兴技术来同时进行表达和甲基化推断，并清楚地证明了m6A RNA甲基化与个体内部和之间的皮肤颜色有关，且有证据表明甲基化与基因表达水平呈正相关。值得注意的是，我们展示了RNA甲基化参与了两栖动物皮肤颜色变异中高度保守的黑色素生物合成途径中基因的表达，并与其相关联。几个黑色素相关基因（包括MLANA、PMEL、TYR和TYRP1等）被发现存在差异表达和/或差异甲基化。通过一个稳健的研究设计，该设计控制了个体内部和之间的颜色差异，特别是在黄色与黑色皮肤的比较中，我们清楚地证明了甲基化在两栖动物颜色中的作用及其与基因表达的关系。总的来说，我们的发现为理解动物界中观察到的颜色多样性的分子机制提供了新的见解。

4.1 甲基化在蝾螈颜色中的作用
甲基化，特别是在DNA中，已被证明在动物颜色中起作用（Strowbridge等人，2025年；Zhou等人，2021年）。RNA甲基化的理解要少得多：虽然之前的研究已经发现了家养绵羊中深色与浅色之间的m6A RNA甲基化差异（Zhao等人，2023年），但很少有研究显示m6A甲基化直接影响野生或非模式动物的颜色（Strowbridge等人，2025年）。我们的结果清楚地表明，几个与色素生成相关的基因在欧洲火蝾螈的不同颜色形态中存在差异甲基化。我们发现了直接位于黑色素生物合成途径中的位点的RNA甲基化证据。例如，PMEL、TYR和TYRP1等基因在多次比较中被发现存在差异甲基化（图2），并且TYRP1在黑色和黄色条纹个体之间存在差异（表S12）。PMEL通过其与溶酶体和酪氨酸酶（TYR）的相互作用而成为已知的黑色素生成调节因子（Sun等人，2018年），并且之前已被认为是在莫桑比克罗非鱼中深色形成的主要效应位点（Wang等人，2024年）。TYR是编码酪氨酸酶的基因，这是黑色素生物合成途径中的限速步骤，将氨基酸酪氨酸转化为多巴醌（Hearing和Jiménez，1987年）。因此，与棕色皮肤相比，黑色皮肤中TYR的高甲基化与两种皮肤颜色之间的结构差异一致（Burgon等人，2020年）。最后，真黑素（或深色色素）的产生需要TYRP1将多巴醌转化为DHICA（D'Alba和Shawkey，2019年）。所有这些位点都直接与黑色素生成相关，因此对两栖动物皮肤中的深色色素生成有重要贡献。出乎意料的是，我们还在黄色与棕色皮肤中发现了黑色素相关基因的高甲基化，包括GPNMB、ATOX1和QDPR。尽管GPNMB通过保护黑色素免受细胞毒性及其生成受损而与其相关（Wang等人，2021年），但它也参与其他与颜色无关的细胞功能（Saade等人，2021年），这可能解释了为什么它在黄色与棕色皮肤中上调和高甲基化。同样，ATOX1和QDPR在细胞内还有其他功能，例如QDPR在神经递质生成中回收四氢生物蝶呤（BH4），而ATOX1在许多基本生物过程中帮助铜的转运（Hatori和Lutsenko，2016年；Th?ny等人，2000年）。尽管这些与黑色素相关的基因之间的相关性R2值较低，但在两个维度上都显著受影响的转录本显示出一致的方向性模式：高甲基化与上调相关，低甲基化与下调相关。

