在丝兰属（Tillandsia L.）中，无论是兼性CAM物种还是组成型CAM物种，其核心CAM基因之外的转录结构都存在多样性

《Molecular Ecology》：Divergent Transcriptional Architectures Beyond Core CAM Genes in Facultative and Constitutive CAM Species in Tillandsia L.

　　摘要

景天酸代谢（CAM）是一种节水型光合作用策略，涉及一系列复杂的特征，包括代谢、解剖和调控方面，这些特征在昼夜周期中会发生变化。尽管CAM在陆地植物中多次独立进化，但实现这种趋同的进化路径仍然不清楚。虽然相同的CAM（脱）羧化基因始终参与其中，但一个关键问题是，不同的CAM表型是否也依赖于一组共享的辅助基因，反映了表达的定量连续性，或者它们是否可以通过不同的或冗余的周边解决方案出现。凤梨科植物Tillandsia亚属具有多样的光合作用策略，为探讨这个问题提供了理想的系统。通过对两种密切相关的物种在水分充足和水分受限条件下的生理和转录组分析，我们表征了兼性和组成型CAM。通过比较同源基因的表达和直系群招募，我们发现尽管两种物种在缺水时都表现出CAM，但与气孔运动、糖/苹果酸运输、水通道蛋白和淀粉代谢相关的途径的转录变化重叠度很小。参与CAM（脱）羧化循环的核心酶表现出广泛的共同表达模式，然而兼性CAM物种在夜间特异性上调了PPC2而不是典型的CAM相关基因PEPC的直系同源物PPC1。我们的研究表明，尽管某些核心CAM酶的表达是保守的，但即使在密切相关的物种之间，周围的转录结构也可能存在显著差异。这支持了一种模型，即CAM是通过功能等效但非直系同源基因的镶嵌式招募而进化的——突显了其灵活和模块化的遗传结构。这些见解加深了我们对CAM重复进化机制及其促进适应性多样化能力的理解。

1 引言

复杂特征的重复进化一直是进化生物学家长期研究的课题。目前尚不清楚需要在多个生物层面上协调变化的特征如何在生命之树中频繁且反复地进化。一种解释是，相似的表型可以通过不同的突变集合产生，这也被称为“遗传路径”，假设复杂特征是多基因的，并且相关基因具有显著的冗余性（Barghi等人2020；Goldstein和Holsinger 1992；Láruson等人2020；Nowak等人1997）。事实上，在包括海滩鼠（Steiner等人2009）、针叶树（Yeaman等人2016）、实验室饲养的果蝇（Barghi等人2019）、可可植物（H?m?l?等人2020）和Heliosperma生态型（Szukala等人2023）在内的广泛生命谱系中，已经记录了缺乏共同遗传基础的趋同表型。景天酸代谢（CAM）代表了一组协调的、复杂的但高度可进化的特征的典型例子，至少在38个植物科中独立进化了66次（Gilman等人2023）。CAM植物通过夜间而不是白天吸收CO2来重新配置光合作用代谢，这与C3植物不同。夜间固定的CO2随后被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和苹果酸脱氢酶（MDH）暂时转化为苹果酸。苹果酸储存在液泡中，然后在白天脱羧，为Calvin–Benson–Bassham循环提供CO2。这使得白天气孔关闭，通过提高细胞内CO2水平来提高Rubisco的效率（Osmond 1978），并大幅减少通过蒸腾作用的水分损失（Borland等人2014）。这些适应在高温度或干旱胁迫下特别有利，因为这些条件会加剧Rubisco的氧化（Heyduk等人2021）。CAM整合了几个相互依赖的特征，包括时间协调的转录调控以启动替代的生化途径，以及细胞过程，如气孔运动、糖和苹果酸运输以及淀粉代谢（Borland等人2016；Schiller和Br?utigam 2021）。此外，某些解剖特征通常与CAM相关，这导致了一种假设，即它们可能是植物完全表达CAM的先决条件（Nelson等人2005）。这些解剖特征的例子包括扩大的液泡（Heyduk等人2016；Males 2018）、更紧密排列的叶肉细胞（Nelson和Sage 2008）和多肉性（Gibson 1982；Griffiths等人2008），尽管对于后者，种内变异似乎与CAM无关（Martin等人2009）。CAM最初被描述为具有离散的双峰表型分布，但对具有CAM亲缘关系的C3物种的详细生理研究表明，存在弱型和兼性形式的CAM，这些形式不需要重大的解剖变化（Heyduk等人2021；Neales 1975；Pierce等人2002；Silvera等人2005；Winter和Holtum 2002）。这些发现促使人们将CAM概念化为一个连续体，尽管对此仍有争议（Br?utigam等人2017；Schiller和Br?utigam 2021；Winter和Smith 2022）。CAM连续体概念难以与文献中的许多离散CAM类别（例如，兼性、弱型、强型、组成型CAM、CAM循环；Winter 2019）相协调，这些类别并不明显符合连续的表型谱（Edwards 2023）。此外，由于碳同位素比率（测量大规模分类群CAM活性的最经济有效方法）对这些表型缺乏敏感性，因此难以检测到弱/兼性CAM植物（Pierce等人2002；Winter和Holtum 2002）。需要更详细的测量，如标准条件和干旱条件下的滴定酸度或气体交换，以区分弱/兼性CAM和C3物种。CAM的进化轨迹以及不同CAM表型之间的分子相似性仍然不清楚。虽然核心CAM酶（如PEPC）的昼夜表达变化在CAM植物类群中普遍保守，但实现的CAM表型可能涉及来自更广泛的代谢、调控和解剖网络的许多小效应基因，可能具有高度冗余性。不同CAM表型之间的比较分析可以揭示CAM进化是遵循受限的、共享的进化路径，还是涉及大量的遗传冗余。例如，Heyduk等人（2018）在Agavoideae中发现了CAM相关基因在弱型和强型CAM表型中的共享和可变表达模式，但需要更多研究来比较密切相关类群之间CAM的分子基础，以全面了解CAM进化中的遗传冗余和限制。Tillandsia亚属（Tillandsia L.，凤梨科）是一个研究关键创新特征重复和快速进化的新兴模型。作为进化最快的植物谱系之一（Givnish等人2014），该亚属在过去700万年内形成了超过250个物种的适应性辐射（Barfuss等人2016；Mendoza等人2017；Yardeni等人2025）。这一辐射特征了许多关键创新，包括CAM，其表型范围从类似C3的到强组成型CAM（Crayn等人2004；De La Harpe等人2020）。在这项研究中，我们比较了两种表现出兼性和组成型CAM的密切相关物种，以评估这些相互依赖的复杂特征背后的遗传冗余程度。CAM是一种复杂的表型，受多个关键基因和蛋白质相互作用、细胞过程以及代谢途径的影响。如果CAM进化受到严格限制，那么这两种表型应该代表沿着共享进化轨迹的位置，由同一组基因介导，但表达程度不同。相反，至少在网络的某些部分，基因表达的有限重叠表明存在（部分）冗余的遗传结构，这与更大的可进化性和多种独立的CAM进化路径一致。T. vanhyningii Harms（以前称为T. ionantha var. vanhyningii L.B.Sm.，由Beutelspacher和García-Martínez（2021）提升为物种级别）和T. leiboldiana Schltdl.是Tillandsia亚属的密切相关的成员，它们的最大分化时间为320万年（Barfuss等人2016；Mendoza等人2017；Yardeni等人2025）。T. vanhyningii是一种多肉的“灰色”物种，具有密集的毛状体覆盖，而“绿色”的T. leiboldiana通常形成蓄水池，相对较少多肉。这些物种展示了亚属中一些最不同的碳同位素值（De La Harpe等人2020），其中T. vanhyningii的δ13C值典型地属于强组成型CAM（-13.9），而T. leiboldiana的值典型地属于C3光合作用（-31.3）。然而，最近的代谢组学、基因组学和转录组学分析表明，T. leiboldiana可能是一种兼性CAM物种（Groot Crego等人2024）。尽管夜间苹果酸积累量很少，但在水分充足条件下，T. leiboldiana在某些CAM相关基因（包括PEPC激酶）中表现出类似CAM的表达，表明在干旱诱导的胁迫下可能激活潜在的CAM能力。我们将这两种物种的样本置于标准和水分受限条件下，并测量了昼夜周期内的滴定酸度、气体交换和转录组谱型，以比较它们在两种浇水制度下的光合作用表型（图1）。我们的研究表征了它们的光合作用表型，并阐明了缺水如何调节CAM表达。我们表明，尽管两种物种在水分受限条件下都表现出CAM，但它们在CAM相关外围基因的转录调控方面存在显著差异。这些发现揭示了CAM背后的遗传冗余程度，并提供了CAM可以通过多种进化途径产生的见解。

