挖掘本土酵母双重潜力：筛选兼具生物防治与酿酒酶活性的斯洛文尼亚葡萄园酵母菌株

《Microorganisms》：Harnessing the Enzymatic Potential of Indigenous Yeast Strains: Screening and Evaluation for Biocontrol and Oenological Advancements Rowland Adetayo Adesida, Jan Re??i?, Lorena Butinar and Melita Sternad Lemut

本研究针对葡萄酒产业中可持续种植与风味调控的双重挑战，通过评估115株本土酵母的生物防治潜力与酿酒相关酶活性，发现P. guilliermondii ZIM 624等菌株兼具几丁质酶（chitinase）活性、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）高产及挥发性有机物（VOCs）抑制Botrytis cinerea的能力。该研究为整合葡萄园病害管理与发酵工艺的“一菌双用”策略提供了关键菌株资源，对推动低硫酿酒与化学农药减施具有重要实践意义。

　　

在葡萄酒的世界里，风土（Terroir）决定了葡萄酒的灵魂，而在这片神奇的风土之下，除了阳光、土壤与葡萄品种，还隐藏着一个庞大而神秘的微观王国——酵母群落。长久以来，酿酒师们依赖商业酵母启动发酵以确保稳定，但随着消费者对天然、地域特色以及可持续发展的追求，本土酵母（Indigenous yeast）重回聚光灯下。然而，这不仅仅是关于杯中酒的风味故事，更是关于葡萄园里的生存战争。葡萄生长季面临的灰霉病（Botrytis cinerea），如同悬在头顶的达摩克利斯之剑，迫使果农大量施用化学杀菌剂，这不仅破坏了环境，也可能杀死那些珍贵的本土有益微生物。有没有可能找到这样一种“超级英雄”酵母：它既能像卫士一样在田间抑制灰霉病，又能在酿造车间里释放迷人的花果香气？这正是斯洛文尼亚研究团队在《Microorganisms》上发表的最新研究试图解答的核心命题。

为了解决传统研究中将“葡萄园生物防治”与“酿酒发酵功能”割裂评估，导致实验室成果难以转化为田间实际应用的问题，研究人员从斯洛文尼亚葡萄园及葡萄酒库中筛选了115株本土酵母，涵盖30个物种17个属。研究采用了一种整合性的评估框架，旨在寻找兼具双重功能的菌株。通过对几丁质酶（Chitinase）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）、β-裂解酶（β-lyase）等关键酶活性，以及对病原菌的体外抑制、挥发性有机物（VOCs）拮抗、杀菌剂耐受性和叶片盘生物测定等一系列严苛测试，最终锁定了具有卓越潜力的候选菌株，并在田间试验中验证了其效果。

主要关键技术方法：

研究样本源自斯洛文尼亚两个微生物库（YBWRC和ZIM）。关键技术包括：利用含胶体几丁质（Colloidal chitin）和真菌细胞壁制备物（CWP）的培养基定量检测内切/外切几丁质酶活性；采用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）和多种β-D-糖苷底物（如熊果苷、七叶苷）定性定量评估β-葡萄糖苷水解酶活性；通过YCB-SMC培养基和半胱氨酸底物分析β-裂解酶活性；利用铅乙酸盐法检测硫化氢（H₂S）产生；通过体外菌丝径向生长抑制（Y-FMGRI）和双培养皿系统评估挥发性有机物（VOCs）抑菌效果；基于14种碳源利用计算生态位重叠指数（NOI）；采用葡萄叶盘感染模型进行离体抗病评估；并对优选菌株P. guilliermondii ZIM 624进行了田间试验，结合早期摘叶、化学杀菌剂（Switch?）等不同处理评估其对灰霉病的防控效果。

3.1. Cell Wall-Degrading Enzyme Activities

通过胶体几丁质平板定性筛选，发现B. albus、P. guilliermondii和W. anomalus具有显著几丁质酶活性。进一步定量分析显示，P. guilliermondii ZIM 624和W. anomalus S138的内切和外切几丁质酶活性普遍较低且变异性高，无显著菌株差异，但其活性受底物诱导（尤其在CWP培养基上），表明其为可诱导型而非组成型表达。同时，两者均表现出β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）活性，其中P. guilliermondii ZIM 624在蔗糖培养基48小时达到峰值111.3 U，显示出快速响应特征，而W. anomalus S138则表现为持续较长时间的酶活释放。

3.2. Glucoside Hydrolase Activities

大多数测试菌株表现出β-葡萄糖苷酶活性，仅C. zemplinina和S. bayanus（除七叶苷外）为阴性。定量pNPG分析显示，H. uvarum 116具有最高的细胞相关活性（CAA，6.32 U/g），而T. delbrueckii Sut94表现出最高的胞外活性（EA，1.36 U/g）。研究发现非酿酒酵母（Non-Saccharomyces）普遍具有较高的β-葡萄糖苷酶潜力，这对于释放葡萄中的萜烯类香气前体至关重要。

