在杂交石斑鱼受到藻分解弧菌（Vibrio alginolyticus）感染后，添加膳食中的乙基咖啡酸（ethyl caffeate）能够增强与抗体反应相关的免疫-代谢相互作用

《Journal of Agriculture and Food Research》：Integrated dietary ethyl caffeate enhances immune-metabolic interactions related to antibody responses in hybrid grouper after challenged with Vibrio alginolyticus.

　　阿里·维多多（Ari Widodo）|诺维·罗斯马拉·德维（Novi Rosmala Dewi）|陈茵瑜（Yin-Yu Chen）|林宇茹（Yu-Ru Lin）|穆罕默德·阿尔·罗扎克·努格拉哈（Muhammad Ar Rozzaaq Nugraha）|廖振豪（Zhen-Hao Liao）|黄怀婷（Huai-Ting Huang）|南凡华（Fan-Hua Nan）|朱玉婷（Yu-Ting Chu）
台湾海洋大学水产养殖系，基隆，中国台湾

**摘要**
本研究揭示了在喂食含有0.25克/千克乙基咖啡酸（EC）饲料的杂交石斑鱼中，免疫-代谢相互作用在抗体形成中的作用。实验分为三组：阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）和EC组。鱼被喂食0.25克/千克的EC或对照饲料7天后，再暴露于藻酸分解弧菌（Vibrio alginolyticus）。在28天内分析了免疫反应，并在暴露后第7天进行了代谢组学和组织学分析。在84天内评估了生长表现。结果表明，EC增强了头部肾脏白细胞计数、吞噬活性和呼吸爆发能力。基因表达分析显示，先天免疫（tlr4、il1β、mhc2和hsp70）和适应性免疫（igm和igt）基因均上调，表明体液免疫被激活。通过代谢组学数据的偏最小二乘判别分析，可以明确区分NC、PC和EC组。肌肉代谢组学分析显示，糖酵解和三羧酸循环代谢物（如葡萄糖、丙酮酸、柠檬酸和琥珀酸）富集。氨基酸代谢物（包括谷氨酰胺、精氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸）的水平也升高。这些代谢变化表明存在协调的免疫-代谢反应，其中增强的氨基酸可用性支持B细胞激活和抗体合成，三羧酸循环的上调满足了克隆扩增的能量需求，而增加的核苷酸代谢促进了细胞修复和增殖。因此，EC补充通过整合能量产生、生物合成和免疫激活的代谢途径促进了杂交石斑鱼的抗体形成，从而增强了水产养殖系统中的疾病抵抗力。

**1. 引言**
植物化学物质（或植物营养素）是天然植物化合物，当添加到鱼饲料中时，可以通过保护鱼类免受有害微生物的侵害来增强其免疫反应和疾病抵抗力[1]。生物活性化合物包括苷类、黄酮类、酚类、生物碱、萜类、单宁、皂苷、精油和类固醇等[2]。植物化学物质增强鱼类健康的方式包括改善先天免疫反应、增强抗菌活性（作为天然抗生素）、提高饲料利用率和生长速度以及增强营养素消化率[3]。乙基咖啡酸（EC）是一种存在于Bidens pilosa中的植物化学物质[4]，它是羟基肉桂酸的酯类。EC是一种参与抗炎过程的多酚化合物[5]。EC对小鼠巨噬细胞（RAW 264.7细胞系）没有细胞毒性；暴露于10 μg/mL EC时，细胞存活率为80%[4]。此外，EC能清除超氧阴离子、一氧化氮和DPPH自由基，并强烈抑制过氧化氢诱导的神经PC12（大鼠嗜铬细胞瘤）细胞死亡，表明其具有免疫增强作用[6]。尽管EC常用于增强小鼠的免疫力，但关于其对包括杂交石斑鱼在内的水生动物免疫力的潜在影响的信息仍然有限[7]。EC可增强杂交石斑鱼的免疫反应，特别是先天免疫反应[8][9]。EC对免疫系统影响的精确机制尚未完全阐明。在鱼类中，适应性免疫系统通过诱导B细胞产生特异性抗体（即免疫球蛋白）来抵御多种抗原和病原体；因此，B细胞在保护宿主免受感染方面起着核心作用[10]。已报道硬骨鱼类中有三种免疫球蛋白类型（M、D和T）；其中M是最先被发现的免疫球蛋白类型，主要以四聚体形式存在于血清和黏液中[11]。在鱼类中，免疫球蛋白T是一种专门针对黏膜免疫的免疫球蛋白[12]，在黏膜表面（如肠道、皮肤、鳃、口腔和咽部）提供初级免疫防御；它结合并覆盖这些表面的微生物[13][14][15]。在喂食EC后，EC对杂交石斑鱼中藻酸分解弧菌挑战后免疫球蛋白T和M类型的形成机制尚不清楚。