2 材料与方法

2.1 实验设置和采样

我们设计了一个实验，以测试T. vanhyningii和T. leiboldiana在标准（SW）和水分受限（WL）条件下的光合作用表型。该研究包括每个物种的六个克隆样本（表S1），这些样本大小相似，作为年龄相似性的代理，并且足够大，可以被认为是能够开花的成年植物。2018年10月，这些样本被放置在维也纳大学植物园的相同温室条件下。样本被允许适应特定的温室条件6周，然后被置于12小时光照/12小时黑暗的制度下14天，通过在早上6点到下午6点之间补充人工光源。夜间温度保持在20°C，白天保持在22°C。在这14天里，每个物种的三个样本被置于完全缺水的条件下。其余三个样本保持在植物园中使用的标准浇水条件下（每2天浇水一次）。14天后，每个样本每6小时采样一次（四个时间点：黎明后4小时[10 AM]、黎明后10小时[4 PM]、黄昏后4小时[10 PM]、黄昏后10小时[4 AM]），从而得到处理组合（物种×时间点×浇水制度）的三个重复（图1）。由于每个样本依次被采样四次，因此通过在植物基部轻轻拔出一整片叶子来收集叶材料，以尽量减少损伤。然后去除叶子的尖端和基部，并将中间部分立即放入液氮中并在-80°C下储存。

2.2 滴定酸度测量

滴定酸度（TA）的测量方法遵循Wai等人（2019）。将所有四个时间点、两种浇水制度和两个物种的冷冻叶材料（总共48个样本）称重并研磨成粉末，然后加入5 mL的80% EtOH溶液中。接下来，样品在80°C的水浴中孵育1小时，并偶尔搅拌。试管以5000 rpm离心5分钟，然后转移上清液并丢弃沉淀物。提取物随后冷却至室温。使用pH526 WTM Sentix微米计，通过向溶液中滴加0.1 N NaOH直到pH达到8.2来测量每个样本，同时记录添加的NaOH体积。TA以μ当量/克新鲜质量（g FM）计算，公式为：TA（μ当量/g FM）= [VNaOH（μL）× CNaOH（μmol/μL）]/msample（g），其中CNaOH等于0.1。由于NaOH是一价碱，滴定酸的μ当量（来自单价和多价酸的总和）等于滴定过程中消耗的NaOH的微摩尔数。为了测试每个物种和浇水制度内TA是否随时间显著波动，我们为每个物种构建了一个线性混合效应模型（LMM）：

$$ \mathrm{滴定}\ \mathrm{酸}\sim \mathrm{浇水}\ \mathrm{制度}\times \mathrm{时间}\ \mathrm{点}+\left(\ 1\ |\ \mathrm{重复}\ \right) $$

首先测试了每个物种内TA测量的正态性。在LMM模型中，可滴定酸（titratable acid，TA）作为因变量，而浇水制度（watering regime）和时间点（time point）作为固定效应，它们的交互作用也被纳入模型中。为了控制同一时间点和浇水制度下TA测量的随机变异，模型为每个重复实验添加了一个随机截距（random intercept）。分析使用R包lme4中的lmer函数进行（Bates等人，2015年）。通过绘制QQ图和每个物种的拟合值与残差图来评估模型的拟合优度。使用R包lmerTest（Kuznetsova等人，2017年）获得p值来评估固定效应的显著性。之后，在R包emmeans中进行了事后Tukey HSD检验，以评估不同浇水制度和时间点对TA的影响。

2.3 T. leiboldiana的气体交换测量

2025年10月，对T. leiboldiana进行了单独的实验，以评估在逐渐缺水期间其净二氧化碳吸收（net CO2 uptake）的情况。将一个T. leiboldiana克隆的叶子放置在一个气体交换实验室中8天，期间不进行浇水。净二氧化碳吸收和其他指标由WALZ GFS-3000系统测量。实验期间的环境温度保持在22°C至24°C之间，叶片夹具外的相对湿度为35%，叶片夹具内的相对湿度为50%。全光谱LED灯（最大340 PPFD）在每天早上6点到7点和晚上6点到7点之间逐渐开启和关闭，形成12小时的光照周期。实验结束时（9天未浇水），植物显示出明显的干旱胁迫迹象（叶片变黄和卷曲）。随后，植物被置于一个14天的恢复期，首先完全浸入去矿物质水中，然后在温室中每天喷洒水，温室的气候条件与实验室相同，只是相对湿度为70%。在恢复期结束时再次测量了净二氧化碳吸收。

2.4 RNA提取和测序

在上午10点（D+4）和晚上10点（N+4）的时间点，对两种浇水制度和两个物种（总共24个样本）进行了RNA-seq数据采集。使用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取总RNA。使用Nanodrop评估提取物的纯度和浓度；使用BioAnalyzer获得了RIN和片段化谱型（表S1）。RNA文库制备和poly-A捕获在维也纳生物中心核心设施（VBCF）使用NEBNext stranded mRNA试剂盒完成。文库在Illumina NovaSeq SP 150 PE上进行测序。

2.5 RNA-Seq数据处理

使用FastQC v.0.11.8（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）和MultiQC（Ewels等人，2016年）评估原始序列的质量。使用AdapterRemoval v.2.3.1（Schubert等人，2016年）去除适配器和低质量碱基，设置如下：–trimns –trimqualities –minquality 20 –trimwindows 12 –minlength 36。修剪后的T. leiboldiana数据与其同种参考基因组（GenBank登录号：GCA_029204045.2，Groot Crego等人，2024年）对齐，而T. vanhyningii的数据与其最亲近的亲属T. fasciculata的参考基因组（GenBank登录号：GCA_029168755.2；Groot Crego等人，2024年）对齐。质体系统发育研究表明，T. fasciculata和包括T. vanhyningii在内的T. ionantha复合群的分化时间不超过180万年（Vera-Paz等人，2023年）。Yardeni等人（2025年）基于全基因组数据的最大似然推断报告，这两个谱系之间的替换率为每个位点0.008。鉴于这种密切的进化关系，我们认为这些物种适合进行跨物种mRNA读段对齐。这些对齐使用STAR v. 2.7.3a（Dobin等人，2013年）通过GFF文件一次性完成，以指定外显子区域。为了证明使用非同种参考基因组不会显著影响我们的发现，我们在补充材料中提供了将T. leiboldiana的数据映射到其自身参考基因组与映射到T. fasciculata的数据的比较。