3.3. β-Lyase Activity

β-裂解酶活性广泛存在于大多数酵母中，该酶能释放挥发性硫醇（Thiols），赋予葡萄酒热带水果香气。通过半胱氨酸底物的酶活分析，K. dobzhanskii Re19L显示出最快的NADH消耗速率，表明其β-裂解酶活性最强。P. guilliermondii ZIM 624、W. anomalus S138及S. cerevisiae菌株也表现出时间依赖性的酶活性，暗示这些菌株在发酵中具有释放品种特异性香气的潜力。

3.4. Sulfite Reductase Activity and H₂S Production

硫化氢（H₂S）的产生通常与不良风味相关。结果显示，仅P. manshurica Sut 91.2表现出显著的H₂S生成，而P. guilliermondii ZIM 624在所有测试中均未检测到H₂S产生，这对于酿酒应用是一个极其有利的特性，避免了“臭鸡蛋”味的产生。

3.5. In Vitro Yeast-Mediated Fungal Mycelial Radial Growth Inhibition (Y-FMGRI)

在模拟葡萄汁培养基（GJM）上，A. pullulans ZIM 2098、M. pulcherrima ZIM 2055和P. guilliermondii ZIM 624等菌株对B. cinerea表现出最强的菌丝生长抑制（约42.1-45.4%）。结果表明抑制效果具有显著的底物依赖性，且在GJM上的效果普遍优于YPDA，更接近真实的葡萄果实微环境。

3.6. Inhibitory Activity of Yeast-Modulated Antifungal Volatile Organic Compounds (VOCs)

在双培养皿系统中，D. hansenii、K. dobzhanskii、M. pulcherrima等在GJM培养基上产生的VOCs对B. cinerea孢子萌发的抑制率中位数高达95%以上。P. guilliermondii ZIM 624也表现出强劲的VOCs介导抑制。这证实了酵母通过释放特定挥发性物质（如单萜类化合物）进行间接拮抗的机制。

3.7. Yeast Tolerance to Copper and Commercial Fungicides

鉴于葡萄园常喷施铜制剂及其他杀菌剂，菌株的耐受性至关重要。测试表明，包括P. guilliermondii ZIM 624在内的32株酵母对所有测试的硫酸铜浓度及三种商用杀菌剂（Switch?、Rovral?、Banjo?）均表现出高耐受性，这确保了它们在田间喷雾后仍能存活并发挥作用。

3.8. Niche Overlap Index (NOI)

生态位重叠指数（NOI）分析显示，P. guilliermondii、T. delbrueckii及部分S. cerevisiae菌株与B. cinerea的NOI值大于0.90，表明它们强烈竞争相同的碳源生态位（如氨基酸、有机酸），这种营养竞争是生物防治的重要机制之一。

3.9. Leaf Disc Assay

葡萄叶盘试验虽因变异度大未达统计学显著差异，但P. guilliermondii ZIM 624、K. fluxuum SM66及部分S. cerevisiae菌株显示出降低坏死病斑面积的趋势，表明其在植物表面的定殖可能干扰了病原菌的侵染过程。

3.10. Synthesis of Overall Functional Characteristics in the Best-Performing Strains

综合所有指标，P. guilliermondii ZIM 624脱颖而出，集成了几丁质酶阳性、广谱β-葡萄糖苷酶活性、强效VOCs抑制、无H₂S产生、高杀菌剂耐受性及高NOI值于一身，被确定为最优多功能菌株。

结论与讨论

这项研究首次在一个统一的实验框架下，系统地评估了本土酵母在葡萄园生物防治与酿酒发酵改良中的双重潜力。研究打破了以往将这两者分离的局限，证实了许多非酿酒酵母（Non-Saccharomyces）不仅能在葡萄园中通过几丁质酶降解、VOCs释放和营养竞争有效抑制灰霉病（Botrytis cinerea），还能在发酵过程中通过β-葡萄糖苷酶和β-裂解酶显著提升葡萄酒的香气复杂度。特别是P. guilliermondii ZIM 624，凭借其卓越的综合性能和无H₂S产生的“清洁”特性，在田间试验中结合早期摘叶（Early leaf removal）和化学杀菌剂的综合管理中表现出色，证明了其作为集成病害管理（Integrated disease management）策略核心组分的实用价值。

更重要的是，该研究强调了菌株水平（Strain level）而非物种水平的变异性，指出即便是同一物种内的不同菌株，其酶活、抑菌能力和耐受性也可能天差地别。这为未来的微生物资源开发提供了方法论指导：必须深入挖掘本土微生物库的多样性，进行精细化的功能筛选。此外，研究采用的模拟葡萄汁培养基（GJM）和叶盘模型更贴近实际农业场景，使得筛选出的菌株更具田间应用前景。这项工作不仅为斯洛文尼亚乃至全球的可持续葡萄种植业提供了宝贵的微生物资源清单，也为实现“从田间到酒窖”的全程微生物调控，生产更具地域特色且环境友好的葡萄酒奠定了坚实的科学基础。