与幼年金头鲷（Sparus aurata）vgll3基因变异相关的基因型依赖性转录组差异

《Molecular Ecology》：Genotype-Dependent Transcriptome Divergence Associated With Variation at vgll3 in Juvenile Gilthead Seabream (Sparus aurata)

　　摘要

早期发育过程显著影响生长和成熟模式，这些水养殖特征对于生理适应性和生产力至关重要。类似退化基因的家族成员3基因（vgll3）在包括哺乳动物和硬骨鱼类在内的多种生物类群的生长和成熟过程中起着关键作用。vgll3中的单核苷酸多态性（SNPvgll3）在水养殖条件下显示出选择压力的证据，这一点通过之前的基因组扫描和靶向转录组学（qPCR）分析得到了证实。本研究调查了不同的SNPvgll3基因型（AA、AG和GG）如何影响幼年金头鲷鱼的基因表达。研究发现，与AA基因型个体相比，GG基因型的转录组谱（超过240个量化转录本）显示出显著的差异，且vgll3的表达水平也明显较低。在其他硬骨鱼类中，较低的vgll3表达与改善的身体状况和改变的成熟时间有关。与这些发现一致，我们的转录组分析还发现了参与生长调节、发育过程和性成熟的额外基因的差异表达，例如amh、cacng1b、casq2、tnnc2和igfn1.1等基因，这些基因在硬骨鱼类的青春期启动和肌肉生理中起着重要作用。总体而言，我们的发现支持vgll3在与体细胞生长和生殖成熟相关的途径中具有保守作用，尽管其确切的机制功能仍有待确定。这种明显的基因型特异性转录组差异在人类和植物中已有充分记录，但在鱼类等非模式物种中仍鲜有研究，这引发了关于潜在进化和发育机制的重要问题。未来结合表型变异、组织特异性表达和多个发育阶段的研究对于进一步阐明基因型依赖性调控效应的基础至关重要。