2.6 差异基因表达分析

使用subread包FeatureCounts v.2.0.6（Liao等人，2014年）对配对末端和反向链读段（选项-p，-s 2）的读段进行了量化。通过计算每个外显子的读段数量，并使用FeatureCounts的内置元特征函数汇总每个基因的外显子计数来生成计数。使用Bioconductor包edgeR v.4.2.1（Robinson等人，2009年）分别对每个物种进行了差异基因表达（DGE）分析。我们构建了一个设计矩阵，包含了两种处理方式（时间点和浇水制度）。过滤掉了同一物种中三个或更少样本的计数每百万（cpm）值小于或等于1的基因。使用edgeR的默认修剪均值（TMM）方法（Robinson和Oshlack，2010年）进行了文库大小标准化。使用Cox-Reid轮廓调整似然（CR）方法来估计分散度。通过拟合负二项式通用线性模型（GLM），分别测试了每个物种在不同时间点和不同浇水制度下的基因差异表达，对比方式为：Day versus Night at SW = Day_SW – Night_SW，Day versus Night at WL = Day_WL – Night_WL，WL vs. SW at day = WL_day – SW_day，WL vs. SW at night = WL_night – SW_night。为了检验这些GLM的拟合度，我们进行了准似然F检验。显著性水平使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正进行了调整，以考虑多重检验的影响。当FDR校正后的p值低于0.05且表达量的绝对对数变化至少为1.5时，认为基因具有差异表达（DE）。然后使用ggplot2可视化了每种处理方式（时间点和浇水制度）的DE基因数量，并在物种间进行了比较。

2.7 转录组响应的重叠

为了了解物种间对时间和浇水制度的转录组响应的重叠程度，我们使用了Groot Crego等人（2024年）提供的T. leiboldiana和T. fasciculata的同源信息，在正交群（orthogroups）水平上研究了两种物种的DE基因。此后，包含至少一个物种中DE基因的正交群被称为DE正交群。计算了每个比较中包含多个DE基因的DE正交群的百分比，以了解基因水平和正交群水平差异表达之间的关系（见表S8）。使用R包VennDiagram（Chen和Boutros，2011年）计算了物种间DE正交群的重叠情况。我们还评估了时间和浇水依赖性比较中DE正交群的重叠情况，因为CAM相关基因在两种情况下都可能是DE的，特别是在像T. leiboldiana这样的兼性CAM物种中。使用UpSetR（Conway等人，2017年）可视化了比较间DE正交群的重叠情况。在讨论物种间、时间点和浇水制度间的转录组重叠时，区分了物种内比较（在基因水平上讨论重叠）和物种间比较（在正交群水平上讨论重叠）。

2.8 DE基因的功能解释

使用Bioconductor包topGO v.2.50.0（Alexa等人，2006年）对两组DE基因（时间点和浇水制度之间）进行了基因本体（GO）富集分析。使用Fisher精确检验和‘weight01’算法评估富集的显著性。然后使用存储在仓库https://github.com/cgrootcrego/Tillandsia_CAM-Drought中的自定义脚本，按照显著性降序编译了前100个显著的GO术语。GO富集分析也在每个Venn图中至少包含25个正交群的子集上进行。对属于每个Venn图交集中的DE基因进行了GO富集分析。对于特定物种的交集，使用了相应物种的注释（例如，T. leiboldiana的独特交集的注释）。对于重叠的交集，使用了T. fasciculata的注释，假设正交群内的物种间有重叠注释。作为GO富集分析的补充，我们根据Groot Crego等人（2024年）的研究，识别了先前与CAM、淀粉代谢和糖酵解相关的基因。简要来说，Yardeni等人（2021年）基于一系列研究编译了与CAM、淀粉代谢或糖酵解相关的A. comosus基因ID，使用Groot Crego等人（2024年）的同源信息获得了相应的T. fasciculata和T. leiboldiana同源基因。这分别在607个正交群中得到了818个和753个基因（表S2）。然后使用Venn图交集在表S8和S9中列出了这些子集中包含DE基因的正交群。使用R包ComplexHeatmap（Gu等人，2016年）为所有24个样本绘制了53个CAM相关正交群的RNA-seq读段丰度热图。这个子集包括Ming等人（2015年）描述的作为CAM碳固定模块一部分的菠萝基因所在的七个正交群，不论它们的差异表达状态如何。剩余的46个正交群包括水通道蛋白（5个）、生物钟调节因子（11个）、苹果酸转运蛋白（6个）、光系统相关基因（5个）、液泡质子泵（9个）、与气孔运动相关的基因（4个）和一种液泡 invertase（表S3）。使用TPM（每百万转录本）方法对读段进行了归一化，并转换为log10尺度，然后使用z-score转换进行了均值中心化。对于PEPC和PPCK基因的同源物以及其他核心CAM途径基因，还通过线图可视化了它们的表达情况。

2.9 PPC1、PPC2和PPCK的基因树

我们通过在Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）上可用的A. comosus（V3）、Sorghum bicolor（v.3.1.1）、Oryza sativa（v.7.0）、Zea mays（RefGen v.4）、Asparagus officinalis（v.1.1）和Arabidopsis thaliana（TAIR10）的完整基因模型集合上运行BLASTP，并以T. fasciculata和T. leiboldiana的PEPC和PPCK基因模型作为查询（Groot Crego等人，2024年），鉴定了PEPC - PPC1和PPCC两个亚家族的同源物。根据每个基因的身份和目标长度筛选了命中结果。对于PPC1，我们选择了所有长度超过500个氨基酸且身份超过80%的目标，共得到7个物种的56个蛋白质序列。对于PPCC，身份阈值降低到70%，得到了8个序列。对于PPCK，无论目标长度如何，选择了所有身份超过60%的序列，共得到17个序列。使用mafft v.7.520（Katoh等人，2002年）和选项–op 1.5 –ep 0.1 –maxiterate 1000 –localpair对蛋白质序列进行了比对。使用IQTREE v.2.2.5（Minh等人，2020年）和选项-B 1000 -T AUTO构建了基因树。使用得到的共识树进行了可视化，合并了导致Poaceae基因的分支。PEPC同源物的命名遵循Deng等人（2016年）和Heyduk等人（2022年）的命名法。

