《Emerging Microbes & Infections》：Non-invasive environmental DNA sampling reveals tuberculosis risks at the human – Great Ape Interface in Africa
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本研究针对非洲人-灵长类动物界面结核病(Mycobacterium tuberculosis, MTBC)传播风险不清的难题，研究人员采用非侵入性海绵环境DNA(eDNA)采样技术，在刚果民主共和国东部的人、野生大猩猩和圈养非人灵长类动物(NHP)共存的复杂环境中进行横断面调查。结果显示，在所有三个研究地点（包括与人类、野生大猩猩和圈养NHP相关的样本）中均检测到结核分枝杆菌eDNA，并在人类和大猩猩环境样本中发现相同的间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)模式SIT130。这些发现强烈提示了在赤道非洲地区，人与NHP之间存在结核病的流行病学联系，为濒危物种保护和公共卫生干预提供了新的科学依据。
在刚果民主共和国(DRC)东部茂密的雨林和脆弱的生态系统中，生活着极度濒危的东部低地大猩猩。与此同时，这个地区也是全球人类结核病发病率最高的地区之一。人与野生动物的接触——无论是在野生动物康复中心、国家公园还是当地社区——都日益频繁。一个长期悬而未决的疑问是：人类的高结核病负担是否会威胁到这些与我们亲缘关系最近的生灵？传统的结核病诊断方法，如皮肤测试、X光或血液检查，对野生动物而言侵入性强、操作困难且存在安全风险。那么，是否存在一种更温和、更有效的方法，能够在不惊扰这些珍贵动物的前提下，评估它们暴露于结核病的风险，并揭示潜在的跨物种传播链？
为了回答这个问题，一个由Ekutsu等人领导的研究团队在《Emerging Microbes & Infections》期刊上发表了一项开创性研究。他们创新性地将环境DNA(eDNA)采样技术应用于人-灵长类动物界面的结核病监测。研究人员选择了DRC东部南基伍省一个极具代表性的“微缩世界”：这里包含了卢维罗灵长类动物康复中心(LPRC)、当地的米蒂-穆雷沙卫生区（含卢维罗医院）以及拥有濒危东部低地大猩猩的卡胡齐-比埃加国家公园(KBNP)。从2023年10月到2024年5月，他们在这些地点共采集了178个预水合环境DNA海绵样本。这些海绵被轻柔地擦拭各种表面，包括人类和麻醉后非人灵长类动物(NHP)的体表、NHP粪便、围栏表面、大猩猩巢穴和剩余食物、个人防护装备(PPE)以及医院表面等，旨在捕获环境中可能存在的结核分枝杆菌复合群(MTBC)的遗传物质。
关键技术与方法概览
本研究核心是应用海绵基环境DNA(eDNA)采样与分子检测技术。研究人员使用预水合采样海绵(GPSponge?)非侵入性地收集环境样本中的核酸。提取的DNA通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)靶向检测MTBC的两个标志基因：多拷贝的IS6110和单拷贝的mpb70，以兼顾检测的敏感性与特异性。对PCR阳性样本，进一步进行间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)以确定基因型，使用商品化试剂盒进行MTBC菌种鉴定，并利用FluoroType MTBDR试剂盒检测对利福平和异烟肼的分子耐药性。研究还构建了加权无向二分网络，以可视化不同基因型与宿主物种间的关联。
研究结果
结核分枝杆菌复合群环境DNA的检测
在总共172个有效样本（排除6个抑制样本）中，研究人员在来自所有三个地点的样本中均检测到MTBC eDNA。总体而言，61个样本(35.47%) IS6110阳性，33个样本(19.19%) mpb70阳性，其中32个样本(18.60%)对两个标志物均呈阳性。具体而言：