1 引言

理解物种和环境之间表型多样性的分子机制仍然是生物学中的一个核心挑战。虽然蛋白质编码突变传统上被认为会改变基因功能，但越来越多的证据表明，调控变异可以显著影响生理过程，从而塑造生物体的适应性和表型特征（Ahi等人2022；Ahi, Verta等人2025a；Albert和Kruglyak 2015；Jiang等人2020；Moulistanos等人2024；Verta等人2020）。由于这些调控变异的影响微妙且非编码元件在复杂的调控网络中相互作用复杂（Paul等人2014；Rojano等人2019），因此识别它们具有挑战性。在这种情况下，转录因子作为调控信号的整合者至关重要，它们协调基因表达模式，决定了表型结果（Weidemüller等人2021）。对商业重要鱼类物种的研究极大地促进了我们对基因调控和表型多样性的理解。在大西洋鲑鱼（Salmo salar）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中的比较转录组学研究揭示了面对环境和生理挑战时保守的分子反应，推动了核心生物知识的进展，超出了水养殖应用的直接范围（Ellison等人2018, 2020；Beemelmanns等人2021；Krasnov等人2021）。在养殖鲑鱼中的转录组分析揭示了代谢、免疫和发育背后的调控网络（Jiang等人2020），而在集约化养殖的硬骨鱼类中的基因组分析发现了与关键生活史特征相关的广泛遗传变异和调控元件（Sinclair-Waters等人2020；Moulistanos等人2024）。总体而言，这些系统已成为强大的比较模型，扩展了分子生态学的系统发育和机制范围，并提供了与经典模式生物相当的基本见解。在金头鲷鱼（Sparus aurata Linnaeus, 1758）中，阐明控制发育和生长的分子因素对于生命史理论至关重要，在该理论中，特征由关键发育转变（如体细胞生长、成熟和性别分化）的时间决定（Chavanne等人2016；Teletchea 2021）。影响这些转变的遗传和生理变异产生了生命史权衡，例如生长和繁殖之间的资源分配、成熟时的年龄和大小变化以及不同的繁殖途径。金头鲷鱼的生长相关特征源于环境、遗传和生理因素之间的相互作用，每个因素都参与了肌肉发育的复杂调控——这是决定体型和质量的主要因素（Birnie-Gauvin等人2021；Mohammadabadi等人2021；Moya等人2019；Rodgers和Gomez Isaza 2024）。在这种情况下，水养殖代表了一种强大且高度定向的选择机制，在这种机制下，以生长为导向的管理和受控的饲养条件可以系统地改变发育时间和资源分配，从而重塑生命史权衡（Chavanne等人2016；Janssen等人2017；Milla等人2021；Teletchea 2021）。这样的条件为研究调控遗传变异如何影响这些权衡背后的分子机制提供了独特的机会（Roff 2007）。一个特别有前景的候选基因是类似退化基因的家族成员3（vgll3）。vgll3编码一种转录共因子，它在多种生物类群中调节包括生长和成熟在内的多种生活史特征，强调了其在进化上的保守作用。在哺乳动物中，vgll3与人类的青春期身高增长和初潮年龄有关（Cousminer等人2013；Perry等人2014），以及小鼠的体重调节和生殖腺脂肪含量（Halperin等人2013）。在大西洋鲑鱼（Salmo salar Linnaeus, 1758）中，vgll3中的一个单核苷酸多态性（SNP）与身体状况相关（Debes等人2021），同时它在成熟时间中也起着重要作用（Barson等人2015）。在非鲑鱼物种如斑马鱼（Danio rerio, Hamilton, 1822）中，vgll3被认为与早期发育过程中的生长有关（Pennonen 2017）。最近在金头鲷鱼和欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax Linnaeus, 1758）中的研究表明，vgll3可能是一个与养殖相关的位点，进一步强化了其在确定水养殖物种生长调节中的保守功能（Moulistanos等人2023）。重要的是，vgll3是Hippo信号通路中一个特征明确的转录共因子，这是一个深度保守的调控级联，整合了控制细胞增殖、器官生长、能量平衡和环境感知的信号。VGLL3与TEA结构域（TEAD）转录因子相互作用，调节广泛的下游基因（Hori等人2020；Mesrouze等人2020；Mesrouze和Chène 2024），从而影响发育时间和组织生长。在脊椎动物中，Hippo通路已成为生命史特征的中心调节器，包括生长率、成熟时间和生殖投资特征，这些特征对生命速度的变化至关重要（Ahi, Panda和Primmer 2025）。最近的研究将vgll3定位为连接Hippo信号与成熟和生长决策的关键中介，特别是在环境条件影响发育轨迹时（Barson等人2015；Ahi, Verta等人2025a, 2025b, 2025b；Halperin等人2013；Debes等人2021）。由于该通路对能量可用性、营养状态和种群密度等线索作出反应，vgll3的变异在水养殖条件下可能产生显著影响，其中以生长为导向的选择和饲养环境相互作用，影响生命史权衡。将vgll3置于Hippo信号网络中为解释基因型特异性的转录差异提供了机制基础，并强调了这一位点的变异如何通过更广泛的调控网络传播，而不仅仅是孤立作用。基于这些发现，金头鲷鱼中vgll3的一个同义SNP（SNPvgll3：AA、AG和GG）在野生和养殖种群之间的基因型和等位基因频率存在显著差异（Moulistanos等人2023）。在希腊种群中，G等位基因在养殖鱼类中更为常见，而在地中海地区的分析表明，这种模式在多个野生和养殖种群中都是一致的，跨越了遗传上不同的种群，而不仅仅局限于一个地点（Moulistanos等人2023；Pe?aloza等人2021；Moulistanos 2025）。尽管养殖种群之间的独立性程度尚不完全清楚，且一些可能源于共同的孵化场，但这些模式支持G等位基因是水养殖条件下基因型特异性差异的候选者。qPCR分析显示，在幼年金头鲷鱼中，SNPvgll3基因型之间的vgll3表达存在显著差异，其中GG基因型在养殖种群中最常见，表达水平较低（Moulistanos等人2025）。有趣的是，在大西洋鲑鱼中，较低的vgll3表达与雄性成熟概率增加和发育第一年的鱼体长度增加有关（Verta等人2020）。尽管这些跨物种的相似性很有趣，但金头鲷鱼的数据仅来自单个时间点的整个身体幼体样本，因此对vgll3在物种间的功能保守性提供的支持有限。在这项研究中，我们对孵化后69天的幼年金头鲷鱼进行了全面的基因型特异性转录组分析，以研究与养殖相关的vgll3 SNP（SNPvgll3）的分子后果。我们分析了每个基因型（AA、AG和GG）的四个个体，这些个体之前通过qPCR被鉴定为具有不同的vgll3表达水平（Moulistanos等人2025）。我们的主要目标是通过差异表达分析识别和表征基因型特异性的转录谱，从而阐明与vgll3变异相关的生物过程、分子功能和调控途径。我们假设不同的vgll3基因型将伴随着更广泛的转录组变化，反映了可能由养殖相关选择压力塑造的发育程序的改变。最终，我们旨在超越单基因分析，揭示支撑生物学、进化和经济重要特征的广泛调控网络。

2 材料与方法

2.1 采样

总共收集了50条金头鲷鱼幼体，它们都来自同一批次，并在同一水养殖设施中饲养，采集时间为孵化后69天（dph）。由于合作孵化场的限制，我们无法获得详细的系谱信息，包括家族结构和亲本数量。尽管如此，所有采样的个体都在相同的环境条件下饲养，最小化了环境变异作为观察到的转录差异的混淆因素。幼体在受控条件下饲养，温度为19°C，盐度为40‰，pH范围为7.6至7.8，O2饱和度为6–7 ppm。采样后，幼体立即用RNAlater稳定溶液（Invitrogen，Waltham，美国）保存，并储存在-20°C直至进一步处理。

