超氧化物歧化酶/过氧化物酶类似的MoS2量子点通过增强Klebsiella pasteurii菌的氨合成能力发挥作用

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Superoxide dismutase/peroxidase-like MoS 2 quantum dots enhance ammonia synthesis by Klebsiella pasteurii

MoS?量子点通过清除活性氧和增强电子传递促进产氨菌Klebsiella pasteurii Sb-24的氨合成效率，经优化后产氨量提升3.2倍，并发现纳米材料与细胞蛋白功能基团相互作用及氮固定相关基因表达上调。

　　

赵梦欣|陈思茹|胡珊珊|刘婷婷|滕家龙|于雅文|张家龙|周雪茹|叶群峰|秦素芳|游乐行

浙江师范大学地理与环境科学学院，金华321004，中国

摘要

二硫化钼量子点（MoS₂ QDs）因其具有类似过氧化物酶的特性而被认为是一种值得关注的抗菌纳米材料。在本研究中，我们成功利用MoS₂ QDs增强了Klebsiella pasteurii Sb-24的氨合成能力，并阐明了其作用机制。研究表明，合成的MoS₂ QDs具有超氧化物歧化酶/过氧化物酶样的活性，当将其引入K. pasteurii Sb-24中时，能有效降低细胞内的活性氧水平。此外，MoS₂ QDs纳米酶加速了Klebsiella细胞的对数生长阶段并提高了固氮活性。通过优化，该生物杂交系统实现了0.42?±?0.01?μg·mL^?1的NH₄⁺峰值产量，比未经处理的细胞高出3.2倍以上。进一步的研究发现，MoS₂ QDs纳米酶诱导了细胞蛋白功能组的改变，并促进了电子向Klebsiella细胞的传递。这些结果得到了与固氮相关的基因（特别是< />< />< />< />）上调的支持。本研究介绍了一种利用MoS₂ QDs纳米酶提高氨产量的有效方法，为未来利用混合系统进行生物制造的研究奠定了坚实的基础。

引言

氮是一种对生命维持过程至关重要的基本营养物质[1]。目前，植物生长所需的无机氮（如铵离子NH₄⁺）主要通过哈伯-博施工艺[2],[3]获得。然而，这种方法需要大量的能量输入，并且对环境造成显著破坏。在推进可持续农业方法的背景下，生物固氮（BNF）作为一种有前景的替代方案出现，提供了一种经济可行且生态可持续的氮合成方法[4],[5]。在微生物介导的固氮过程中，N₂向NH₃的酶促转化由一个称为固氮酶的复杂蛋白质网络实现。电子转移和ATP生成在这一酶促级联反应中起着关键作用[6]，这表明通过提高电子转移速率来提高BNF效率具有重要意义，从而有效满足农业生产的需求。

纳米技术与生物学的结合为促进更可持续和高效的BNF提供了重要催化剂。先前的研究提出了创新催化途径，涉及将固氮酶与各种纳米材料（如碳点[7]、Fe-Mo QDs[8]和石墨烯QDs[9]）结合，以提高微生物的N₂固定效率。然而，在酶促电子转移过程中会出现挑战，导致电子溢出并产生部分还原的氧物种（如超氧化物和羟基自由基[10],[11]。重要的是，固氮酶这种驱动N₂固定的关键酶容易受到氧气的影响和氧化应激[12]。此外，纳米材料的引入可能会加剧细胞内ROS的产生，因此迫切需要在N₂固定过程中减轻ROS的生成。最近的研究表明，像CoFe纳米酶[13]、CeO₂/CDs[14]和Ag₂Se@polyaniline[15]这样的干预措施可以作为纳米技术与BNF之间的中介，有效调节ROS代谢并保护固氮酶的功能。因此，高效的纳米酶介导的ROS清除成为BNF领域的一个非常理想的策略。

MoS₂ QDs以其类似过氧化物酶（POD）的活性而闻名，能够催化H₂O₂生成羟基自由基[16],[17]，其纳米片结构增强了抗菌活性[18],[19],[20]。然而，MoS₂ QDs在ROS清除中的类似超氧化物歧化酶（SOD）的功能及其在BNF中的应用尚未得到充分探索。对MoS₂ QDs进行潜在的结构修饰可能会利用其在溶解性、尺寸以及与细菌温和相互作用方面的优势，为提高BNF效率提供有希望的途径。这些发现激发了我们研究MoS₂ QDs对BNF效果的影响。

基于此，我们首先评估了合成MoS₂ QDs的POD/SOD样活性，以评估其清除ROS的潜力。通过生长曲线分析、荧光染色、电子显微镜观察和光度测量，评估了MoS₂ QDs对Klebsiella pasteurii Sb-24的生长和NH₃合成的影响。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒确定了K. pasteurii细胞的N₂固定活性的变化。此外，还研究了MoS₂ QDs对K. pasteurii细胞内电子转移能力及其与蛋白质功能团的相互作用的影响。同时，还量化了与N₂固定相关的基因表达水平，以阐明NH₃产生的机制。

MoS₂ QDs纳米酶的表征

本研究中使用的MoS₂ QDs购自中国江苏先锋纳米材料科技有限公司。使用日本JEM 2100F仪器通过透射电子显微镜（TEM）研究了MoS₂ QDs的表面形态。利用Al kα消色差X射线源（EscaLab 250Xi，Thermo Fisher Scientific，美国）通过X射线光电子能谱（XPS）分析了MoS₂ QDs的元素组成。

MoS₂ Qds的物理表征

图1A和图S1所示的MoS₂ QDs的TEM图像显示了平均直径约为3.0?nm的均匀不规则球形纳米结构。高分辨率TEM图像显示了明显的晶格条纹，间距为0.23?nm（图1B），这与MoS₂的（103）晶面（JCPDS 65–0160）一致，与先前的研究结果一致[21],[22]。该材料在紫外-可见光范围内表现出独特的特性。

结论

在本研究中，我们研究了MoS₂ Qds对K. pasteurii Sb-24合成NH₄⁺的影响，并评估了与N₂固定过程相关的基因表达水平。MoS₂ Qds表现出类似SOD和POD的酶活性，其整合促进了K. pasteurii细胞的对数生长阶段，同时降低了ROS水平。值得注意的是，这些纳米酶与Klebsiella细胞发生了相互作用，导致了某些变化。

CRediT作者贡献声明

于雅文：数据可视化、实验研究。 周雪茹：实验研究。 张家龙：实验研究、撰写-审稿与编辑、资金获取。 秦素芳：撰写-审稿与编辑、验证。 赵梦欣：撰写-初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。 游乐行：撰写-审稿与编辑、项目监督、资金获取。 胡珊珊：验证。 陈思茹：数据可视化、方法学设计。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22072017）和金华公益技术应用研究项目（2024–4–050）的支持。