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在卡胡齐-比埃加国家公园(KBNP)，39个样本中有12个(30.8%)至少对一个PCR靶标呈阳性，包括从大猩猩粪便、大猩猩巢穴、护林员体表及其个人防护装备上采集的样本。这是在野生大猩猩中首次检测到MTBC eDNA。
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在卢维罗灵长类动物康复中心(LPRC)，110个有效样本中有15个(13.6%)对两个标志物均呈阳性，阳性样本来源包括人类体表、麻醉后的黑猩猩和橄榄狒狒体表、狒狒围栏的喂食器、不同黑猩猩和疣猴围栏的粪便样本，以及医疗罐、冷冻柜把手等多个设施表面。
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在卢维罗医院，15名活动性结核病患者的体表样本中，有14例(93.3%) IS6110阳性，11例(73.3%)对两个标志物均呈阳性，显示了该检测方法对人类活动性结核病例的高灵敏度。
物种鉴定、间隔区寡核苷酸分型与分子耐药性
在可进行菌种鉴定的20个案例中，均被鉴定为结核分枝杆菌严格意义上的(M. tuberculosissensu stricto) 。间隔区寡核苷酸分型在18个样本中成功获得了可读谱型。其中，12个样本属于SIT130型，该型在所有研究地点（康复中心、国家公园、医院）均有发现，且同时出现在与人类和大猩猩环境相关的样本中。另有3个样本属于SIT26型，仅在与康复中心内不同黑猩猩群体相关的样本中检测到。其余3个样本分别属于SIT17、SIT52和SIT118型，且仅在与人类相关的样本中发现。网络分析图直观展示了SIT130型作为连接人类、黑猩猩和大猩猩的核心基因型。此外，在30个用FluoroType MTBDR检测的样本中，均未在rpoB、inhA或katG基因中检测到突变，表明未发现对利福平和异烟肼的耐药性。
海绵样本eDNA PCR的灵敏度与采样目标
分析不同采样基质的检出率显示，人类体表样本的阳性率最高，其次是NHP粪便样本。大猩猩巢穴和食物样本、牲畜样本以及个人防护装备样本仅对IS6110呈阳性。
研究结论与讨论
本研究通过非侵入性eDNA采样，首次在野生东部低地大猩猩、附近的灵长类动物康复中心及当地医院的环境中检测到结核分枝杆菌。更重要的是，在人类、野生大猩猩和圈养NHP相关的样本中发现了相同的基因型（SIT130）。这些发现强烈提示了在人与非人灵长类动物之间存在结核病的流行病学联系。SIT130型（主要属于拉丁美洲-地中海家族）在不同地点和宿主间的广泛分布，表明在国家公园、当地社区和康复中心这些生态“隔间”之间可能存在病原体的流动。而仅在康复中心黑猩猩中发现的SIT26型（CAS1-德里家族），则可能提示了通过捕获后与人类接触而引入的独立传播链。
这项研究具有多重重要意义。首先，它为极度濒危的东部低地大猩猩的保育敲响了警钟，证明了它们确实暴露于人类传播的结核病风险之下。其次，研究证实了海绵基eDNA采样是一种在具有挑战性的环境中，用于结核病监测和风险评估的廉价、便捷且有效的工具。它特别适用于对自由生活的濒危物种进行无创监测，符合将症状监测与靶向诊断采样相结合的需求，以改进疫情早期发现和种群影响评估。
当然，研究也存在一定局限性，例如eDNA方法无法区分活菌与死菌，样本量在不同地点间不平衡，且未包含其他可能影响流行病学的动物物种（如野生狒狒和黑猩猩）。然而，其发现已足够引人警醒。在人类结核病高发区与濒危灵长类动物栖息地高度重叠的赤道非洲，来自人类的结核病已成为对类人猿保护的新兴威胁。研究团队建议，在康复中心、国家公园工作的员工，特别是活动性结核病患者，以及进行大猩猩生态旅游的游客，都应强制采取佩戴口罩等预防措施，以构筑一道保护这些珍贵“近亲”的公共卫生屏障。