2.2 基因分型

使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific）（Rio等人2010）进行单个个体的DNA提取。然后使用引物5′AACGTCTATCACCCTCACCC3′和5′ACCAAACTGACGTCTTTGCT3′（Moulistanos等人2023）对vgll3 SNP区域进行PCR扩增。总反应体积为25 μL，包含100 ng的基因组DNA作为模板，0.05单位的Qiagen Taq聚合酶，2 mM的dNTPs，每种引物1 μM，以及2.5 μL的10× Reaction Buffer（Qiagen，Hilden，德国）。PCR条件如下：初始变性在94°C下进行2分钟，35个循环的变性在94°C下进行30秒，退火在63°C下进行40秒，延伸在72°C下进行1分钟，最后在72°C下进行10分钟的延伸。PCR产物通过1.5%（w/v）琼脂糖凝胶进行电泳，然后外包给Genewiz Company（Leipzig，德国）进行酶清洁和Sanger测序。SNPvgll3（S. aurata 9:24911884）的基因分型是通过将得到的序列与GenBank中的参考序列（组装S. aurata: GCA_900880675.1）对齐来进行的，使用Geneious v.10.2.6程序（Kearse等人2012）。

2.3 RNA提取和测序

使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）（Rio等人2010）从整个幼年金头鲷鱼中提取总RNA。总共选择了12个个体（每个SNPvgll3基因型：AA、AG、GG）进行mRNA测序，这些个体之前已经通过qPCR进行了vgll3表达的基因分型（Moulistanos等人2025）。通过1.5%琼脂糖凝胶的电泳和光谱定量（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）确认了RNA的质量和完整性。RNA样本外包给Novogene（欧洲，英国）进行链特异性mRNA文库制备，使用poly-A选择，然后在Illumina NovaSeq平台上进行双端测序（150-bp读取）。

2.4 mRNA转录组分析

使用Trimmomatic v.0.38（Bolger等人2014）对原始RNA-Seq数据进行质量修剪，以去除低质量读段和适配器序列。修剪以双端模式进行，参数如下：ILLUMINACLIP:Illumina adaptors file.fa:2:30:10；SLIDINGWINDOW:3:20；MINLEN:50。过滤后的读段被映射到金头鲷鱼参考基因组（GCF_900880675.1），使用HISAT2（Kim等人2019）。使用R函数‘prcomp’通过主成分分析（PCA）可视化基因型特异性的转录谱。基因表达数据通过对样本进行log2转换和Z分数标准化，并使用‘pheatmap’ R包生成的层次聚类和欧几里得距离进行进一步可视化。使用Bioconductor包‘metaseqR2’（Fanidis和Moulos 2021；Moulos和Hatzis 2015）进行差异基因表达分析，p值使用Benjamini和Hochberg方法进行调整以控制假发现率（FDR）。如果调整后的p值（padj）低于0.05，则认为转录本是差异表达的。所有可视化都在R v.4.4.1（R Core Team 2021）中生成。

2.5 功能注释和富集分析

从金头鲷鱼参考基因组组装GCF_900880675.1中检索差异表达基因（DEGs）的序列。这些序列用于通过局部BLAST搜索（https://www.ensembl.org/Multi/Tools/Blast）识别斑马鱼的同源基因。斑马鱼的直系同源基因随后被用于功能注释和富集分析，因为与其他硬骨鱼类相比，它们的注释质量和完整性更优（Primmer等人，2013年）。对于每个差异表达基因（DEG），选择得分最高的斑马鱼基因作为潜在的同源基因，使用E值阈值10^-3。基因本体（GO）和通路富集分析使用g:Profiler进行，以斑马鱼基因组作为参考（https://zfin.org/）。应用Benjamini-Hochberg方法来校正多重检验（padj < 0.01）。为了确定生物学上有意义的（以下简称“过度表达的”）GO术语，使用了g:Profiler的两阶段算法（Kolberg等人，2023年）。该算法通过将相似的GO术语聚类成生物学上有意义的组来有效减少冗余，从而提高可解释性。它还突出了统计上最稳健和“过度表达”的术语，提供了对潜在生物学过程和功能的更清晰见解（Kolberg等人，2023年）。所有DEG的启动子序列进一步使用g:Profiler和TRANSFAC数据库分析了转录因子结合位点（TFBS）的富集情况。斑马鱼直系同源基因之间的相互作用最初基于STRING版本12.0的共表达进行分析，使用默认设置（中等置信度=0.4）（Szklarczyk等人，2022年），目的是捕捉DEG之间的协调转录反应，并识别以一致方式转录调控的基因模块。因为共表达反映了表达水平上的共同调控和功能耦合，这种方法提供了直接基于观察到的RNA-seq谱型的数据驱动的网络组织视图。同时，通过结合实验验证和数据库整理的相互作用，构建了一个互补的整合网络。这个整合网络扩展了基于共表达的框架，使得能够识别出DEG之间的额外连接基因和潜在的枢纽节点，并为解释观察到的转录模块提供了更广泛的功能背景。