抗体形成是适应性免疫系统的核心特征，与支持发育和活化B细胞能量和生物合成需求的代谢变化相关[16]。代谢组学分析已成为有效捕捉鱼类饮食中营养干预影响的全球生化变化并阐明代谢途径的方法[17]。对豹纹石斑鱼（Plectropomus leopardus）在藻酸分解弧菌感染后的代谢组学分析提供了见解[18]。然而，关于鱼类中抗体介导的免疫-代谢相互作用的影响仍有限。因此，我们研究了EC刺激后的适应性免疫-代谢相互作用，特别是抗体形成，并阐明了使杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀ × Epinephelus lanceolatus ♂）能够对抗藻酸分解弧菌感染的机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 实验饲料制备
实验饲料的配方基于一项确定杂交石斑鱼EC补充最佳剂量的研究[7][8]。鱼被喂食基础饲料或添加了0.25克/千克EC的基础饲料（表1）。使用锤磨机研磨饲料成分，并用60 μm筛网过滤。将10%的水与所有干成分完全混合制成面团。逐渐向干混合物中添加鱼油、氯化胆碱和纯净水。随后制造出直径约为10毫米的饲料颗粒，并在装有空气压缩机的干燥室中于50°C下脱水约3天。实验用干燥饲料存放在带盖的塑料盒中，直到需要使用。

**表1. 实验饲料的组成和近似成分**
| 成分 | 重量（克/千克） |
| --- | --- |
| 鱼粉 | 500 |
| a-淀粉 | 200 |
| 维生素预混剂 | 13 |
| 矿物质预混剂 | 20 |
| 卵磷脂 | 10 |
| 氯化胆碱 | 22 |
| 鱼油 | 30 |
| 大豆浓缩物C P | 60 |
| 鸡粉 | 110 |
| 大豆粉 | 50 |
| 乙基咖啡酸（EC） | 0.25 |

**近似成分（干重百分比）：**
- 粗蛋白：46.35
- 粗脂质：9.83
- 水分：9.31

*鱼粉（日本静冈县）含有65%的蛋白质。
**维生素预混剂（台湾高雄Golden Prawn Enterprise生产）。**
**矿物质预混剂（台湾高雄Golden Prawn Enterprise生产）。**

2.2. 细菌制备
细菌来自台湾海洋大学水产养殖与生理学实验室中保存在-80°C下的甘油储备培养物。首先使用储备培养物在添加了2% NaCl的胰蛋白酶大豆肉汤（Merck，德国）中培养藻酸分解弧菌24小时。然后将细菌划线接种到特定的培养基上（硫代硫酸盐-柠檬酸-胆盐-蔗糖琼脂（Merck，德国），并在28°C下培养24小时。从琼脂平板上获得的细菌分离株随后被用作工作菌株。

2.3. 荧光显微镜
使用基于我们先前体外研究选择的浓度（25 μg/mL EC）通过荧光显微镜评估EC对藻酸分解弧菌活力的影响[9]。首先使用添加了2% NaCl的胰蛋白酶大豆肉汤分离藻酸分解弧菌，然后在28°C下培养24小时。接下来，准备12个含有1 mL细菌悬浮液（最终密度为10^6 CFU/mL）的试管进行进一步分析。然后向试管中加入100 μL 1×磷酸盐缓冲液（PBS；对照组）或25 μg/mL EC，然后在摇床培养器中培养1小时，随后在25°C下以3,750 rpm离心10分钟。最终沉淀物用1 mL 1× PBS洗涤两次。接下来，将样品悬浮在1 mL PBS中，并用1 μL碘化丙啶（10 μg/mL；Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）染色5分钟；然后将样品转移到96孔板上。最后，在倒置荧光显微镜（Olympus IX71 Fluorescence；Olympus Corporation，东京，日本）下以20倍放大倍数成像。

2.4. 实验设计与采样
360条体重为74.25 ± 8.78克的杂交石斑鱼随机分为三组（每组120条鱼，每组再分为n = 60条；30条用于免疫反应评估，30条用于生长表现评估）：EC组、阳性对照组（PC）和阴性对照组（NC）。每天喂食两次，喂食量约为体重的5%。在第7天，向PC组和EC组腹腔注射300 μL藻酸分解弧菌（5 × 10^8 CFU/mL），而NC组注射PBS。藻酸分解弧菌的挑战剂量基于我们之前的研究确定的LD50[8]。注射后，每组再分为两个亚组（每个亚组n = 30条）进行单独评估：一个亚组用于免疫反应评估，直到14天；另一个亚组用于生长表现评估，直到84天。所有实验期间继续喂食处理。实验设计如下（图1）。

**图1. 所有实验设计。**

对于免疫反应评估，分析了某些器官的免疫反应、组织学和代谢组学分析参数。从每个亚组的5条鱼中收集鳃、皮肤、肠道、脾脏、头部肾脏和肝脏的组织样本，在第0天、第1天、第3天和第14天采集，并储存在-80°C。使用表2中列出的引物进行基因表达分析[19][20][21][22]。在第7天收集肠道和肌肉样本进行组织学和代谢组学分析。生长表现实验通过测量鱼体重来评估。注射后每两周测量一次鱼体重。