4.2 甲基化在蝾螈颜色中的作用
甲基化，特别是在DNA中，已被证明在动物颜色中起作用（Strowbridge等人，2025年；Zhou等人，2021年）。RNA甲基化的理解要少得多：虽然之前的研究已经发现了家养绵羊中深色与浅色之间的m6A RNA甲基化差异（Zhao等人，2023年），但很少有研究显示m6A甲基化直接影响野生或非模式动物的颜色（Strowbridge等人，2025年）。我们的结果清楚地表明，几个与色素生成相关的基因在欧洲火蝾螈的不同颜色形态中存在差异甲基化。我们发现了位于黑色素生物合成途径内的位点的RNA甲基化证据。例如，PMEL、TYR和TYRP1在多次比较中被发现存在差异甲基化（图2），并且TYRP1在黑色和黄色条纹个体之间存在差异（表S12）。PMEL通过与溶酶体和酪氨酸酶（TYR）的相互作用而成为已知的黑色素生成调节因子（Sun等人，2018年），并且之前已被认为是在莫桑比克罗非鱼中深色形成的主要效应位点（Wang等人，2024年）。TYR是编码酪氨酸酶的基因，这是黑色素生物合成途径中的限速步骤，将氨基酸酪氨酸转化为多巴醌（Hearing和Jiménez，1987年）。因此，与棕色皮肤相比，黑色皮肤中TYR的高甲基化与两种皮肤颜色之间的结构差异一致（Burgon等人，2020年）。最后，真黑素（或深色色素）的产生需要TYRP1将多巴醌转化为DHICA（D'Alba和Shawkey，2019年）。所有这些位点都直接与黑色素生成相关，因此对两栖动物皮肤中的深色色素生成有重要贡献，表明表观转录组甲基化对黑色色素生成有重要影响。出乎意料的是，我们还在黄色与棕色皮肤中发现了黑色素相关基因的高甲基化，包括GPNMB、ATOX1和QDPR。尽管GPNMB通过保护黑色素免受细胞毒性和黑色素生成受损而与其相关（Wang等人，2021年），但它也参与其他与颜色无关的细胞功能（Saade等人，2021年），这可能解释了为什么它在黄色与棕色皮肤中上调和高甲基化。同样，ATOX1和QDPR在细胞内还有其他功能，例如QDPR在神经递质生成中回收四氢生物蝶呤（BH4），而ATOX1在许多基本生物过程中帮助铜的转运（Hatori和Lutsenko，2016年；Th?ny等人，2000年）。尽管这些例子与黑色素有些关联，但与黑色素最直接相关的基因在黄色和棕色皮肤中始终表现出低甲基化。除了甲基化对黑色素生物合成途径的影响外，我们还展示了甲基化对色素生成的间接影响。值得注意的是，NOTCH1是一种与小鼠中的黑色素相关表型有关的基因，其敲除会导致过早灰白（Schouwey等人，2007年），它在黑色皮肤中也表现出高甲基化（图2），这加强了甲基化可能调节与色素生成相关的间接调控途径的观点。此外，多个角质形成细胞相关基因在所有比较中都存在差异甲基化（表S7、S9、S11和S13），表明甲基化可能通过影响表皮中的黑色素吸收和保留来间接影响黑色素颜色（Bento-Lopes等人，2023年）。在黄色和黑色条纹个体之间的颜色比较中，我们发现了一些与黑色素生成间接相关的基因。值得注意的是，MYO1B和PHB2与黑色素运输有关（Jo等人，2020年；Salas-Cortes等人，2005年），并在黄色皮肤中表现出高甲基化。相反，LGALS3和CLU在黄色皮肤中表现出低甲基化，并分别参与黑色素合成的正向和负向调节（Chalupa等人，2015年；Lee等人，2017年）。有趣的是，在棕色和黑色皮肤之间，RNA甲基化的差异最为明显，尤其是在黑色素相关基因中。棕色皮肤表现出广泛的低甲基化，表明RNA甲基化在黑色素皮肤类型之间对色素生成有动态调节作用，而且棕色皮肤的基础比简单的黑色皮肤更为复杂。尽管棕色与黑色皮肤中这些低甲基化基因的基因表达差异相对较低，但黑色皮肤的特点是表皮和真皮层中的黑色素细胞密度更高（Burgon等人，2020年），这表明结构差异可能受到m6A甲基化的影响。鉴于m6A可以调节翻译效率和幅度（Mao等人，2019年），这可能有助于解释尽管转录本表达水平相似，但表型仍存在差异。需要进一步的研究来建立甲基化模式、蛋白质表达和色素生成结果之间的因果关系。