3 结果
所有分析的样本都产生了高质量的转录组数据，每个样本产生了超过4800万个读段。经过质量过滤和与参考基因组对齐后，超过90%的读段被唯一映射。这种高映射效率确保了数据集的稳健性，适合进行下游的差异表达和聚类分析（补充文件1）。每个SNPvgll3基因型的四个重复转录组的PCA在95%置信区间内显示了两个不同的组，区分了AA和GG基因型。杂合AG个体的转录组谱与GG基因型有显著重叠（图1a）。层次聚类分析进一步支持了PCA的结果，表明样本主要按基因型分组（图1b）。热图显示了不同的表达模式，AA和GG基因型形成了独立的簇，而AG样本表现出与GG基因型更接近的中间表达谱。这些分析共同表明，幼年鲷鱼的转录组谱存在显著的基因型依赖性差异。图1（在图形查看器中打开）PowerPoint
(a) 不同SNPvgll3基因型的鲷鱼幼体基因表达数据的主成分分析（PCA）。椭圆表示每个基因型的95%置信区间。(b) 显示Z分数标准化基因表达的热图，并对样本进行层次聚类。行代表基因，列代表按基因型着色的单个样本。紫色到橙色的颜色强度反映了表达水平，紫色代表较高的表达，橙色代表较低的表达。热图上方（样本）和左侧（基因）的树状图显示了基于共享表达模式的表达谱相似性，将个体和基因聚类在一起。与这些观察结果一致，在AA与GG基因型比较中鉴定出了最多的DEG（244个DEG；补充文件2），远远超过了其他基因型比较中的数量（AA与AG之间有135个DEG，AG与GG之间有41个DEG；图2a）。有趣的是，在养殖相关的GG基因型中，大多数DEG表达下调（218个下调，26个上调；图2b）。表1总结了九个最具统计学意义的DEG的调整后p值和对数2倍变化。值得注意的是，在AA与GG比较中鉴定出的167个DEG是这一对比中独有的，占所有基因型比较中鉴定出的DEG总数的68.5%（图2a）。在这些独特的DEG中，有154个在养殖相关的GG基因型中下调。图2（在图形查看器中打开）PowerPoint
(a) 文氏鱼幼体SNPvgll3基因型之间差异表达基因（DEGs）分布的维恩图。数字代表每个比较中独有的DEGs以及在不同比较中共有的DEGs，突出了特异性和重叠。(b) 火山图显示了AA与GG基因型比较中鉴定出的DEGs。在GG基因型中显著下调的基因（padj < 0.05）用橙色表示，而在GG基因型中显著上调的基因（padj < 0.05）用紫色表示。没有显著差异表达的基因（padj > 0.05）用灰色表示。表1. 在AA与GG文氏鱼幼体基因型之间鉴定出的九个最具统计学意义的差异表达基因（DEGs）。所有对数2倍变化值都是负数，表明这些基因在养殖GG基因型中的表达低于AA基因型。padj是调整后的p值（Benjamini-Hochberg多重检验校正），对数2倍变化是AA与GG基因型之间表达变化的对数（以2为底）。基因名称（S. aurata）
直系同源基因名称（D. rerio）
p
adj
对数2倍变化

对AA与GG比较中鉴定出的244个DEGs的富集分析揭示了30个显著的基因本体（GO）术语，其中八个术语被认为是最“过度表达”的基因集（表2）。这些术语主要表明与组织结构和组织相关的角色，值得注意的例子包括收缩纤维（GO:0043292；padj = 3.572e-6）和胶原三聚体（GO:0005581；padj = 2.538e-5），强调了肌肉组织的结构和功能方面。值得注意的是，通路富集分析还确定了肌肉收缩（R-DRE-397014；padj = 2.137e-3）是唯一显著富集的通路（表2）。对启动子序列的基序富集分析显示了几种转录因子的显著富集的转录因子结合位点（TFBSs），包括Pax-6、MEIS1B/HOXA9、DLX2和FOX家族成员（表S1），表明这些可能是观察到的基因表达变化的潜在上游调节因子。表2. 与AA和GG SNPvgll3基因型之间的差异表达相关的八个最“过度表达”的基因本体（GO）术语和分子通路。术语大小指的是参考数据库中与每个GO术语或通路相关的基因总数。鉴定出的基因数量表示在分析中被鉴定为差异表达基因的每个术语的基因子集。padj是调整后的p值（Benjamini-Hochberg多重检验校正）。术语名称
p
adj
术语大小
鉴定出的基因数量

