基因组学见解与母系进化揭示了Sundaland生物多样性热点地区Chitala物种（骨舌鱼目：Notopteridae）的潜在扩散模式

《Ecology and Evolution》：Genomic Insights and Matrilineal Evolution Reveal Potential Dispersal Patterns of Chitala Species (Osteoglossomorpha: Notopteridae) in the Sundaland Biodiversity Hotspot

　　摘要

Notopteridae科鱼类分布于非洲和亚洲，在生态功能、当地经济和保护工作中发挥着重要作用。然而，来自巽他陆块（Sundaland）这一生物多样性热点的Notopteridae科鱼类的线粒体基因组数据仍然稀缺，这限制了我们对它们遗传结构和母系进化历史的全面理解。为填补这一知识空白，本研究首次报道了Chitala borneensis的完整线粒体基因组，并重新测序了同样分布于巽他陆块的Chitala lopis的线粒体基因组。这两种同域物种的线粒体基因组均表现出典型的硬骨鱼类线粒体组织结构，包含37个基因和一个富含AT碱基的调控区域，其中C. borneensis的线粒体基因组长度为16,943 bp，是迄今为止在该属中报道的最长线粒体基因组。密码子使用分析显示，这些基因组倾向于使用精氨酸、亮氨酸和丝氨酸；而非同义替换率估计表明，大多数蛋白质编码基因正在经历净化选择。系统发育分析揭示了非洲和亚洲Notopteridae科鱼类的明显分支，其中C. borneensis被确定为C. lopis的姐妹群。然而，基于线粒体基因组和COI（细胞色素c氧化酶I）的系统发育框架通过贝叶斯推断和最大似然法得出的结果支持了关于东南亚大陆和岛屿上Chitala物种系统位置的各种假设。分歧时间估计与历史生物地理重建结果一致，表明中新世时期的构造事件在Chitala物种与其他亚洲Notopteridae科鱼类的分化过程中起到了重要作用。此外，末次冰盛期期间的古水系重组似乎对这一地区Chitala物种的当前种群结构形成了关键影响。总体而言，本研究为非洲和亚洲Notopteridae科鱼类的母系进化历史提供了新的见解，特别关注了巽他陆块的Chitala物种。这些发现强调了扩大分类单元采样和获取更多分子数据的必要性，以改进种群监测、为保护遗传学提供信息，并确保这些淡水鱼类在这一生物多样性热点地区的长期存续。