**表2. 用于免疫相关基因表达的引物**
| 基因 | 正向引物（5’→3’） | 反向引物（5’→3’） | 来源 |
| --- | --- | --- | --- |
| β-actin | GGCTACTCCTTCACCACATCTGGGCAACGGAACCTCT | [20] |
| 模式识别受体Toll样受体4（tlr4） | ATCATCACCGCTACACACCACTACTACTCCCTCCACGCAG | ? |
| 应激相关基因 | 热休克蛋白（hsp70） | GTCCTGATCAAACGAAACACCAGTCAAGCAACTCCAGACCATCA | [19] |
| 抗体基因 | 免疫球蛋白M（igm） | GGAAAAGACTGGAGTGGATTGGCTGTTGTCTGTGGAGATGGTG | [22] |
| 免疫球蛋白T（igt） | CTTGGCAAGTCAATGGAGCATCTGCATCGATGTCCTCCTC | ? |
| 炎症反应 | 白细胞介素-1β（il1β） | CCTCATCATCGCCACACAGATGCCTCACAACCGAACACAT | [21] |
| 主要兼容复合体II（mhc2） | CAGGTTCAGCAGCAGTTTGGAGCAGCCTGGTAGTCAATCCC | [20] | ? |

*表示相应基因的引物是作者新设计的。

2.5. 免疫反应和组织学参数
使用MS-222（Sigma-Aldrich，中国）在低温下麻醉鱼，然后解剖以取出其器官。如前所述，评估了头部肾脏白细胞活性、吞噬活性和呼吸爆发能力[8]。生长表现参数的分析方法如其他地方所述[8]。在组织学检查之前，先解剖肠道并在Davidson固定液（Biotech，高雄，台湾）中保存24小时。经过乙醇（30%-100%）逐步脱水后，将肠道嵌入石蜡中。然后对7-μm厚的组织切片进行苏木精和伊红染色。使用之前描述的方法（稍作调整）研究这些部分[22]。在每个切片中，使用配备相机和图像处理软件（WenxinCam，台中，台湾）的光学显微镜测量皱褶高度（PH）、皱褶宽度（PW）、肌肉层厚度（MLT）、肠道直径（ID）和杯状细胞（GC）的数量。存活率按以下方法计算[23]。

2.6. 基因表达分析
使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）根据制造商的方案从头部肾脏、脾脏、鳃和肠道中提取总RNA，并用无RNase的DNase I（Thermo Fisher Scientific，美国）去除残留的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，并使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估纯度和浓度。根据制造商的说明，使用商业逆转录试剂盒从1 μg总RNA合成第一链cDNA。使用CFX96 Real-Time PCR检测系统（Bio-Rad，美国）和SYBR Green Master Mix（Takara，日本）进行定量实时PCR（qPCR）。针对目标免疫、抗氧化和生长相关基因以及参考基因（β-actin）设计引物，并商业合成。所有qPCR方法，包括引物序列和扩增效率，均按照杂交石斑鱼的研究方法进行。相对mRNA表达水平使用2ΔΔCt方法计算，将目标基因归一化到参考基因（β-actin），并将结果表示为相对于对照组的倍数变化。

2.7. 代谢组学分析
在暴露后第7天收集杂交石斑鱼的肌肉组织样本，并储存在-80°C直到分析。样本用干冰运输到Biotools（台湾）进行非靶向代谢组学分析，遵循公司的样本提交指南（每个样本100-200毫克组织，5个生物学重复）。Biotools使用其标准化协议进行代谢物提取和分析，并使用其专有流程处理原始数据。这包括代谢物的注释，这些代谢物与内部光谱库（例如，MetwareDB中的超过5,400种代谢物）和公共数据库（例如，HMDB（人类代谢组数据库）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）相匹配，置信水平为MSI 1级（通过参考标准确认）或2级（推测性注释）。简而言之，肌肉代谢物使用50%甲醇提取，并使用UHPLC-Q Exactive Plus Orbitrap MS系统（Thermo Fisher，美国马萨诸塞州）进行分析。分离是在ACQUITY Premier HSS T3柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm；Thermo Fisher，美国马萨诸塞州）上进行的，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速为0.3 mL/min，梯度时间为20分钟。UHPLC与Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪相连，以电喷雾正模式运行，采集全扫描MS（m/z 80–1200）和数据依赖的MS/MS。原始LC-MS数据在Compound Discoverer 3.3（Thermo Fisher Scientific）中处理，用于峰检测、保留时间对齐和代谢物注释，然后将得到的数据矩阵导入MetaboAnalyst 6.0进行标准化、多变量分析（PCA/PLS-DA）、单变量统计和通路富集。

2.8 统计分析
所有数据均以三次重复实验的平均值±标准差表示。对于具有三个实验组的参数（NC、PC、EC），包括非特异性免疫反应、免疫相关基因表达、组织学分析和生长性能，使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验以确定组间差异（p < 0.05）。免疫相关基因表达数据在对数2变换后归一化到管家基因β-actin再进行分析。生存率通过Kaplan-Meier方法评估。对于代谢组数据，使用双尾Student’s t检验在两组之间进行比较，并使用假发现率（FDR）方法调整p值，FDR < 0.05被视为显著。代谢组统计（包括倍数变化）在Python（版本3.11）中执行，而PCA、PLS-DA、热图和通路分析使用MetaboAnalyst 6.0（http://www.metaboanalyst.ca）生成，其他统计分析则使用IBM SPSS Statistics（版本22.0）进行。