细胞外基质结构成分（分子功能；GO:0005201）
5.476e-6
58
8

肌肉收缩（生物过程；GO:0006936）
1.073e-3
102
8

细胞外基质组织（生物过程；GO:0030198）
1.664e-3
89
7

肌肉细胞分化（生物过程；GO:0042692）
1.696e-3
130
8

解剖结构发育（生物过程；GO:0048856）
1.696e-3
2517
40

收缩纤维（细胞成分；GO:0043292）
3.572e-6
84
9

胶原三聚体（细胞成分；GO:0005581）
2.538e-5
20
5

肌肉收缩（反应组；R-DRE-397014）
2.137e-3
172
10

基于AA与GG比较中DEGs的互作组分析进一步提供了功能相互作用的见解。具体来说，这项分析识别了六个不同的基因互作网络。在这些网络中，我们专注于包含12个基因的最大网络，因为包含较少基因（每个2-4个基因）的网络提供的生物学解释不够全面。在这个12个基因的网络中（图3a），所有基因在养殖相关的GG基因型中都一致下调，与AA基因型相比（图3b）。最显著和“过度表达”的GO术语包括钙离子结合（GO:0005509；padj = 4.814e-4）、肌肉系统过程调节（GO:0090257；padj = 1.120e-6）和肌节（GO:0030017；padj = 2.295e-7），从而强调了它们在肌肉生理学中的作用（表3）。此外，通路富集突出了两个相关通路，即肌肉收缩（R-DRE-397014；padj = 2.040e-6）和心脏传导（R-DRE-5576891；padj = 4.920e-5），进一步强调了鉴定出的DEGs的肌肉相关生物学影响（表3）。使用包含实验验证的数据库整理的相互作用的增强互作组扩展了这个网络，增加了七个额外的基因，结果网络在功能GO术语方面仍然同样富集（图S1）。图3（在图形查看器中打开）PowerPoint
(a) 来自AA与养殖相关GG基因型比较中差异表达基因（DEGs）的基因互作网络。节点代表基因，边代表相互作用。边的厚度对应于相互作用的可能性，较厚的边表示更高的置信度（分数范围：0.407–0.732）。节点颜色区分功能类别：绿色表示钙调节（cacng1b, casq1a, casq2, pvalb2, pvalb4），棕色代表肌动蛋白-肌球蛋白动态（tnnc2, tnnt3b, tnnt2e, mybphb, tpma），灰色表示肌肉组织完整性和信号传导（nrap, myoz1a）。(b) 热图显示互作网络中包含的基因的相对表达水平。行代表DEGs，列代表按基因型分组的单个样本。颜色强度表示表达水平，紫色代表较高的表达，橙色代表较低的表达。热图上方（样本）和左侧（基因）的树状图显示了基于表达谱相似性的聚类。表3. 与AA与GG SNPvgll3基因型之间差异表达基因的基因互作网络相关的六个最显著和“过度表达”的基因本体（GO）术语和分子通路。术语大小指的是参考数据库中与每个GO术语或通路相关的基因总数。鉴定出的基因数量表示在分析中被鉴定为差异表达基因的每个术语的基因子集。padj是调整后的p值（Benjamini-Hochberg多重检验校正）。术语名称
p
adj
术语大小
鉴定出的基因数量

钙离子结合（分子功能；GO:0005509）
4.814e-4
833
5 (casq2; casq1a; pvalb2; tnnc2; pvalb4)

肌肉系统过程调节（生物过程；GO:0090257）
1.120e-6
32
3 (casq2; tnnt3b; tnnt2e)

肌节（细胞成分；GO:0030017）
2.295e-7
73
4 (myoz1a; casq2; tnnt3b; tnnt2e)

心肌收缩（KEGG:04260）
2.189e-4
122
3 (cacng1b; casq2; tpma)

肌肉收缩（反应组；R-DRE-397014）
2.040e-6
172
4 (cacng1b; casq2; casq1a; tnnt3b)

心脏传导（反应组；R-DRE-5576891）
4.920e-5
113
3 (cacng1b; casq2; casq1a)

在AG与GG基因型比较中，鉴定出了41个DEGs（图2a）。对这些DEGs的富集分析揭示了主要与视觉和感知过程相关的显著GO术语，包括眼睛晶状体的结构成分（GO:0005212；padj = 1.034e-13）、相机型眼睛中的晶状体发育（GO:0002088；padj = 3.220e-10）和视觉感知（GO:0007601；padj = 2.004e-8）。这些发现主要是由这一基因型比较中的大量（41个中的12个）crystallin基因驱动的。在AA与AG比较中，鉴定出了135个DEGs（图2a）。然而，GO和通路富集分析没有揭示任何统计学上的显著结果。三个DEGs在所有基因型比较中都是共同的（图2a）：cacng1b（钙通道，电压依赖性，γ亚基1b）、igfn1.1（免疫球蛋白样和纤维连接蛋白III型结构域1，串联重复1）和lsp1a（淋巴细胞特异性蛋白1a）。值得注意的是，在纯合基因型（AA与GG）的比较中，这些基因也排在最显著的DEGs之中（表1），并且cacng1b还参与了图3a中描绘的互作网络。这三个基因在AA与GG基因型比较中的表达水平最低（表1）。