3 结果

3.1 可滴定酸度测量

在标准条件（SW）下，T. vanhyningii的TA显示出类似CAM的日变化曲线，夜间酸积累后白天消耗（图2a，表S5）。我们的LMM模型显示，在标准条件和水限制（WL）条件下，TA在不同时间点之间有显著波动，但在同一时间点的不同浇水制度之间TA值没有显著差异（图2，图S1，表S6）。在T. leiboldiana中，SW条件下夜间TA没有显著积累（图2b）。在WL条件下，D+10和N+10之间的TA值有显著差异，表明叶片酸度有轻微波动（图2b）。T. leiboldiana在SW和WL条件下的TA积累时间曲线明显不同，因为在所有时间点，除了一个时间点外，两种浇水制度下的TA值都有显著差异（图2a，表S6）。这表明T. leiboldiana具有弱的、兼性的CAM循环，而T. vanhyningii显示出强CAM植物的特征性时间TA模式。图2：在图查看器或PowerPoint中打开

Tillandsia vanhyningii和T. leiboldiana的可滴定酸度（TA）测量结果。(a) 在两种浇水制度下，一天中四个时间点测量的TA值。LMM模型显示的同一物种内以及不同浇水制度间在给定时间点的比较的显著性水平如下：ns—p值>0.05；*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<1E-03。(b) 每对时间点之间调整后的TA值差异，分别针对每个物种。每个点代表在事后Tukey HSD测试中估计的同一物种和浇水制度内两个时间点之间调整后的TA值差异。前四个时间点的比较是24小时周期内相隔6小时的相邻时间点之间的差异，而最后两个时间点代表相隔12小时的平均TA值差异。每个点的形状表示平均TA值差异的显著性水平，并使用与(a)中相同的阈值显示。D表示黎明；FM表示新鲜质量；N表示黄昏；SW表示标准浇水条件；WL表示水分限制条件。

3.2 T. leiboldiana的气体交换

在开始缺水实验时，T. leiboldiana表现出类似C3的光合作用模式，主要在白天进行CO2同化（图3a，表S13）。然而，在第2天和第3天，白天的净CO2吸收量逐步减少，到第3天大部分时间几乎为零。在第1-3天，夜间没有净CO2吸收。第4天，代谢方式转变为弱CAM模式，即夜间进行CO2同化。从这一点开始，夜间净CO2吸收逐渐增加，并在实验进行过程中达到最高值。T. leiboldiana在白天也表现出净CO2吸收，但夜间吸收量始终更高。经过14天的恢复后，该植物在白天表现出净CO2吸收，而在夜间则没有吸收，这表明其光合作用模式完全回到了C3类型（图3b，表S14）。

图3：在图查看器或PowerPoint中打开

Tillandsia leiboldiana从水分充足条件到水分限制条件，然后恢复过程中的气体交换测量结果。T. leiboldiana叶片的净CO2吸收量（蓝线，左侧Y轴）和光合有效辐射（PAR；红线，右侧Y轴）。为了便于观察，对净同化曲线应用了指数平滑处理。当净CO2吸收值为正数（高于水平线）时，表示植物吸收的CO2多于释放的CO2；反之亦然。24小时周期分为光照期（白色背景）和黑暗期（灰色背景）。(a) 在8天无浇水期间的测量结果。(b) 在14天恢复后一个24小时周期内的测量结果。

3.3 差异基因表达

两种物种的独特映射率都很高，但T. leiboldiana的读段与其自身基因组的匹配度优于T. vanhyningii的读段与T. fasciculata基因组的匹配度（图S2）。平均而言，T. leiboldiana每个样本的独特分配读段比T. vanhyningii多16.3%（表S7）。然而，T. vanhyningii的非零计数基因数量比T. leiboldiana多8.7%。将T. leiboldiana映射到其自身参考基因组与映射到T. fasciculata基因组的结果进行比较，显示效果很小（见支持信息）。T. leiboldiana与T. fasciculata的亲缘关系大约是T. vanhyningii的两倍。因此，我们预计使用T. vanhyningii与T. fasciculata的对齐对本文研究结果的影响会小得多。在T. vanhyningii中，读段计数的变化主要由时间点解释，而浇水制度在PCA的第二组分中部分得到解释（图S3）。在T. leiboldiana中，第一个PCA组分按浇水制度分离样本，第二个组分则明显显示出时间点的差异。总体而言，T. leiboldiana按时间点和浇水制度的转录组差异比T. vanhyningii更明显（图S3）。DGE分析显示，沿时间和浇水制度轴的DE基因数量差异很大。在两种物种中，许多基因在白天和夜晚都有表达差异，无论浇水制度如何（图4）。在SW条件下，T. vanhyningii的上调基因数量在白天和夜晚相当，夜间仅多6个基因；而在WL条件下，T. leiboldiana的白天上调基因数量是夜晚的2.4倍。经过14天的恢复后，该植物在白天表现出净CO2吸收，而在夜间则没有吸收，表明其光合作用模式完全回到了C3类型（图3b，表S14）。

图4：在图查看器或PowerPoint中打开

在不同背景条件下进行的四次比较中，上调和下调DE基因的数量（FDR调整后的p值<0.05，|Log(FC)|≥1.5）。前四个条形图显示了两种浇水制度下的时间依赖性DE基因数量，而后四个条形图显示了两个时间点之间不同浇水制度下的基因数量。左侧符号表示背景条件，例如，前两个条形图显示了标准条件下的时间依赖性DE基因数量。左侧条形图显示了时间依赖性比较中白天上调的基因数量，右侧条形图显示了浇水制度比较中水分限制条件与标准条件下的基因数量。DE分析分别在每个物种中进行。深灰色背景表示夜间，较浅的条形图颜色表示水分限制条件。与时间依赖性分析相比，不同浇水制度之间的DE基因数量较少，除了T. leiboldiana在夜间。与T. leiboldiana不同，T. vanhyningii在不同浇水制度之间的DE基因数量非常少，这表明在时间依赖性DGE分析中检测到的大多数时间表达模式是持续性的。与T. vanhyningii相比，T. leiboldiana对缺水的反应更为明显，尤其是在夜间。在白天，大多数基因在WL条件下下调，而在SW条件下则相反（图4）。夜间两种条件下的DE基因总数在WL条件下是SW条件下的2.9倍。

3.4 转录组响应的重叠

时间依赖性的转录组响应在不同物种和浇水制度之间存在很大异质性，50%的所有正交群包含一个或多个DE基因（以下简称DE正交群）仅在一个物种和一种浇水制度中独特存在（图5a，部分a、b、c和d，表S8）。只有5.9%的所有时间依赖性DE正交群在所有组间共享（部分abcd）。这些正交群富含与光合作用和生物钟相关的功能（表S9）。