结果
3.1 荧光显微镜
组织使用荧光显微镜和明场显微镜进行分析。V. alginolyticus的抑制作用在EC组中比对照组更强（图2），这通过EC组中更多细胞被碘化丙啶染成红色来证明，这也表明细胞膜通透性和细胞死亡增加。相比之下，对照组显示出最小的荧光，反映了完整的细胞膜和更高的存活率。

3.2 挑战后的非特异性免疫反应
在所有组中，头部肾脏的白细胞总数每天都在增加，直到第7天，之后逐渐减少到第14天（图3A）。在第7天和第14天，对照组和EC组之间的白细胞总数差异显著（p < 0.05）。在第7天，EC组的白细胞总数最高。此外，在这个时间点，计数也是最高的。

3.3 挑战后的免疫相关基因表达
我们检查了模式识别受体相关基因的表达，即tlr4（图4）。结果显示，在EC组中，tlr4的表达在第7天在脾脏、肝脏、鳃、皮肤和肠道中显著上调（p < 0.05），在头部肾脏中则在第3天上调。

3.4 挑战后的免疫相关基因表达
我们接下来评估了炎症相关基因的表达，即il1β（图5）和mhc2（图6）。在EC组中，il1β的表达仅在脾脏和肝脏中在第7天显著上调（p < 0.05），在头部肾脏、皮肤和肠道中则在第3天上调。此外，mhc2的表达在所有器官中显著上调（p < 0.05），特别是在第3天和第7天。总体而言，这些结果表明，在EC组中，炎症相关基因的表达在特定天后下降，表明EC有助于鱼类消除V. alginolyticus。

3.5 挑战后的肠道组织学
检查了肠道组织学（图10A–F）。MLT（图10G）、PW（图10H）、PH（图10I）、ID（图10J）和GC数量（图10K）进行了分析。注射后，NC组和EC组的肠道外观没有变化。相比之下，PC组显示出明显的异常，表现为广泛的组织损伤和出血（用红色箭头表示）。EC组在所有参数上的值最高，与其他组相比有显著差异（p < 0.05）。