4 讨论
我们的发现支持vgll3在研究的发育阶段对鲷鱼具有基因型依赖的调节作用，突显了其在水产养殖条件下快速进化变化中的潜在联系（Moulistanos等人，2023年）。在大西洋鲑鱼中，vgll3作为一个主调节因子，影响数千个与性成熟和生长特征相关的基因，如体长和体况（Ahi等人，2022年；Ahi, Verta等人，2025a；Debes等人，2021年；Kurko等人，2020年）。在小鼠中，vgll3同样影响关键的发育和生理过程，包括肌肉发育（Figeac等人，2019年；Takakura等人，2023年）。与这种进化保守的作用一致，我们的分析在鲷鱼中鉴定出的DEGs中发现了与肌肉相关的生物过程的显著富集（表2和表3）。总体而言，这些相似性表明vgll3在脊椎动物中行使类似的调节功能，包括在不同的硬骨鱼类谱系中，尽管物种特定的生活史特征（例如，鲷鱼的雄先熟性和大西洋鲑鱼的溯河性）可能会调节这些机制的表现方式。具体来说，我们观察到与鲷鱼水产养殖选择相关的SNPvgll3基因型之间存在显著的转录组谱差异（Moulistanos等人，2023年）。养殖相关GG基因型的生物学重复体表现出较低的vgll3表达（Moulistanos等人，2025年），其转录组谱与纯合AA基因型明显不同（图1）。杂合AG基因型的转录组与GG基因型的转录组紧密聚集，而它们与AA基因型的分化程度不如GG和AA基因型之间的分化明显（图1和图2）。这些发现与之前的qPCR分析结果一致，那些分析显示AG和GG基因型的vgll3表达水平相似，但在AA鱼类中显著更高（Moulistanos等人，2025年）。总体而言，这些结果支持G等位基因在下游基因调控中的显性效应，可能掩盖了A等位基因对转录谱的影响（Jiang等人，2020年）。比较纯合基因型（AA vs. GG）的差异表达和互作组分析显示，与肌肉生理相关的基因富集，这支持了vgll3在鲷鱼肌肉发育和生长中的作用（表2和表3）。重要的是，我们的研究集中在孵化后69天的幼鱼阶段，这是一个关键的发展阶段，标志着该物种从增生性（纤维增殖）向肥大性（纤维增大）肌肉生长的转变（Rowlerson等人，1995年）。与之前将vgll3确定为骨骼肌发生和慢肌分化关键调节因子的研究结果一致（Figeac等人，2019年；Takakura等人，2023年），我们的互作组分析识别出多个与肌肉功能直接相关的差异表达基因（DEGs）（图3）。这些基因包括参与钙调节的基因（cacng1b、casq1a、casq2、pvalb2、pvalb4）（Chu等人，2015年；El Ghaleb等人，2022年；Freise等人，2000年；Infante等人，2011年）、肌动蛋白-肌球蛋白动态的基因（tnnc2、tnnt3b、tnnt2e、mybphb、tpma）（Ohtsuki等人，2021年）以及肌肉组织完整性和信号传导的基因（nrap、myoz1a）（Baker等人，2010年；Casey等人，2023年；Luo等人，2018年；Zhou等人，2022年）（图3）。综合这些发现表明，vgll3通过调节钙稳态、收缩动态和肌肉结构组织，在鲷鱼肌肉生长中起作用。我们的数据还表明vgll3可能在细胞外基质（ECM）的组织中发挥作用，这与之前将vgll3与ECM相关过程（如胶原蛋白合成和组织完整性）联系起来的证据一致（Haque等人，2023年；Horii等人，2023年；Kular等人，2014年）。鉴于ECM在肌肉功能和生长中的重要作用（Csapo等人，2020年），vgll3对ECM成分的调节进一步支持了其在钙稳态和收缩机制中的作用，共同塑造了肌肉发育。这一调控轴具有重要的生态和水产养殖意义：例如，持续游泳可以刺激肌肉收缩，增加鲷鱼的白色肌肉质量和纤维密度，从而提高生长性能（Ibarz等人，2011年；Moya等人，2019年）。这些机制可能解释了在养殖种群中观察到的vgll3的选择性特征（Moulistanos等人，2023年）。除了肌肉生长外，vgll3还可能在鲷鱼的性成熟和性别决定中发挥作用，突显了其广泛的调控意义。在AA和GG基因型之间九个最具统计学意义的DEGs中（表1），amh、cancg1和igfn1.1在多种硬骨鱼类的青春期和性别决定中具有已知的作用。具体来说，amh抑制雄性青春期，并对塞托利细胞分化至关重要（Morais等人，2017年；Verta等人，2020年），而在养殖相关的GG基因型中表达减少，这与大西洋鲑鱼的观察结果一致，其中早期成熟的vgll3基因型在幼鱼睾丸中也表现出amh表达减少（Verta等人，2020年）。此外，cacng1b和igfn1.1与其他鱼类物种的性腺分化有关，因为cacng1b在刺鱼（Gasterosteus aculeatus Linnaeus，1758）的雄性性腺中受到miR-202的下调（Kaitetzidou等人，2022年），而igfn1.1被确定为斑点刀颌鱼（Oplegnathus punctatus Temminck & Schlegel，1844）的遗传性别鉴定标记基因，基于雄性特异性插入信息（Ma等人，2022年）。尽管已经广泛研究了vgll3的性别特异性差异，例如大西洋鲑鱼中雄性和雌性的等位基因依赖性转录差异（Ahi等人，2025年；Verta等人，2025b），但由于鲷鱼是雄性先熟的物种，我们的研究没有包括性别比较。尽管如此，vgll3在调节成熟和生长方面表现出保守的作用，突显了其多效性和进化保守的功能。这些功能观察也引发了关于局部遗传变异如何产生如此广泛的转录效应的问题。之前与鲷鱼水产养殖选择相关的SNPvgll3变异可能与vgll3表达的改变有关（Moulistanos等人，2023年；2025年）；然而，基因型之间的显著下游转录分化表明，这种局部调控效应通过vgll3作为转录共因子的作用广泛传播。在其他系统中也描述了类似的情景，即局部调控变异通过关键调控基因影响广泛的基因网络（Nica和Dermitzakis，2013年；Ahi等人，2025a）。例如，Small等人（2011年）证明变异可以作为主调控因子，调节数百个下游基因的表达，而Liu等人（2022年）显示植物中的eQTLs可以通过关键调控位点类似地控制广泛的基因网络。在我们的数据集中，在这个调控网络中，map4k4表现出差异表达，突显了它在DEGs中的重要性，并表明vgll3通过上游激酶调节调节Hippo信号通路（Meng等人，2015年）。此外，预测与DEGs中富集基序结合的转录因子，包括SMAD3和TCF7，直接或间接与Hippo信号通路和YAP/TAZ介导的转录相关（Qin等人，2018年；Liu等人，2024年）。在这种情况下，vgll3可能作为一个调控枢纽，通过放大效应影响生长、肌肉和成熟相关通路。