图5：在图查看器或PowerPoint中打开

不同物种、时间点和浇水制度之间DE正交群的重叠。(a) 文氏图显示了每种物种和浇水条件组合中共享的时间依赖性DE正交群的数量（即白天与夜晚）。例如：部分a显示了在标准浇水条件下Tillandsia vanhyningii中仅在白天和夜晚具有DE基因的正交群数量，而部分ad显示了在标准浇水条件下T. leiboldiana和T. vanhyningii中都具有DE基因的正交群数量。(b) 文氏图显示了每种物种和时间点组合之间不同浇水制度（即水分限制与标准条件）之间共享的DE正交群的数量。部分内的字母表示四个组之间的重叠。例如：部分a显示了在T. vanhyningii中仅在白天不同浇水制度下具有DE基因的正交群数量，而部分ad显示了在T. leiboldiana和T. vanhyningii中都在白天具有DE基因的正交群数量。最大的重叠发生在同一物种内部的不同条件下，因为只有19%的所有时间依赖性DE基因在物种间共享（表S8，a和b以及c和d的交集）。在T. leiboldiana中，仅在WL条件下时间依赖性DE的基因在条件间具有重叠，而在SW条件下则没有（图5a，表S9，部分d、bd、abd和ad）。这些基因富集了与水分缺失、非生物胁迫和脱落酸（ABA）相关的响应，而在SW条件下仅时间依赖性DE的基因则没有这种富集，表明T. leiboldiana在WL条件下经历了干旱诱导的胁迫（表S9）。相反，在T. vanhyningii中，与水分缺失、非生物胁迫或ABA相关的功能在浇水制度间共享的时间依赖性DE基因中富集（图5a，表S9，部分ab、abc和abd）。在WL条件下，不同物种之间共享的时间依赖性DE正交群比在SW条件下更多（17% vs. 14%，表S8），富集的功能与气孔运动、ABA和淀粉代谢相关（图5a，表S9，部分ad、acd和abd）。浇水制度的响应在组间几乎没有共享，75%的DE正交群仅在一个物种和时间点中独特存在（图5b，部分a、b、c和d），只有两个DE正交群在所有组间共享（图5b，部分abcd）。T. vanhyningii在WL条件下的时间点响应重叠很少（8%），而在T. leiboldiana中，两种浇水制度之间的基因有24%在两个时间点都具有DE（表S8）。由于T. vanhyningii在不同浇水制度之间的DE基因数量很少，物种间的重叠也非常小（2.8%）。总之，无论是整体转录组对昼夜变化的响应还是对浇水制度的响应，物种间的重叠都很小，但在水分限制条件下，物种间的昼夜表达似乎略有重叠，表明两种物种在水分限制条件下的代谢相似性增加。

3.5 CAM相关的转录组重叠和物种、时间点及条件之间的差异

3.5.1 物种间的重叠

在T. leiboldiana中，CAM相关的基因表达可能与时间点和浇水制度之间的差异表达有关，因为它在水分限制条件下激活了CAM循环（图2和3）。当考虑所有物种、时间点和浇水制度总和的DE正交群时，有516个正交群在物种、时间点和浇水制度之间都具有DE基因。在这516个正交群中，最大的群体仅在T. leiboldiana中同时具有时间依赖性和浇水制度依赖性（图S4），包括编码水通道蛋白NIP5-1、铝激活的苹果酸转运蛋白（ALMT）12和糖转运蛋白5的正交群。第二大群体包含132个正交群（26%），这些正交群在T. vanhyningiana中表现出时间依赖性表达，同时在T. leiboldiana中在不同浇水制度之间也具有DE表达，并包括12个先前描述的CAM相关正交群。最显著的是编码糖转运蛋白SWEET14和ALMT 9的正交群。SWEET14在两种物种中在WL条件下表达升高，但在T. leiboldiana中似乎在夜间表达更高，而在T. vanhyningii中其最高表达在白天（图6）。ALMT 9在T. leiboldiana在SW条件下的表达更高，而在WL条件下的表达较低。T. vanhyningii的ALMT 9同源物的表达在所有时间点和处理中都低于T. leiboldiana（图6）。

图6：在图查看器或PowerPoint中打开

‘每百万转录本中的转录本丰度（TPM）’显示了一部分单拷贝CAM相关正交群（列在表S3中）在Tillandsia vanhyningii（左侧面板，使用T. fasciculata同源物）和T. leiboldiana（右侧面板，使用T. leiboldiana同源物）在两个时间点和浇水制度下的情况。TPM值转换为对数尺度并以z分数为中心。显示的基因按功能类别组织，基因名称的颜色反映了它们的差异表达状态：蓝色=浇水制度之间的DE，绿色=时间点之间的DE，黑色=两种比较中都具有DE，灰色=没有DE。上标字母表示每个正交群所属的文氏图的交集。左下角的文氏图示意图表示每个字母所指的部分。当一个正交群在两种比较中都具有DE时，第一个上标字母表示时间依赖性文氏图的交集（图5a），第二个上标字母（用逗号分隔）表示浇水制度文氏图的交集（图5b）。ALMT（铝依赖性苹果酸转运蛋白）；ARF（生长素响应因子）；bZIP（碱性区域亮氨酸拉链结构）；LEA（晚期胚胎发生丰富蛋白）；LHCB（叶绿素a-b结合蛋白）；LHY（晚期伸长的下胚轴）；NAD-MDH（NAD依赖性苹果酸脱氢酶）；NAD-ME（NAD依赖性苹果酸酶）；NIP（类nodulin 26内在蛋白）；OEE（氧气释放增强子）；PEPCK（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）；PIF（光敏色素相互作用因子）；PIP（质膜内在蛋白）；PPCK（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）；PPDK（丙酮酸-磷酸二激酶）；PPDK-reg. prot（PPDK调节蛋白）；RUP（UV-B光形态发生抑制剂）；SLAC1（慢型阴离子通道1）；STP（糖转运蛋白）；SUT1（蔗糖转运蛋白1）；TDT（液泡二羧酸转运蛋白）；TIP（液泡内在蛋白）；α-CA（α-碳酸酐酶）；β-CA（β-碳酸酐酶）。共有127个直系群（占25%）在两种物种中均表现出时间依赖性表达，但仅在T. leiboldiana的不同浇水条件下表现出差异表达（见图S4）。其中包含18个与CAM（Crassulacean Acid Metabolism）相关的直系群，然而只有7个直系群中的基因在T. leiboldiana的缺水条件下上调。这些基因包括编码PEPC激酶（PPCK2）的直系群，该酶对CAM光合作用至关重要，因为它能激活主要的羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC，详见第3.5.4节）。此外，还有一个直系群包含抗旱基因YLS9（Müller等人，2017年），以及三个编码与糖酵解和糖异生相关酶的直系群。YLS9在T. vanhyningii的两种浇水条件下均表现出时间依赖性表达，而在T. leiboldiana中仅在干旱条件下表现出弱时间依赖性表达（见图6）。与PPCK2一起，YLS9是少数在T. leiboldiana中表达模式更接近T. vanhyningii的CAM相关基因之一。我们还在分别跨时间和浇水条件分析的差异表达（DE）直系群中搜索了与CAM相关的直系群。在T. vanhyningii和T. leiboldiana中，分别鉴定出97个和75个时间依赖性的DE CAM相关直系群，这些直系群的功能涉及生物钟、糖酵解、气孔运动、抗旱性和水分/糖转运（见表S5和S8）。这些直系群在物种和浇水条件之间的重叠趋势与整个集合相似（51%的基因仅在一个物种和浇水条件下独特）。12个与CAM相关的DE直系群在所有组中都涉及生物钟、光合作用和光系统活性（见表S10，abcd部分）。T. vanhyningii在两种浇水条件下共有46%的CAM DE基因，而T. leiboldiana共有36%，这表明在干旱条件下代谢转变更为明显。在干旱条件下，物种间共享的时间依赖性CAM DE直系群的比例略高于湿润条件（25% vs 22%），但仍占CAM相关DE基因总数的少数。对于在浇水条件下表现出差异表达的直系群，T. vanhyningii和T. leiboldiana中分别有6个和75个CAM相关直系群（见表S8和S11）。只有一个直系群在两个物种间有重叠，其同源基因编码一种可能在C3和CAM型Tillandsia物种间差异表达的亚油酸9S-脂氧合酶（De La Harpe等人，2020年）。脂氧合酶参与茉莉酸的生物合成，茉莉酸在应对各种生物和非生物胁迫中起重要作用（Bachmann等人，2002年）。