3.6 挑战后的肌肉代谢组学
对V. alginolyticus挑战后14天的杂交石斑鱼的肌肉组织进行了代谢组学分析。结果显示，NC组、PC组和EC组之间的代谢谱存在明显差异。这些结果证实了三组之间存在显著差异，突显了EC处理引起的显著代谢变化。下载：下载高分辨率图像（340KB）下载：下载全尺寸图像图11. PLS-DA模型评估了每种代谢物对混合石斑鱼在受到V. alginolyticus攻击后第7天分组分离的贡献。来自偏最小二乘法、判别分析（PLS-DA）的代谢组数据的得分图：(A) NC、PC和EC0.25的PLS-DA得分图；(B) NC和PC的PLS-DA得分图。NC：阴性对照；PC：阳性对照；EC0.25：乙基咖啡酸盐剂量0.25 g/kg。每个点代表一个样本，根据处理组进行着色：EC（粉红色），NC（绿色），PC（蓝色）。使用火山图进行的差异代谢物分析显示，混合石斑鱼在不同处理组之间的代谢谱存在显著变化（图12）。在NC-PC组比较中（图12A），少数代谢物显示出显著的上调或下调，表明这些组之间的代谢发生了中等程度的变化。相比之下，NC-EC组（图12B）和PC-EC组（图12C）的比较显示许多代谢物发生了显著变化，特别是在EC组中。值得注意的是，与NC组和PC组相比，EC组中有几种代谢物显著上调或下调，这一点通过图中的红色和蓝色点簇得以体现。这些结果突显了EC引起的代谢物丰度的显著差异，说明了这种干预对鱼类的显著代谢效应。此外，火山图有效地展示了这些差异变化的范围和方向性。下载：下载高分辨率图像（309KB）下载：下载全尺寸图像图12. 火山图模型评估了混合石斑鱼在受到V. alginolyticus攻击后第7天肌肉中三种组代谢谱的比较。(A) NC和PC的火山图；(B) NC和EC0.25的火山图；(C) PC和EC0.25的火山图。NC：阴性对照；PC：阳性对照；EC0.25：乙基咖啡酸盐剂量0.25 g/kg。每个点代表一个代谢物，根据其对数2倍变化（x轴）和统计显著性（-log10（p值）（y轴）进行绘制。显著上调的代谢物用红色标出，而显著下调的代谢物用蓝色标出；灰色点表示没有显著变化的代谢物。代谢物集合的富集分析显示，不同处理组之间的代谢途径存在显著变化（图13）。在NC-PC组比较中（图13A），与鞘脂、谷胱甘肽和精氨酸代谢相关的途径显著富集，表明NC和PC混合石斑鱼之间存在不同的生化变化。在NC-EC组比较中（图13B），与色氨酸、谷胱甘肽和精氨酸代谢以及氨基酸生物合成相关的途径显著富集，进一步突显了EC处理引起的代谢重编程。同样，在PC-EC组比较中（图13C），几种氨基酸代谢途径也显示出显著富集，强调了EC暴露引起的代谢分化。下载：下载高分辨率图像（380KB）下载：下载全尺寸图像图13. 在受到V. alginolyticus攻击后第7天，不同混合石斑鱼处理的肌肉中代谢途径的富集分析。气泡图显示了从代谢组数据中识别的每对组中前25个显著富集的代谢途径：(A) NC vs. PC；(B) NC vs. EC0.25；(C) PC vs. EC0.25。NC：阴性对照；PC：阳性对照；EC0.25：乙基咖啡酸盐剂量0.25 g/kg。每个气泡代表一个代谢物，x轴表示其log2倍变化，y轴表示统计显著性（-log10（p值）。显著上调的代谢物用红色标出，而显著下调的代谢物用蓝色标出；灰色点表示没有显著变化的代谢物。虚线垂直线表示倍变化阈值，水平虚线标记p值显著性临界值。代谢物组的富集分析显示，不同处理组之间的代谢途径存在显著变化（图13）。在NC-PC组比较中（图13A），与鞘脂、谷胱甘肽和精氨酸代谢相关的途径显著富集，表明NC和PC混合石斑鱼之间存在不同的生化变化。在NC-EC组比较中（图13B），与色氨酸、谷胱甘肽和精氨酸代谢以及氨基酸生物合成相关的途径显著富集，进一步突显了EC处理引起的代谢重编程。同样，在PC-EC组比较中（图13C），几种氨基酸代谢途径也显示出显著富集，强调了EC暴露引起的代谢分化。下载：下载高分辨率图像（493KB）下载：下载全尺寸图像图14. 小提琴图显示了三种组之间代谢途径的差异。葡萄糖水平（图14A）在EC组中显著高于NC和PC组（p < 0.01），表明EC组中的葡萄糖可用性增强。同样，丙酮酸（图14B）和柠檬酸（图14C）浓度在EC组中显著高于NC和PC组（p < 0.001和p < 0.0001），表明糖酵解和TCA循环活性增强。琥珀酸水平（图14D）在EC组中也显著高于NC和PC组（p < 0.05）。综合这些结果表明，EC暴露导致关键代谢中间体的显著变化，反映了糖酵解和TCA循环通量的增加。下载：下载高分辨率图像（493KB）下载：下载全尺寸图像图14. 与葡萄糖和TCA循环代谢物相关的小提琴图：A) 葡萄糖；B) 丙酮酸；C) 柠檬酸；D) 琥珀酸；氨基酸代谢物图：E) 谷氨酰胺；F) 精氨酸；G) L-甲硫氨酸；H) L-亮氨酸，在受到V. alginolyticus攻击后第7天的不同混合石斑鱼肌肉中。NC：阴性对照；PC：阳性对照；EC0.25：乙基咖啡酸盐剂量0.25 g/kg。每个图显示了每个组内代谢物水平的分布、中位数和四分位数范围。组间统计显著性使用t检验评估，星号表示显著性水平（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001）。箭头表示EC0.25组相对于对照组的代谢物丰度增加。氨基酸代谢的定量分析显示，所有三组之间的关键代谢物水平存在显著差异，如图14中的小提琴图所示。