4.2 保守的色素途径的表达有助于蝾螈的颜色
黑色素生物合成途径在脊椎动物中高度保守（McNamara等人，2021年），黑色素基因的表达差异有助于皮肤（Burgon等人，2020年）、羽毛（Theron等人，2001年）和毛发（Hoekstra等人，2006年）的色素类型。在两栖动物中，黑色素化与新的颜色变体、对纬度或海拔的适应性反应或伪装有关（Alho等人，2010年）。基于我们的甲基化发现，我们展示了黑色素色素基因在火蝾螈皮肤颜色差异中的核心作用（图1）。例如，所有上述差异甲基化的黑色素基因（PMEL、TYR和TYRP1）也在一个或多个比较中表现出差异表达。此外，MLANA（或MART-1），一个参与黑色素体成熟的基因（Hoashi等人，2005年），在黑色与黄色皮肤中上调。MLANA敲除已被证明会导致小鼠毛色稀释（Aydin等人，2012年），表明它们在颜色生成中起着重要作用。在我们自己的数据中差异甲基化和/或差异表达的大多数黑色素相关基因，包括MLANA、PMEL、TYR和TYRP1，也在之前使用短读长RNA测序研究火蝾螈颜色时被发现存在差异表达（Burgon等人，2020年）。差异表达的黑色素相关基因在黑色皮肤中表达升高，在棕色皮肤中表达中等，在黄色皮肤中表达最低（图1和S1）。然而，由于棕色与黑色皮肤比较的样本量较小，并非所有比较都具有统计学意义。出乎意料的是，我们还在黄色与棕色皮肤中发现了一个黑色素相关基因GPNMB的上调。然而，如前所述，它在多种与颜色无关的细胞环境中起作用。此外，我们发现PMEL在黄色皮肤中下调，并且之前已经显示PMEL通过与ASIP的相互作用可以导致褐黑素（黄色色素）的生成（McNamara等人，2021年），这可能解释了某些黑色素相关基因在黄色与棕色皮肤比较中上调的模式。尽管如此，直接与黑色素生物合成途径相关的基因在黄色和棕色皮肤中始终下调。除了在黑色素生物合成途径中的表达外，我们还展示了其他与色素生成相关的表达差异和表达对色素生成的更间接影响。例如，DGAT2基因与类胡萝卜素（一种鲜艳的色素）相关的颜色形成有关（Ahi等人，2020年；Recknagel等人，2024年），在黄色和棕色皮肤的个体中该基因的表达水平都高于黑色皮肤的个体，这表明类胡萝卜素在蝾螈的颜色形成中起着作用。此外，几个与酪氨酸酶（TYR）相互作用参与黑色素生成的谷胱甘肽基因（Sonthalia等人，2016年）在多个比较中表现出差异性表达（见表S8和S10）。我们发现一个与角质形成细胞相关的基因在棕色和黄色皮肤中的表达存在差异（见表S10），进一步表明与角蛋白相关的基因参与色素沉着过程（Bento-Lopes等人，2023年）。在条纹蝾螈中，ATP6V1H和MAPK1IP1L两个基因在黄色皮肤中的表达水平分别降低和升高，而其他研究已经间接指出这两个基因与黑色素生成有关（Ramos-Balderas等人，2013年；Wellbrock等人，2002年）。

4.3 皮肤中m6A RNA甲基化与基因表达之间的关系

表观转录组学研究中的一个关键问题是甲基化如何影响基因表达，进而影响表型多样性（Strowbridge等人，2025年）。目前，关于甲基化与基因表达之间关系的共识尚未形成（Xie等人，2025年；Zhao等人，2023年）。然而，研究表明RNA甲基化对基因表达既有正面影响也有负面影响，例如在黑色和白色绵羊的皮肤中，根据基因位点的不同，甲基化可能会导致基因表达增加或减少（Zhao等人，2023年）。在这里，我们发现RNA甲基化与基因转录本的表达之间存在显著的正相关关系（见图4和S3；表S2和S3）。我们有证据表明被甲基化的转录本与实际表达的转录本之间存在非随机性的重叠，如果一个转录本被甲基化，其表达的可能性会增加37到112倍（见表S5）。由于我们的研究设计能够比较同一个体内的不同皮肤颜色，我们还证明了这种正相关关系在个体内部是稳定的，并且与颜色差异密切相关（见图S4；表S4）。值得注意的是，我们在黑色素相关基因中发现了差异表达和差异甲基化之间的重叠。例如，TYR和TYRP这两个基因对真黑色素的生成至关重要（D'Alba和Shawkey，2019年；Hearing和Jiménez，1987年），在棕色和黄色皮肤中的表达水平低于黑色皮肤。尽管其他黑色素相关基因没有同时表现出差异表达和甲基化，这可能是由于统计功效不足，但大多数黑色素基因在我们的差异表达和甲基化结果中都位列前150个转录本之列。