3.5.2 Tillandsia vanhyningii中的CAM相关表达
在湿润条件下（SW），T. vanhyningii表现出核心CAM基因PPCK以及与气孔运动、液泡质子泵、苹果酸转运、糖转运和糖酵解相关的基因的时间依赖性差异表达（见表S10）。几个编码与耐旱性相关的晚期胚胎发生丰富蛋白（LEA）的基因（Arumingtyas等人，2013年；Magwanga等人，2018年）也在湿润条件下表现出昼夜表达。46个与CAM相关的时间依赖性DE基因在湿润和干旱条件下都有重叠（见表S8），包括编码PPCK、生物钟调节因子REVEILLE1、β-淀粉酶（淀粉分解）、两个生长素响应因子（ARF，与气孔功能相关；Bouzroud等人，2020年）、两个水通道蛋白和多个LEA蛋白的基因（见表S10），表明来自广泛CAM相关功能的基因在两种条件下表达相似。AVP1是一种辅助液泡中苹果酸转运的次级质子泵，仅在湿润条件下表现出差异表达。一个编码叶绿体苹果酸脱氢酶（MDH）的基因在两种条件下都表现出昼夜表达，尽管仅在干旱条件下显著时间依赖（见图6）。该基因在白天上调，表明其在CAM的日间脱羧过程中起作用。其在T. leiboldiana中的同源基因在任何条件下均未表现出时间依赖性表达。我们还观察到编码糖转运蛋白的基因在两种条件下的时间依赖性表达发生了变化。虽然糖转运蛋白SWEET16仅在湿润条件下表现出显著的时间依赖性表达，但SWEET14仅在干旱条件下表现出差异表达（见图6）。这两个基因在白天都上调，显示出时间依赖性表达。在T. vanhyningii中，很少有CAM相关基因在浇水条件下表现出差异表达。这些基因包括几个编码与糖酵解和糖异生相关酶的基因，以及之前在C3和CAM型Tillandsia之间被描述为差异表达的基因（De La Harpe等人，2020年）。这些基因都不属于核心CAM途径，尽管许多核心CAM酶的基因在缺水条件下表达略有增加（β-碳酸酐酶、NAD依赖性MDH、NAD-ME，见图6），但它们的表达在两种浇水条件下总体相似。

3.5.3 Tillandsia leiboldiana中的CAM相关表达
在湿润条件下，时间依赖性的CAM相关DE基因与通常在非CAM植物中预期会表现出时间振荡的功能相关（如糖酵解和糖异生、糖转运、生物钟调节）。在干旱条件下（WL），29个DE基因与标准条件重叠（见表S10），但许多额外的CAM相关基因变得时间依赖性表达，涉及苹果酸转运、气孔运动、糖代谢、水分转运和淀粉代谢。编码α-碳酸酐酶1（α-CA）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶（PPCK）的基因在夜间上调。SLAC1和两个与气孔功能相关的生长素响应因子在干旱条件下也表现出时间依赖性DE（见表S10，图6）。这些发现进一步强调了在干旱条件下T. leiboldiana激活了CAM循环。此外，大多数在浇水条件下差异表达的CAM相关基因在夜间也能在T. leiboldiana中找到（维恩图c部分），包括编码核心CAM酶PEPC和PPCK的基因（见表S11）。几个编码苹果酸转运蛋白的基因也属于这一组，尽管它们在干旱条件下通常下调，但ALMT10除外（见图6）。在干旱条件下，糖转运基因上调，如编码糖转运蛋白（STPs）和蔗糖转运蛋白1（SUT1）的基因，其同源基因在T. vanhyningii中也表现出上调表达。与气孔功能相关的基因在干旱条件下通常表达更高，但在表达时间上表现出不同行为（见图6）。ARF17和SLAC1在白天上调，而ARF19和TRAB1在夜间上调。

3.5.4 不同物种和浇水条件下PPCK和PPCK同源物及其他CAM相关基因家族的昼夜表达
PEPC和PPCK同源物的转录本丰度显示出多种表达模式。基因Tfasc_v1.16311-RA是PPCK1-M1的同源物（见图S5a），之前被鉴定为T. fasciculata中的CAM相关波动拷贝（Groot Crego等人，2024年），但在T. vanhyningii中未显示出明显的昼夜表达变化（见图7）。在T. leiboldiana中，其同源物在夜间略有增加，但在任何条件下均未显著差异表达。然而，PPCC1-M1在T. vanhyningii中的表达明显高于T. leiboldiana。其余已知的PEPC基因在两种物种中的表达通常低于PPCC1-M1，但在干旱条件下似乎被激活，即在T. vanhyningii中的PPCC1-M2（无显著差异），以及在T. leiboldiana中的PPCC2。图7显示了Tillandsia vanhyningii（左图）和T. leiboldiana（右图）中所有编码PEPC和PEPC激酶（PPCK）的同源基因的转录本丰度（以“每百万转录本”（TPM）计），在两个时间点和两种浇水条件下。TPM值转换为对数尺度。基因名称的颜色反映了它们的差异表达状态：蓝色=在浇水条件下差异表达，绿色=在时间点间差异表达，黑色=在两种比较中都差异表达，灰色=无差异表达。基因名称后的上标字母表示该基因所属的维恩图的交集。对于注释的PEPC激酶（PPCKs），在T. vanhyningii中，PPCK2同源物在两种浇水条件下都表现出最强的昼夜表达。虽然其在T. leiboldiana中的夜间表达不强，但在干旱条件下表达显著增强（见图7）。NAD依赖性苹果酸脱氢酶（NAD-MDH，OG0001548）之前被鉴定为CAM相关（Groot Crego等人，2024年），对CAM的夜间羧化过程至关重要。该基因在A. comosus、T. fasciculata和T. leiboldiana中有两个拷贝（见图S7a）。在这项研究中，这两个拷贝均未显示出显著差异表达。一个拷贝在夜间表达增加，而另一个在白天表达增加（见图S7b），两者在两种物种的干旱条件下都表现出轻微上调表达。尽管时间依赖性表达模式相似，但这种常驻CAM植物的这些基因和其他编码核心CAM酶的基因的表达显著更高。