几种关键氨基酸代谢物，特别是谷氨酰胺、精氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸，在EC组中的水平高于NC和PC组。EC组还表现出这些代谢物的标准化丰度显著增加。谷氨酰胺水平在EC组中比NC和PC组中更高，表明谷氨酰胺代谢被强烈激活（图14E）。同样，精氨酸水平在EC组中也显著高于NC和PC组（p < 0.01；图14F）。L-甲硫氨酸的丰度在EC组中也显著增加（p < 0.001和p < 0.0001），表明治疗后甲硫氨酸代谢活性增强（图14G）。此外，L-亮氨酸水平在EC组中也显著高于PC和NC组（p < 0.05和p < 0.01），表明支链氨基酸代谢的激活增强（图14H）。在所有比较中，TCA循环和氨基酸代谢途径在EC组中始终显示出高途径影响分数和显著性。因此，EC补充主要调节了应对V. alginolyticus挑战时的TCA循环和氨基酸生物合成及代谢。3.6. 挑战后的生长表现EC组表现出最佳的最终体重、体重增加、特定生长率和饲料转化率。总体而言，在挑战后第84天，EC组的生长表现优于NC和PC组。PC组的最终体重最低（257.83 ± 8.98 g）。EC组在所有参数上与其他组相比均有显著差异（p > 0.05）。此外，EC组的体重增加最多（374.82% ± 26.40%）。EC组的特定生长率与NC和PC组显著不同（表3）。表3. 在受到V. alginolyticus攻击后第84天采样的混合石斑鱼的生长性能参数。饮食初始体重（g）最终体重（g）体重增加（%）特定生长率（%/天）饲料转化率存活率（%）NC74.31 ± 3.23 a298.78 ± 17.39 b302.86 ± 30.80 b1.66 ± 0.09 a1.96 ± 0.15 c100PC74.57 ± 3.78 a257.83 ± 8.98 c246.44 ± 18.70 c1.48 ± 0.07 b2.32 ± 0.11 a53.33EC0.2574.21 ± 3.24 a349.45 ± 12.03 a374.82 ± 26.40 a1.85 ± 0.07 a1.68 ± 0.08 b90数值以平均值±标准差（n = 30）显示。同一列中带有不同字母的上标表示显著不同（p < 0.05）。4. 讨论V. alginolyticus是最重要的机会性流行病病原体之一，影响人类和海洋物种，是导致如弧菌病等重大疾病爆发的原因[24]。头部肾脏是鱼类中比血液和脾脏更重要的免疫器官[25]，[26]。头部肾脏是血细胞形成的关键部位，含有多种可通过Percoll密度梯度离心法分离的粘附白细胞，并作为鱼类的主要免疫器官[27]。白细胞对免疫活动至关重要，白细胞计数可用作水生动物健康的指标[28]。免疫刺激剂，如植物化学物质，可以增加水生物种的白细胞计数，从而增强非特异性免疫。研究调查了姜黄和Aegle marmelos果实提取物在尼罗罗非鱼中的免疫刺激作用，以及玫瑰果在虹鳟鱼中的作用[28]，[29]，[30]。饮食中添加0.05%-0.10%的β-葡聚糖可以显著增加 Pompano 鱼（Trachinotus ovatus）的总白细胞计数和比例[31]。我们之前的体外研究表明，25 μg/mL（EC0.25）的EC增强了混合石斑鱼白细胞对弧菌属的非特异性免疫反应和抗菌活性，优于较低和较高的浓度[32]。基于这一最佳体外剂量，我们随后的体内试验确认，饮食中添加0.25 g/kg（EC0.25）的EC产生了最高的免疫反应，优于0.1和0.5 g/kg[33]。因此，选择0.25 g/kg作为本研究的生物学有效水平，提供最大的免疫和生长益处而不产生不良影响。此外，基于这些发现，我们旨在进一步探索EC可能刺激的抗体形成机制，从而增强体液免疫反应和疾病抵抗力。吞噬作用是所有生物物种的基本防御机制，对免疫反应至关重要[34]。吞噬作用可用于评估物质对鱼类免疫的影响，并阐明由此产生的保护作用的基本过程[35]。饮食中添加0.5-2 g/kg的多酚可以有效地增强普通鲤鱼（Cyprinus carpio）的免疫反应[36]。此外，Syzygium aromaticum被认为可以增强吞噬作用[37]；特别是，S. aromaticum粉末补充剂可能在V. alginolyticus攻击前后改善混合石斑鱼的免疫反应，如吞噬活性。在本研究中，EC组的白细胞计数显著高于NC和PC组，表明EC刺激了白细胞的产生。在呼吸爆发期间产生的超氧阴离子对于杀菌作用至关重要。它促进了杀菌性活性氧和自由基的合成，而对宿主细胞和组织没有有害影响[38]。来自草本植物提取物的几种生物活性化合物可以促进鱼类的呼吸爆发[39]。特别是，Prunella vulgaris提取物中高浓度的salidroside可以增强非特异性免疫活性、呼吸爆发活性和吞噬活性，并降低橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）在受到Uronema marinum攻击时的死亡率[40]。此外，饮食中添加岩藻多糖（1 g/kg）可以增加虾（Litopenaeus vannamei）对V. alginolyticus的呼吸爆发和疾病抵抗力[41]。在本研究中，我们注意到EC促进了混合石斑鱼的呼吸爆发。在头部肾脏、脾脏、肝脏、肠道和鳃中评估了与免疫相关的基因表达，这些部位共同参与了硬骨鱼类对细菌感染的免疫反应协调[42]。我们观察到，在V. alginolyticus攻击后，混合石斑鱼组织中tlr4的表达上调，突显了该基因在病原体识别和先天免疫激活中的关键作用。