1 引言

淡水鱼类是生物地理学研究的独特组成部分，因为它们的分布受到特定水生生态系统的限制，其进化历史往往与大陆漂移和重大地质事件密切相关（Lundberg 1993；Chen等人2013；Matschiner等人2020）。在这个更广泛的背景下，东南亚是一个研究不足的淡水生物多样性热点地区，拥有极高的物种多样性和许多古老谱系，使其成为研究历史生物地理学和谱系分化的关键区域（Miller和Román-Palacios 2021；?lechtová等人2021）。羽毛背鱼或刀鱼（Notopteridae科）属于古骨舌鱼类（Osteoglossomorphes），起源于早白垩世，并随后分化为两个主要谱系（Inoue等人2009）。目前，该科包含11个已确认的物种，分为四个属（Papyrocranus、Xenomystus、Chitala和Notopterus），分布于非洲、南亚和东南亚（Fricke等人2026）。它们主要栖息于热带淡水系统中，在那里扮演着重要的生态角色，并作为食物和观赏鱼类具有经济价值（Yanwirsal等人2017）。特别是Notopteridae科的动物地理分布非常显著：亚洲的代表物种（两个Notopterus属物种和六个Chitala属物种）分布于巴基斯坦、印度、尼泊尔和孟加拉国，穿过缅甸、泰国、老挝、柬埔寨、越南和马来半岛，直到印度尼西亚的岛屿（苏门答腊、爪哇和婆罗洲）。然而，非洲的物种（两个Papyrocranus属物种和一个Xenomystus属物种）仅限于西非和中非（Inoue等人2009；Lavoué等人2020；Ruzman等人2024）。在Chitala属中，三个物种（C. blanci、C. chitala和C. ornata）分布于南亚和东南亚大陆，而另外三个物种（C. borneensis、C. hypselonotus和C. lopis）则局限于巽他陆块（Wibowo等人2024；Fricke等人2026）。这些分布模式为研究非洲与印度次大陆之间的历史生物连通性提供了框架，这种连通性是由马达加斯加-塞舌尔-印度大陆分裂后的漂移以及随后的“从印度出发”扩散假说（Ali和Aitchison 2008；Klaus等人2016；Yamahira等人2021）所塑造的。从保护角度来看，大多数Notopteridae科种群处于稳定状态，但一些东南亚物种由于栖息地丧失、过度捕捞和观赏鱼贸易而面临快速减少的趋势（IUCN 2026）。值得注意的是，C. blanci和C. chitala目前被列为“近危”物种，而C. lopis则被认为已经“灭绝”，自19世纪中叶以来没有确凿的记录（Chaudhry 2010；Vidthayanon 2011）。C. lopis的假定灭绝归因于爪哇西部和中部的栖息地退化、过度开发和污染（Ng 2020）。然而，最近对泰国中部C. lopis的分类重新评估不仅推翻了其“灭绝”的假设，还对其先前被认为是巽他陆块特有物种的观点提出了挑战（Musikasinthorn和Ngamtampong 2022）。过去20年来，分子研究在澄清Notopteridae科的系统分类方面发挥了越来越重要的作用（Kumazawa和Nishida 2000；Lavoué和Sullivan 2004；Inoue等人2009）。例如，最近使用形态特征和部分线粒体COI序列确认了C. lopis在爪哇西部的原始分布地（Wibowo等人2023）。同样，线粒体DNA标记（COI和Cytb）揭示了马来半岛上存在三个Chitala物种（C. borneensis、C. lopis和C. ornata）（Ruzman等人2024）。尽管取得了这些进展，但由于分子数据不足，关于真实物种多样性的不确定性仍然存在，因为大多数研究依赖于部分位点，而全面的基因组资源仍然缺乏。尽管部分线粒体标记已被证明是有用的，但完整的线粒体基因组为研究淡水鱼类的系统发育关系提供了更高的分辨率（Satoh等人2016；Izaki等人2025）。迄今为止，只有四个已确认的Chitala物种（C. blanci、C. chitala、C. lopis和C. ornata）的完整线粒体基因组被报道（Inoue等人2009；Singh等人2019）。尽管早期的线粒体基因组研究已经解决了Notopteridae科的更广泛系统分类问题，并阐明了非洲和亚洲谱系之间的分化（Inoue等人2009；Capobianco和Friedman 2024），但我们对Chitala物种内部进化模式的理解仍有很大空白。特别是，古代水系连通性可能促进了东南亚高度多样化的Chitala谱系的进化历史和生物地理模式的形成，这一点仍知之甚少。此外，之前的研究都没有探讨Chitala物种的线粒体基因组特征和结构变异，从而限制了我们对它们遗传多样性和母系进化动态的理解。除了重建系统发育关系外，分歧时间估计对于理解主要地质和生物地理事件背景下的物种进化历史和时空扩散也至关重要（Duchêne等人2014；Parham等人2012）。因此，估计Chitala谱系的分歧时间对于阐明它们的进化轨迹和多样化模式至关重要，特别是在东南亚的历史生物地理学背景下。本研究旨在：（i）从婆罗洲的Kapuas河获取C. borneensis的新线粒体基因组；（ii）对爪哇的Cisadane河中的C. lopis进行线粒体基因组特征分析；（iii）评估基于线粒体基因组的系统发育关系和巽他陆块Chitala物种在更广泛的亚洲和非洲Notopteridae科谱系中的分歧时间。这些发现首次提供了两种Chitala物种的详细线粒体基因组特征，为它们的母系进化历史和扩散模式提供了新的见解。重要的是，本研究生成的线粒体基因组将丰富这一淡水鱼类科的基因组资源，并为未来的种群和保护遗传学研究提供有价值的工具，从而支持在这些生物多样性热点地区对这些物种实施更精确的保护策略。

2 材料与方法

2.1 分类单元采样和形态学调查

从巽他陆块生物多样性热点地区的两个河流系统中收集了两种Notopteridae科鱼类，分别是来自婆罗洲Kapuas河的C. borneensis和来自爪哇Cisadane河的C. lopis（图1a，表S1）。采样使用了抄网，并收集了地理坐标和现场记录等辅助数据。通过结合形态学评估和DNA条形码技术，确认了这些物种为C. borneensis和C. lopis（Wibowo等人2023）。选定的代表性标本（C. borneensis：MZB.FISH 26614；C. lopis：MZB.FISH 26615）保存在印度尼西亚茂物的Bogoriense博物馆（Wibowo等人2023），用于后续的线粒体基因组测序（图1a）。提取的组织样本（约20克）被存放在印度尼西亚Cibinong的国家研究与创新机构（BRIN）以及韩国浦项国立大学海洋生物学系的分子生理学实验室。

2.2 伦理声明

所有标本采集程序均遵循印度尼西亚海洋事务和渔业部的官方指南（PER.10/MEN/2010和Kepmen KP No. 1/2021），并且该研究得到了印度尼西亚海洋事务和渔业部海洋与渔业研究及人力资源机构的批准（2023/BRSDM/XII/2021）。分子实验按照东道机构批准的相关机构和法规进行（批准编号PKNUIACUC-2025-16）。采集的标本通过向水族箱水中直接添加浓度为600 μL·L?1的2-苯氧乙醇进行安乐死（Nahon等人2017）。确认死亡后，用Milli-Q水（Merck-Millipore，Molsheim，法国）冲洗标本三次，然后进行分子分析。所有实验程序均符合ARRIVE 2.0指南（https://arriveguidelines.org）（Percie du Sert等人2020）。