3.6 对水分限制的总体响应描述
T. leiboldiana中浇水条件依赖性DE基因的GO（Gene Ontology）富集显示了明显的干旱响应，其中上调的基因与水分剥夺和ABA信号传导有关。在干旱条件下下调的过程表明代谢总体关闭，如光合作用、转运和生物合成过程（见图8a，表S12）。相比之下，T. vanhyningii的干旱相关响应最小，光合作用或水分剥夺基因的调控没有显著变化。然而，一些富集的GO术语表明其干旱响应有限，包括肌醇、茉莉酸和钼酸盐代谢（见图8b，表S12）。图8总结了Tillandsia leiboldiana（a）和T. vanhyningii（b）在浇水条件下DE基因中显著富集的GO术语（BP，Biological Process）。每个条形图结合了白天和夜间的GO术语富集情况。条形图显示了每个富集GO术语的显著性，p值经过多重检验调整后以对数尺度表示。颜色梯度表示每个GO术语下基因的上调和下调，以对数尺度上的倍数变化z分数表示。GO术语按在水分限制条件下最上调到在标准条件下最上调的顺序显示。我们检测到32个与干旱响应和水分剥夺相关的直系群，在物种、浇水条件和时间点之间差异表达。其中8个在T. leiboldiana中在干旱条件下上调，而在T. vanhyningii中下调（见表S12）。上调的直系群编码三种LEA蛋白、一种参与ABA信号传导的磷酸酶2C（Jung等人，2020年）、一种与ROS清除相关的半乳糖醇-蔗糖半乳糖基转移酶（Nishizawa等人，2008年）、一种在应激条件下提供氧化保护的 annexin（Konopka-Postupolska等人，2009年）以及蛋白质YLS9（见第3.5.1节）。在T. vanhyningii中，只有5个与干旱诱导的应力相关的直系群在浇水条件下差异表达，其中3个在干旱条件下上调：一种肌醇-3-磷酸合成酶、一种参与茉莉酸生物合成的12-氧代植物二烯酸还原酶和一种钼酸盐离子转运蛋白。与T. vanhyningii中在浇水条件下差异表达的干旱相关基因数量较少相比，T. leiboldiana中有18个在时间点间差异表达。然而，其中16个在湿润条件下已经表现出时间依赖性表达。几个同源基因在T. vanhyningii中的表达总体上高于T. leiboldiana。例如，编码LEA蛋白5和8的基因在T. vanhyningii中表达更高，并在两种浇水条件下都表现出昼夜振荡，其表达在夜间增加（见图S12）。与ABA信号传导相关的同源基因在T. vanhyningii中在两种浇水条件下都表现出时间依赖性表达（磷酸酶2C除外），在某些情况下也在T. leiboldiana中如此（见图S12）。一种参与ABA生物合成的9-cis-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）在T. vanhyningii中也表现出昼夜表达变化。这些发现表明，高表达和/或昼夜表达的干旱相关基因可能是常驻CAM植物的固有特征。

4 讨论
CAM与许多植物家族的多样化有关，被认为是凤梨科（Bromeliaceae）的关键创新（Benzing 2000；Ogburn和Edwards 2009；Quezada和Gianoli 2011；Silvera等人2009）。然而，其进化轨迹以及不同CAM形式之间的遗传重叠程度尚不完全清楚（Edwards 2023）。蒂兰迪西亚亚属（Tillandsia）展示了广泛的CAM（Crassulacean Acid Metabolism，即景天酸代谢）表型（Crayn等人，2015年；De La Harpe等人，2020年），但这种多样性至今仅被部分研究，主要通过碳同位素比值和标准条件下的转录组学进行分析。通过比较两种蒂兰迪西亚物种在水分限制下的生理和转录组学响应，我们旨在探索这一组中的CAM表型范围，并评估兼性和组成性CAM在多大程度上依赖于共同的转录机制。

4.1 蒂兰迪西亚·莱博迪安娜（Tillandsia leiboldiana）是一种兼性CAM植物

我们的气室（TA）分析、气体交换和差分气体交换（DGE）分析表明，T. leiboldiana具有潜在的CAM循环，该循环在干旱胁迫下被激活。首先，水分限制导致夜间TA（一种有机酸）的积累虽然较弱但显著，而在水分充足的植物中则没有这种现象。夜间酸化是CAM的一个诊断特征（Winter和Smith，2022年），并且之前已被用于识别Clusia（Borland等人，1992年）、Mesembryanthemum（Winter和Ziegler，1992年）和Agave（Heyduk等人，2016年）中的兼性CAM。其次，我们观察到在停止供水4天后，夜间净CO2吸收开始增加，而在重新供水后白天吸收量完全恢复（图3b）。夜间净CO2吸收是CAM的另一个标志，表明气孔开放并且CO2以苹果酸的形式储存在液泡中（Lüttge，1987年），这与我们的TA测量结果一致。尽管夜间CO2吸收的幅度较低，但这种模式与其他干旱条件下的兼性CAM植物相当。在干旱胁迫下的Clusia pratensis、Calandrinia polyandra、Talinum triangulare和Cistanthe cachinalensis中也观察到了类似的模式（Winter和Holtum，2014年；Chomentowska等人，2025年）。转录组学特征进一步支持了T. leiboldiana的气孔行为改变。在不同灌溉制度下气孔功能基因的差异表达表明，其气孔行为发生了变化，尽管这可能反映了普遍的干旱胁迫反应，而不仅仅是CAM特有的活动。例如，参与干旱胁迫期间ABA信号传导的TRAB1基因在T. leiboldiana夜间上调（Hobo等人，1999年；Zhu，2002年）。然而，控制气孔关闭的保卫细胞阴离子通道SLAC1在夜间下调（Vahisalu等人，2008年），这可能表明夜间气孔是开放的。第三，T. leiboldiana在夜间PPCK2基因的上调表明，夜间PEPC（Phosphoenolpyruvate Carboxylase）活性所需的磷酸化调控机制被诱导——这种模式在SW（Standard Watering）条件下完全不存在。T. leiboldiana的碳同位素比值（δ13C = ?28.0至?31.3；Crayn等人，2015年；De La Harpe等人，2020年）通常会将其归类为C3植物。然而，同位素值可能会掩盖兼性CAM活动，正如在其他凤梨科植物如Guzmania和Ronnbergia中观察到的那样（Pierce等人，2002年）。因此，我们的综合研究表明，T. leiboldiana并非严格的C3植物，而是一种在正常条件下进行C3光合作用、在干旱条件下表现出弱CAM功能的兼性CAM植物。在不同灌溉制度下，核心CAM途径基因的表达变化很小，这进一步表明这些基因的高转录丰度可能是Tillandsia中兼性CAM表达的前提条件。这引发了一个进化问题：CAM在蒂兰迪西亚亚属中的起源是什么？使用碳同位素数据进行的祖先状态重建支持该亚属具有C3祖先（De La Harpe等人，2020年），并且CAM在该支系中有多个独立的起源。然而，T. leiboldiana中存在的可诱导CAM表明，至少部分CAM循环可能在导致T. leiboldiana和T. vanhyningii的分化之前就已经存在。尽管我们的成对设计不能排除兼性和组成性CAM的独立起源，但它强调了需要更广泛的比较数据集。