4.4 色素沉着与表观转录组修饰的生态学

色素沉着在两栖动物乃至所有动物中都对其生态学和适应性起着关键作用（Orteu和Jiggins，2020年；Rudh和Qvarnstr?m，2013年）。先前在其他蝾螈类群中的研究表明，栖息地选择（Fisher-Reid等人，2013年）和频率依赖性选择（Fitzpatrick等人，2009年）对不同颜色形态的丰富度有影响。在火蝾螈类群中，警戒色、性选择、环境条件以及类胡萝卜素的可用性都被发现对维持颜色多样性起着作用（Aguilar等人，2023年；Barzaghi等人，2022年；Beukema等人，2016年；Caspers等人，2020年；Prei?ler等人，2019年）。在我们的研究亚种S. s. bernardezi中，提出了几种生态过程可能促进了颜色多态性的起源和持续存在。例如，海拔适应、配偶选择和毒性被认为对S. s. bernardezi的颜色多态性有影响，然而，这些解释缺乏实证支持（Burgon等人，2020年）。与S. s. bernardezi的颜色受到选择压力一致，研究发现同一亚种内的不同颜色形态受到不同的选择压力，这一点从基因组异常值模式中可以推断出来（Burgon等人，2020年）。这包括TYR基因位点，鉴于该基因在我们的研究中多次比较中表现出一致的差异表达和甲基化，这一点尤为引人注目。因此，基因表达与RNA甲基化之间的正相关关系表明RNA甲基化在火蝾螈的颜色变异生成和维持中起着重要作用，也许对其他两栖动物也是如此。有趣的是，TYR基因在黑色皮肤中既表现出上调又表现出过度甲基化，而该基因对黑色素生成至关重要。先前的研究还表明TYR基因在不同颜色形态的蝾螈中受到不同的选择压力（Burgon等人，2020年），这表明这些进化机制之间存在基因组、转录组和表观基因组的联系。RNA甲基化、基因表达和颜色变异之间的关系强调了它在维持表型多样性中的重要性。未来来自非模式系统的研究将为这些关系和功能提供更多证据。

4.4 色素沉着与表观转录组修饰的生态学

两栖动物以及其他动物的色素沉着在其生态学和适应性中起着关键作用（Orteu和Jiggins，2020年；Rudh和Qvarnstr?m，2013年）。先前在其他蝾螈类群中的研究表明，栖息地选择（Fisher-Reid等人，2013年）和频率依赖性选择（Fitzpatrick等人，2009年）对不同颜色形态的丰富度有影响。在火蝾螈类群中，警戒色、性选择、环境条件和类胡萝卜素的可用性都被发现对维持颜色多样性起着作用（Aguilar等人，2023年；Barzaghi等人，2022年；Beukema等人，2016年；Caspers等人，2020年；Prei?ler等人，2019年）。在我们的研究亚种S. s. bernardezi中，提出了几种生态过程可能促进了颜色多态性的形成和持续存在。例如，海拔适应、配偶选择和毒性被认为对S. s. bernardezi的颜色多态性有影响，然而，这些解释的实证支持尚缺乏（Burgon等人，2020年）。与S. s. bernardezi的颜色受到选择压力一致，研究发现同一亚种内的不同颜色形态受到不同的选择压力，这一点从基因组异常值模式中可以推断出来（Burgon等人，2020年）。这包括TYR基因位点，鉴于该基因在我们的研究中多次比较中表现出一致的差异表达和甲基化，这一点尤为引人注目。因此，形态分化的分子基础是坚实的，这些基因可能在该亚种的生态适应中起着关键作用。我们的发现首次证明了表观转录组在响应选择和颜色差异中的作用，这为研究非模式物种在其环境中的甲基化生态学影响提供了新的视角。在Salamandra属中，已知个体在发育过程中颜色会发生变化（Barzaghi等人，2022年；Caspers等人，2020年）。幼体通常颜色较深，随着它们向陆地生活阶段过渡，个体逐渐出现黄色和黑色（Wisniewski和Wisniewski，1998年）。幼体的颜色通常比成年个体更黄（Wisniewski和Wisniewski，1998年），这可能反映了特定发育阶段对警戒色的选择压力。幼体的颜色还受到局部条件的影响，如食物可用性和环境背景颜色（Barzaghi等人，2022年；Sanchez等人，2019年），这清楚地表明了生态学对色素沉着的重要性。发育过程中基因表达的协调变化可能是由甲基化引起的，我们的发现强烈表明甲基化在发展颜色多态性中起着关键生态作用。大多数关于颜色生态适应的研究都集中在等位基因遗传机制的重要性上，但最近的进展强调了其他分子机制的重要性和相互作用（Ahi和Singh，2025年）。我们清楚地证明了m6A甲基化与Salamandra属不同颜色形态中的基因表达之间的关联。此外，尽管我们没有进行正式的可变剪接分析（因为我们缺乏参考基因组），但我们展示了与色素生成速率限制步骤相关的TYR基因的假想异构体的差异表达和甲基化。这突显了多种分子机制在产生表型多样性中的潜在作用。由于缺乏基因组资源（如组装和注释的参考基因组）、蝾螈庞大的基因组大小（Gregory，2025年）以及进行遗传图谱分析所需的个体数量，目前无法在Salamandra属中探讨等位基因遗传机制对颜色变异的影响。基因组简化表示方法可以克服其中的一些限制（例如，参见Burgon等人（2020年）关于颜色的混合图谱分析），如果已知并专注于适当的候选基因，外显子捕获方法也可以（例如，参见Mulder等人，2022年）。因此，我们在这里关注表观转录组变异作为可能促进该物种生态适应的机制之一，并为未来的研究提供了候选位点。我们相信我们的工作将有助于未来研究探索维持这种假定性适应性多态性的相关生态和进化机制。