**限制与未来方向**

我们的研究为鲷鱼中依赖vgll3的调控通路提供了新的见解，但需要注意几个方面。首先，每个基因型使用四个生物学重复样本可能会限制统计功效和发现的普遍性，尽管仍然观察到了明显的基因型依赖性转录组模式。其次，我们的分析集中在孵化后69天，这是鲷鱼从纤维增殖向肥大转变的关键阶段（Rowlerson等人，1995年），这对生长轨迹和生理适应有持久影响。来自大西洋鲑鱼的证据表明，vgll3基因型在不同发育阶段以不同的方式影响基因表达，成熟和未成熟的雄性鲑鱼之间的转录差异基于它们的vgll3基因型（Ahi等人，2025a）。第三，缺乏序列化个体的表型数据（如生长或肌肉指标）进一步限制了基因型-表型推断。除了这些与实验设计相关的限制外，全身转录组分析受到肌肉等主导组织的影响，这些组织占幼鱼体重的很大比例，因此可能不成比例地塑造转录组谱型（Shi等人，2025年）。这种主导性可能会掩盖其他组织的信号，包括那些参与繁殖的组织。因此，虽然我们的结果表明vgll3可能对肌肉生理和繁殖过程都有贡献，但它们主要反映了生物体水平的转录效应，而不是组织特异性的机制。为了解决vgll3的空间和时间调控问题，未来需要在不同发育阶段进行组织特异性或单细胞转录组分析。这些转录模式的解释还受到与基因表达相关的遗传和调控因素的复杂影响。特别是，由于本研究中分析的同义SNP（SNPvgll3），vgll3的调控推断面临挑战。尽管同义变异不改变蛋白质序列，但它们可以通过影响mRNA稳定性、翻译效率或密码子使用来影响基因调控（Ramírez-Bello和Jiménez-Morales，2017年；Robert和Pelletier，2018年；Mitra等人，2016年；Oelschlaeger，2024年）。这些效应可能调节VGLL3蛋白与TEAD转录因子的相互作用，从而影响肌肉分化和生长通路（Hori等人，2020年；Mesrouze等人，2020年；Mesrouze和Chène，2024年；Joshi等人，2017年；Tsika等人，2008年）。重要的是，虽然SNPvgll3是观察到的GG相关基因下调的合理候选者，但目前的数据不允许我们建立直接的因果关系。SNP可能只是vgll3基因组区域内的一个关联标记，受到附近调控变异或上位性相互作用的影响。解开这些可能性需要针对性的功能测定来直接测试因果关系。同时，这些遗传考虑与功能注释相交，本研究中依赖于斑马鱼orthologs的功能注释，这些orthologs提供了相对完善的硬骨鱼类基因本体信息。然而，GO术语、通路和互作网络的富集不应被解释为直接将vgll3与体细胞生长、生殖成熟或驯化相关特征联系起来的机制证据，而应被视为需要实验验证的统计支持假设（Pavlidis等人，2012年）。富集分析中揭示的模式反映了鲷鱼中的有意义的生物学趋势，尽管跨物种功能推断存在固有的限制，但本研究的结论仍然稳健。这些考虑还通过VGLL基因家族的更广泛进化框架得到了进一步背景化。研究的鲷鱼基因vgll3属于退化型（VGLL）基因家族，该家族在脊椎动物中经历了多次复制，产生了具有不同注释水平的旁系基因（vgll1-4）。虽然序列相似性支持将鲷鱼位点归类为vgll3分支，但不能完全排除旁系基因之间的功能差异。因此，跨物种的VGLL3功能比较应谨慎解释。我们使用斑马鱼orthologs进行功能注释，因为它们提供了相对完善的基因本体和通路资源（Primmer等人，2013年）。这种方法对于识别广泛的、进化保守的生物学过程最为有用，而不是精确的物种特异性功能。尽管如此，在鲷鱼中观察到的基因型相关转录特征与在其他脊椎动物中报道的VGLL3在生长、成熟和发育调节中的作用大体一致（Barson等人，2015年；Cousminer等人，2013年；Debes等人，2021年；Halperin等人，2013年；Pennonen等人，2017年；Perry等人，2014年），支持部分功能保守的假设。未来工作结合专门的系统发育分析或VGLL家族在硬骨鱼类中的进化示意图将有助于澄清同源关系并加强进化和功能解释。未来结合更大样本量、多阶段、组织特异性和功能分析以及表型测量的研究将有助于全面阐明vgll3的调控作用及其对生态相关特征的贡献。具体来说，等位基因特异性表达分析、CRISPR/Cas9介导的功能验证和蛋白质组分析可以阐明候选变异（如SNPvgll3）对蛋白质功能和下游通路的影响。此外，跨发育阶段和环境条件的纵向研究将有助于揭示vgll3介导的调控网络如何响应生态压力。虽然这些发现是探索性的，但它们为理解vgll3在鲷鱼中的进化和功能意义提供了基础，并为未来研究其在肌肉生长、生殖发育和水产养殖育种计划中的作用建立了框架。总之，我们的研究表明vgll3在鲷鱼早期发育过程中调节转录组分化方面具有基因型依赖性作用。数据提供了强有力的证据，表明基因型依赖性的差异表达与vgll3位点的调控变异相关，下游转录模式与vgll3作为多个基因的中心调控因子一致。SNPvgll3基因型之间观察到的不同转录组谱型，结合之前的qPCR表达分析，表明vgll3是发育和生理通路的重要调控因子，这些通路与假定的驯化相关特征相关。差异表达分析突出了与肌肉相关的富集通路，并表明vgll3在繁殖过程中也起着重要作用，反映了其多效性和进化保守的功能。尽管我们在孵化后69天的发现提供了有价值的见解，但它们也强调了需要进行组织特异性、多阶段研究并结合表型测量，以全面阐明vgll3的全面调控作用。总体而言，vgll3作为一个有前途的候选基因，值得进一步研究其在鲷鱼肌肉发育、生长和性成熟及生殖成熟方面的作用，尽管需要进一步的研究来澄清其表型影响和在选育中的潜在用途。