tlr4在脾脏、肝脏、鳃和肠道中的显著诱导，在第7天的头部肾脏中较早激活，与tlr4作为革兰氏阴性细菌脂多糖的哨兵受体的功能一致[43]。il1β的双相表达在第3天的头部肾脏、皮肤和肠道达到峰值，在第7天的脾脏和肝脏达到峰值，反映了白细胞介素-1β在引发炎症和促进组织修复中的双重作用。早期诱导黏膜il1β表达有助于中性粒细胞和巨噬细胞向感染部位的招募；然而，白细胞介素-1β的阻断会因病原体清除受损而使死亡率增加40%[44]。在挑战后第7天，EC组的表现下降表明炎症得到了有效缓解；相比之下，PC组观察到持续的IL-1β上调，这反映了未经治疗的弧菌感染中观察到的不良慢性炎症模式。因此，EC可能增强了反馈机制，以防止组织损伤。EC组在挑战后第1-7天内hsp70表达的持续上调强调了hsp70在感染期间的细胞保护作用。在鱼类中，HSP70作为一种分子伴侣，在应激条件下（包括感染引起的氧化应激）维持蛋白质稳态方面起着关键作用。HSP70有助于变性蛋白质的准确折叠、组装和稳定，从而防止蛋白质聚集，并保护细胞免受活性氧的损害[45]。EC组在挑战后第7天hsp70表达的逐渐下降与PC组观察到的长期应激形成对比，这突显了EC减轻蛋白质毒性损伤的能力，可能是通过增加抗氧化活性实现的。IgM和IgT表达在挑战后第7-14天的延迟峰值，特别是在肠道中，表明了从先天免疫到适应性免疫的转变。IgM是一种系统抗体，通过激活补体来中和细胞外病原体，而IgT通过覆盖肠道病原体来防止上皮细胞侵袭，从而介导黏膜免疫[46][47]。两种免疫球蛋白类型的表达增强表明EC促进了黏膜和系统之间的相互作用，这对于对抗如V. alginolyticus这样的肠道病原体至关重要。在鱼类中，AMPs被认为是抵御各种感染的初始防线。AMPs能有效抑制或消灭细菌和病毒，是硬骨鱼类先天免疫系统的重要组成部分[48]。研究表明，中药可以增强杂交石斑鱼器官中AMPs（溶菌酶）相关基因的表达[21]。此外，还观察到EC可以抑制早期和成熟生物膜的形成、白色念珠菌的附着以及酵母向菌丝的转变[49]。我们的结果显示，EC组的鱼在肝脏和脾脏中的溶菌酶基因表达水平较高；当EC被添加到它们的饮食中时，杂交石斑鱼对细菌、真菌和病毒感染的抵抗力增强。杂交石斑鱼肌肉组织在V. alginolyticus感染后7天的代谢组学分析显示了独特的分布模式，反映了细菌感染恢复期间的复杂生理反应。许多研究表明，免疫刺激剂可以影响代谢活动并改善鱼类对疾病的免疫反应[50]。使用肌肉组织进行代谢组学分析对于理解细菌感染后的鱼类疾病过程尤为重要，因为肌肉是最大且代谢最活跃的组织，在能量代谢、免疫反应和生理适应中起着核心作用[51][52]。先前的研究表明，尽管肌肉不是主要的免疫器官，但其高代谢活性和对免疫和应激刺激的高度敏感性（表现为能量失调、氧化损伤和细胞凋亡）使其成为评估鱼类全身免疫代谢调节的合适组织[53]。我们的偏最小二乘判别分析和火山图分析表明，EC可能引发独特的适应性生化途径或免疫代谢变化，这些变化将EC的生理效应与未经处理和病原体挑战的对照组区分开来。对杂交石斑鱼肌肉组织代谢物集合的富集分析显示，在V. alginolyticus挑战和EC处理后，关键代谢途径发生了显著变化。在NC-PC组比较中，鞘脂、谷胱甘肽和精氨酸代谢途径的富集表明了病原体诱导的生化适应，包括增强的抗氧化反应和免疫信号调节。此外，在NC-EC组比较中，色氨酸、谷胱甘肽和精氨酸代谢途径以及广泛的氨基酸生物合成途径也发生了显著变化。因此，EC可能促进了独特的免疫代谢重编程，超出了其对病原体的影响。同样，PC-EC比较也显示了多个氨基酸代谢途径的显著富集。氨基酸代谢途径的富集对于体液免疫尤为重要。L-甲硫氨酸支持虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中的B细胞增殖、分化和抗体（IgM）产生[54]。谷氨酰胺分解为核苷酸生物合成提供能量，这对于抗体分泌是必要的，而甲硫氨酸有助于表观遗传调控和有效的类别转换。此外，亮氨酸激活mTORC1信号通路以促进B细胞分化，精氨酸支持淋巴细胞增殖和一氧化氮介导的免疫调节[55][56]。因此，EC处理可能通过优化体液免疫所需的代谢底物和辅因子来增强B细胞激活和抗体形成，这与之前在硬骨鱼类免疫营养学中的发现一致。EC处理后观察到的葡萄糖、丙酮酸、柠檬酸和琥珀酸水平的升高表明杂交石斑鱼肌肉组织中的糖酵解和TCA循环活性显著增强。这种代谢重编程与免疫细胞功能密切相关，特别是B细胞激活和抗体产生。激活后，B细胞需要更多的能量和生物合成底物来支持增殖和抗体合成。中枢碳代谢的上调为这些过程提供了必要的ATP和代谢中间体。在鱼类中，来自糖酵解和TCA循环通量的氨基酸如谷氨酰胺、精氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸可以促进B细胞增殖、存活和抗体分泌，强调了中枢代谢与体液免疫之间的相互作用[56][57][58]。因此，EC组中代谢中间体含量的显著变化可能反映了B细胞介导的免疫反应能力的增强。因此，有针对性的代谢干预可能提高水生物种的疾病抵抗力和免疫能力。弧菌属可以引起小鼠骨骼肌代谢的显著变化，特别是影响TCA循环和能量代谢物[59]。氨基酸代谢在石斑鱼（E. fuscoguttatus）的免疫器官（如鳃、肝脏和脾脏）的免疫反应中起着核心作用，其中谷氨酰胺、丙氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等代谢物在Vibrio vulnificus感染期间至关重要[60]。