5 结论

在这里，我们提供了表观转录组甲基化在动物色素沉着中作用的首批例子之一。我们清楚地证明了表观转录组甲基化影响基因表达，并且这种机制参与了我们在一个颜色多态性蝾螈亚种中观察到的颜色变异。许多与黑色素生成直接或间接相关的基因在不同皮肤颜色之间以及黑色和黄色个体之间表现出差异表达和/或甲基化。重要的是，我们的发现揭示了RNA甲基化与转录本表达之间的正相关关系，包括在色素相关位点上，以及甲基化导致差异表达的可能性增加。值得注意的是，我们的研究仅关注了一种RNA修饰——N6-甲基腺苷（m6A），而目前已知的RNA修饰有超过170种（Cappannini等人，2023年）。这突显了色素沉着领域中广阔且大部分未探索的表观转录组调控景观。需要进一步的研究来建立基因表达、甲基化和色素沉着结果之间的因果关系。未来需要对这些不同颜色形态的生态学进行详细研究，以揭示产生这种颜色多态性的重要环境条件和相互作用及其进化基础。我们的结果为未来在非模式动物系统中的表观转录组研究奠定了基础，因为我们清楚地表明表观转录组修饰有助于观察到的表型多样性。这为研究颜色变异背后的互补遗传、表观基因组和表观转录组机制开辟了新的途径，这些机制在动物中起着重要的生态和进化作用。

作者贡献

K.R.E.、M.G.R.、D.R.V.和N.S.设计了这项研究。K.R.E.、N.S.和D.R.V.进行了野外工作。N.S.进行了所有实验和分析。N.S.和K.R.E.撰写了手稿，所有作者都参与了最终草稿的审阅和编辑。

致谢

这项工作得到了NERC IAPETUS2博士奖学金的支持，N.S.与K.R.E.、D.V.和M.G.R.共同获得了该奖学金。我们感谢A. Jacobs、J. Cotton以及格拉斯哥大学Evo-Div小组在分析方面的建议。我们感谢T. Stevenson在ONT平台上的支持。我们感谢阿斯图里亚斯亲王政府提供的收集生物样本的许可。

这项工作得到了NERC IAPETUS2博士奖学金的支持，N.S.与K.R.E.、D.V.和M.G.R.共同获得了该奖学金。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

序列数据存档在NCBI Sequence Read Archive中，网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov，BioProject PRJNA1337593。本研究中生成和使用的参考转录组数据可在格拉斯哥大学的Enlighten仓库中找到，网址为https://doi.org/10.5525/gla.researchdata.2198。相关脚本和文件也存档在Enlighten中。所有用于重现Nicholas Strowbridge分析的代码可在他的github上找到：https://github.com/NStrowbridge/Salamandra_skin_colour_methylation_expression。