**作者贡献**

Aristotelis Moulistanos：数据整理（平等）；正式分析（平等）；调查（平等）；方法学（平等）；可视化（主导）；写作——原始草稿（平等）。
Elisavet Kaitetzidou：数据整理（平等）；正式分析（平等）；方法学（平等）；验证（平等）；写作——审阅和编辑（平等）。
Styliani Minoudi：数据整理（平等）；正式分析（平等）；方法学（平等）；写作——审阅和编辑（平等）。
Konstantinos Gkagkavouzis：方法学（平等）；项目管理（平等）；写作——审阅和编辑（平等）。
Efthimia Antonopoulou：调查（平等）；方法学（平等）；监督（平等）；写作——审阅和编辑（平等）。
Alexandros Triantafyllidis：概念化（平等）；资金获取（平等）；调查（平等）；方法学（平等）；项目管理（平等）；监督（平等）；写作——审阅和编辑（平等）。
Spiros Papakostas：概念化（平等）；数据整理（主导）；正式分析（主导）；资金获取（平等）；调查（平等）；方法学（平等）；项目管理（平等）；资源（主导）；监督（平等）；可视化（平等）；写作——原始草稿（平等）；写作——审阅和编辑（主导）。

**致谢**

感谢塞萨洛尼基亚里士多德大学（AUTh）的高性能计算基础设施的计算资源的使用。本文的开放获取（OA）出版得到了HEAL-Link的财政支持。**资金支持**
本研究是在“SEaLIFT”项目框架下进行的，该项目旨在通过系统生物学建模方法研究地中海地区可持续水产养殖生产中的关键生命特征，该项目由希腊研究与创新基金会（H.F.R.I.）资助，资助编号为00414。

**伦理声明**
本研究是在塞萨洛尼基亚里士多德大学（Aristotle University of Thessaloniki）进行的，该大学的“研究伦理委员会运作原则与程序”遵循希腊法律第4485/2017号第68条以及第4521/2018号第21–27条的规定。根据该规定第25条（“涉及动物使用的研究”），我们的实验方案并未使用濒危物种或野生动物（即水产养殖鱼类），此类操作属于水产养殖行业的常规做法（第25条第5.d款），因此无需特别审批。

**利益冲突声明**
作者声明不存在任何利益冲突。

**数据可用性**
来自69天大隆头鲷幼鱼的原始RNA序列数据已存储在NCBI的Sequence Read Archive（SRA）中，访问编号为PRJNA1266065。补充文件1和2可在研究支持材料中找到。