天冬氨酸可以增强黄鲶鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肌肉组织中的谷氨酰胺合成酶活性，导致谷氨酰胺水平升高[61]。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝脏和肌肉中的氨基酸代谢密切相关；肝脏是氨基酸合成、分解和调节的主要场所，而肌肉主要储存蛋白质并利用某些氨基酸[62]。琥珀酸积累和TCA循环中间体的改变是小鼠骨骼肌中V. vulnificus感染的特征[59]。因此，本研究中观察到的有机酸（包括柠檬酸和苹果酸）的独特聚集反映了宿主采用的代谢适应策略。此外，EC组与对照组的分离表明，饮食补充调节了对感染的代谢反应，可能增强了宿主在细菌挑战期间维持代谢稳态的能力。这种代谢聚集模式表明肌肉组织是杂交石斑鱼免疫-代谢相互作用的关键部位，营养干预和病原体感染机制的整合决定了对感染的总体代谢适应。色氨酸是鱼类抵抗V. alginolyticus感染最重要的代谢物；它流入糖酵解和TCA循环，促进ATP产生并增加NADPH生成，从而减少过度免疫反应期间产生的活性氧水平[63]。芳香氨基酸生物合成的增加通过支持抗氧化能力和代谢重编程来提高鱼类存活率；例如，在斑马鱼中，外源性色氨酸处理使存活率提高了23.7%，并激活了关键的糖酵解和TCA循环酶，包括己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和线粒体脱氢酶[64]。TCA循环是斑马鱼在V. alginolyticus感染期间存活的关键途径[65]。在本研究中，EC增强了肌肉代谢途径，进而进入TCA循环，从而控制了V. alginolyticus感染；因此，EC提高了V. alginolyticus挑战后的存活率。总体而言，本研究中观察到的代谢途径变化可能与B细胞激活有关，突显了免疫和代谢过程之间的相互作用。这种激活与免疫相关基因（包括IL-1β、TNF-α和MHC2）的上调有关，支持抗原呈递并随后促进IgM和IgT的产生。B细胞激活可以上调膜MHC2表达，提高鱼类天真B细胞和分泌抗体的细胞的存活率并增加IgM分泌[66]。在本研究中，IgT表达的存在与其他研究的结果一致，这些研究表明IgT在Epinephelus coioides的病毒和细菌感染后的肠道黏膜免疫中起着特殊作用[67]。同样，我们注意到IgT的倍数变化在杂交石斑鱼肠道中最高，进一步支持了IgT在黏膜免疫防御中的重要作用。EC是一种天然酚类分子，存在于多种植物中，具有抗氧化、抗纤维化和抗糖尿病特性[68]。我们之前报告了EC对与乳酸菌共培养的V. alginolyticus具有强烈的抗菌活性[9]。在本研究中，肠道组织学显示EC杂交石斑鱼的肠道形态更好，这对于在病原体压力下保持生长性能至关重要。MLT的增加表明肠道收缩更强，消化功能改善，而pH值和PW的增加表明吸收表面积更大，有利于营养吸收的提高。此外，EC杂交石斑鱼中GC数量的增加表明黏液产生增强，提供了更好的病原体入侵防护和肠道稳态维持[8]。当前发现与其他研究结果一致：膳食补充koumine和甘露聚糖寡糖分别安全地改善了普通鲤鱼（C. carpio）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的肠道形态[69][70]，即使在疾病挑战下也能提高生长性能。消化道的组织学评估可以提供关于鱼类健康和营养吸收效率的关键见解；特别是肠道形态是胃肠道完整性的关键生物标志物[71][72]。在本研究中，膳食EC补充增加了受到V. alginolyticus挑战的杂交石斑鱼的肠道MLT、pH值、PW和GC数量。EC通过改善肠道形态，提高了消化和吸收，提高了饲料利用效率和生长性能。EC组鱼在V. alginolyticus挑战后观察到的肠道形态改善可能支持更有效的营养吸收和黏膜免疫功能，这可以影响硬骨鱼类的全身能量稳态和肌肉代谢谱型。在这种情况下，我们观察到的肌肉代谢物的同时变化可能部分反映了肠道-肌肉轴的作用，即更健康的肠道屏障和黏膜免疫状态调节了感染期间的肌肉能量代谢[73]。同时，膳食EC与两个对照组相比保持了更高的生长性能。结合IgM和IgT反应的增强，这表明EC增强了有利于抗体产生的免疫-代谢相互作用，从而在感染恢复期间提高了对V. alginolyticus的防护能力，同时使鱼类能够有效利用营养进行生长。在硬骨鱼类中，IgM是主要的系统抗体，而IgT在黏膜表面尤为重要；这些类型的表达增加与对细菌感染（包括弧菌属）的更强保护相关[74]。此外，饲料转化率的提高表明EC更有效地将饲料转化为体重，可能是由于更好的肠道和黏膜免疫功能以及感染引起的应激相关的代谢成本降低。5. 结论在本研究中，EC补充显著提高了杂交石斑鱼的恢复力，表现为B细胞激活和体液免疫反应的上调。代谢组学分析显示，EC补充显著调节了氨基酸代谢和TCA循环活性；这些途径对于提供B细胞激活和抗体产生所需的生物合成和能量底物至关重要。这些代谢适应也与免疫球蛋白基因（包括IgM和IgT）表达的增加有关，从而支持了强大的抗体介导的免疫。总之，这些发现证明了EC作为杂交石斑鱼功能性饲料补充剂的有效性，强调了其在V. alginolyticus感染后恢复中的作用。因此，EC补充可能是提高水产养殖系统疾病抵抗力和整体性能的有希望策略。朱玉婷：方法论、形式分析、概念化
利益冲突
作者声明没有需要披露的利益冲突。