4.2 T. vanhyningii对水分限制的生理和转录组学反应最小

我们的生理和转录组学分析表明，T. leiboldiana对水分限制的定量反应远大于T. vanhyningii（图2-4），这表明T. leiboldiana的新陈代谢受到水分剥夺的影响，而T. vanhyningii在不同条件下的新陈代谢似乎基本相同，因此没有受到显著的压力。T. vanhyningiana在不同灌溉制度下的TA积累方式相似，尽管在水分限制条件下夜间积累速度更快。这与对T. ionantha的研究结果一致，后者在6个月的水分限制后仅表现出轻微的生理变化，这归因于白天气孔关闭、低气孔密度以及通过其密集的毛状体层高效吸收大气水分（Nowak和Martin，1997年；Ohrui等人，2007年）。在T. vanhyningii中，只有很少的基因在不同灌溉制度下表现出差异表达（DE），而在T. leiboldiana中检测到了显著的响应。在T. vanhyningii中，WL（Water Limiting）条件下上调的GO（Gene Ontology）术语包括肌醇、茉莉酸和钼酸盐的代谢（图8b，表S12），这些都在干旱胁迫响应中起作用（Li等人，2022年；Loewus和Murthy，2000年；Wasternack，2014年）。然而，许多与干旱和非生物胁迫响应相关的基因在T. vanhyningii中的表达是时间依赖的，或者在SW条件下比T. leiboldiana更高表达，包括ABA生物合成和信号基因或LEA蛋白基因。De La Harpe等人（2020年）观察到组成性CAM表型与ABA相关基因的时间表达之间存在关联。ABA信号传导在响应水分剥夺时在气孔关闭中起重要作用（Assmann和Jegla，2016年；Christmann等人，2006年；Wilkinson和Davies，2002年），但也与CAM光合作用的调节有关（Mioto和Mercier，2013年；Ting，1981年）。我们的发现证实，ABA相关基因的时间依赖性表达是组成性CAM表型的特征，并不一定表明T. vanhyningii在我们的实验中受到干旱胁迫。关于WL条件下的CAM相关响应，我们的发现表明T. vanhyningii中CAM相关基因的表达基本保持不变。然而，在某些情况下，例如糖转运蛋白SWEET16和SWEET14，在不同的灌溉制度下招募了执行相同功能的不同基因。像T. vanhyningii这样的“大气”蒂兰迪西亚代表了凤梨科植物中最极端的附生生活方式适应形式，它们几乎失去了通过根部吸收水分的能力（Benzing，2000年；Crayn等人，2004年）。它们生活在干旱环境中，都是组成性CAM植物，这表明CAM是这一组的关键创新（Crayn等人，2004年）。我们的发现证实，大气蒂兰迪西亚具有耐旱性，这一点之前已经通过生理学研究得到证实（Castillo等人，2016年；Martin，1994年；Nowak等人，1997年；Stiles和Martin，1996年），现在也在转录组水平上得到支持，因为T. vanhyningii仅受到轻微的水分限制条件影响。然而，虽然这可以归因于T. vanhyningii的组成性CAM表型，但大气蒂兰迪西亚的其他典型特征，如密集的毛状体层，也需要被视为其耐旱性的重要因素。

4.3 光合作用代谢的共享与非共享转录结构

尽管T. vanhyningii和T. leiboldiana的分化相对较新（Barfuss等人，2016年；Mendoza等人，2017年；Yardeni等人，2025年），这两个物种在生理和转录组学上显示出明显的差异，这与不同的光合作用表型一致。仅在两个物种之间发现了有限的时间依赖性和水分依赖性DE（Differential Expression）基因重叠，这与其他CAM谱系（如Agavoideae）的观察结果相似（Heyduk等人，2022年）。大多数与CAM相关的、时间依赖性的DE基因仅在一个物种中表现出昼夜表达周期（图9）。尽管T. leiboldiana在WL条件下似乎激活了CAM，但其潜在的转录组结构与T. vanhyningii的组成性CAM模式有显著不同。值得注意的例外是PPCK2（图7和9）和与干旱相关的蛋白质YLS9，它们在T. vanhyningii和干旱胁迫下的T. leiboldiana中表现出相似的时间依赖性表达。这种有限的重叠表明，这些物种的兼性和组成性CAM循环依赖于不同的转录解决方案，而不是共同途径的表达水平调节。图9展示了CAM途径的示意图（改编自Groot Crego等人，2024年），概述了Tillandsia vanhyningii和T. leiboldiana在标准灌溉和水分限制条件下的CAM相关基因表达。酶显示在框内，而途径产物在框外以粗体显示。CAM代谢途径的酶成员以橙色显示，而气孔和昼夜调节因子以黄色突出显示。气孔调节因子位于细胞外的左侧，昼夜调节因子位于右侧。符号表示这些基因在本研究中的时间比较（时钟符号）或不同灌溉制度之间的差异表达（浇水符号）。符号的颜色表示在哪个物种中检测到差异表达，而两种颜色的渐变表示在两个物种中都检测到差异表达。“不同同源物”表示这些物种在基因家族的不同同源物中表现出类似CAM的表达。“共享表达”表示在不同条件下的表达模式高度相似。ARF是生长素响应因子；CA是碳酸酐酶；GI是GIGANTEA蛋白；LHY是晚伸长的下胚轴；MDH是苹果酸脱氢酶；PEPC是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；PEPKK是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；PPCK是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；RVE1是REVEILLE 1；SLAC1是慢型阴离子通道1；SUT1是蔗糖转运蛋白1。这得到了PEPC基因家族成员在不同表达模式的支持，PEPC是核心CAM基因。在WL条件下，T. leiboldiana中的PPCK2同源物上调，而在T. vanhyningii中所有条件下都表达较低。由于本实验中的采样时间与这些基因的峰值表达时间不同步，因此很难确认PPCK2在T. leiboldiana的干旱胁迫下是否活跃。在T. fasciculata和Agave中，PEPC基因表达在黄昏时达到峰值，而本研究的样本是在黄昏后4小时采集的（Abraham等人，2016年；Groot Crego等人，2024年）。虽然在大多数CAM植物谱系中，包括T. fasciculata（Groot Crego等人，2024年）和A. comosus（Ming等人，2015年），招募到CAM途径中的PEPC同源物是PPC1，但在Yucca aloifolia（Heyduk等人，2022年）和Isoetes taiwanensis（Wickell等人，2021年）中也提出了PPCK2的招募。这支持了PEPC同源物在CAM谱系内可以灵活进化的观点。另一个在T. leiboldiana的WL条件下表现出时间依赖性表达增加的核心CAM基因是α-碳酸酐酶（α-CA，图S11）。碳酸酐酶将CO2转化为HCO3?，这是CAM光合作用中的第一步。然而，在菠萝中，调节CAM的是β-CA（Ming等人，2015年），而T. vanhyningii没有表现出这种基因的时间依赖性表达。在几种Yucca物种中，α-CA在水分限制条件下表现出时间依赖性表达（Heyduk等人，2019年）。T. leiboldiana中PPCK2和α-CA的CAM样表达表明，不同物种招募了不同的基因和同源物进入CAM途径（图9）。除了PPCK、PPCK2和α-CA之外，核心（脱）羧化模块在物种间相对保守。然而，其他CAM相关过程（图9），如苹果酸运输、糖运输、气孔调节、水通道和淀粉代谢，在物种间表现出显著的转录组差异。总体而言，实现的CAM表型是由核心基因的保守模式和外围基因的谱系特异性变化共同支持的。

5 结论

本研究显示，蒂兰迪西亚亚属中最接近C3的成员T. leiboldiana并非完全的C3植物，而是一种弱兼性CAM植物。相比之下，T. vanhyningii表现出强烈的生理和转录组学耐旱性，与其组成性CAM表型和附生生活方式一致。尽管这些密切相关的物种在水分限制下夜间积累了有机酸，但它们采用了截然不同的转录结构，特别是在核心CAM（脱）羧化模块之外。这表明，连接兼性和组成性CAM的进化轨迹涉及网络外围部分的广泛转录重布线，而不仅仅是定量上调。