2.3 DNA提取和下一代测序

使用Quick-DNA MagBead Plus Kit（Zymo Research，Irvine，CA）根据制造商的标准协议提取总基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific D1000，WA，美国）评估提取DNA的质量和数量。为了获得两种Chitala物种的完整线粒体基因组，在韩国大田的Macrogen公司使用NovaSeq平台（Illumina Inc.，USA）进行了测序（https://dna.macrogen.com/）。按照TruSeq Nano DNA High Throughput Library Prep Kit（Illumina Inc.，USA）的制造商说明准备了测序文库。简要来说，100 ng的基因组DNA使用适应性聚焦声学技术（Covaris，USA）进行片段化，产生末端钝化的双链DNA分子并添加5′磷酸化修饰。末端修复后，使用基于珠子的方法对DNA片段进行大小选择，添加“A”碱基，并用TruSeq DNA UD Indexing适配器连接。所得文库经过纯化、PCR富集，并使用qPCR（KAPA Library Quantification Kit）进行定量，质量评估在Agilent 4200 TapeStation D1000上进行。双端测序（2 × 150 bp）产生了超过2000万个原始读段，随后使用Cutadapt（http://code.google.com/p/cutadapt/）去除适配器序列和低质量碱基。

2.4 线粒体基因组组装和注释

使用Geneious Prime v2023.0.1（Kearse等人2012）从高质量的配对端NGS读段组装了两种Chitala物种的线粒体基因组。组装是通过参考与近缘物种的线粒体基因组进行映射来完成的，使用默认的映射算法。使用MEGA v12手动检查重叠区域的比对以确保组装准确性（Kumar等人2024）。基因的边界和方向使用两个独立的注释平台进行验证，分别是Mitofish MitoAnnotator网络服务器（https://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/annotation/input/）和Galaxy v1.1.6网络服务器中实现的MITOS2 de novo注释工具（用于后生动物线粒体基因组）（Iwasaki等人2013；Al Arab等人2017；Donath等人2019）。通过分析基于脊椎动物线粒体遗传密码的开放阅读框查找器（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）翻译的氨基酸序列进一步确认了蛋白质编码基因（PCGs）。两种Chitala物种（C. borneensis和C. lopis）的注释线粒体基因组被存入GenBank，并获得了唯一的访问编号。

2.5 线粒体基因组特征和比较分析

使用MitoAnnotator构建了两种新组装的Chitala物种的环状线粒体基因组图谱，以便于基因组可视化和注释。随后进行了比较分析，以评估这两种新测序的Chitala物种的基因组结构和序列变异与之前报道的六个亚洲Notopteridae科物种的代表性物种的关系（表S1）。使用Microsoft Excel v2016手动计算了分隔相邻基因的基因间间隔区和Chitala物种之间的重叠区域。在MEGA v12中确定了PCGs、核糖体RNA基因（rRNAs）和转运RNA基因（tRNAs）的核苷酸组成。根据既定公式计算了碱基组成偏斜：AT-skew = (A?T)/(A + T) 和 GC-skew = (G?C)/(G + C)（Perna和Kocher 1995）。每个PCG的起始和终止密码子都经过验证，以确保它们符合脊椎动物线粒体遗传密码的标准，使用的是MEGA v12软件。亚洲无尾目物种的核苷酸多样性（π）分析是通过DnaSP v6.0软件进行的，窗口长度为200 bp，步长为25 bp（Rozas等人，2017年）。PCG中的密码子饱和度是通过使用DAMBE v6.0软件可视化转换（s）和颠换（v）的模式来评估的（Xia，2017年）。亚洲无尾目物种之间的非同义（Ka）和同义（Ks）替换率也使用DnaSP v6.0进行了比较分析。还包括在五个Chitala物种中评估密码子使用情况指标，如相对同义密码子使用率、氨基酸组成以及密码子分布模式（DnaSP v6.0）。此外，还使用Galaxy v1.1.6网站上的tRNA和tmRNA检测工具Aragorn预测了C. borneensis和C. lopis的二级结构（Laslett，2004年）。

2.6 系统发育推断

共有12个线粒体基因组被选为系统发育数据集，包括两个新测序的基因组和十个从公共数据库下载的基因组，代表了九种无尾目物种（表S1）。然而，为了评估所有有效物种的无尾目谱系，还从GenBank中检索了Chitala hypselonotus（登录号PP132012）和Papyrocranus afer（登录号HM882696）的部分COI序列，并将其纳入额外的数据集中以支持系统发育分析。代表Mormyridae科的Gnathonemus petersii（AP008928）的线粒体基因组和部分COI也被包括在内作为外群。所有13个PCG使用iTaxoTools v0.1软件进行了串联，以进行基于线粒体基因组的系统发育分析（Vences等人，2021年）。基于PartitionFinder v2计算的最低贝叶斯信息准则（BIC），选择了GTR + G + I模型作为最优模型（Lanfear等人，2017年）。贝叶斯推断（BA）树是在MrBayes v3.1.2中重建的，使用nst = 6，一个冷链和三个热链的MCMC方法，对于线粒体基因组数据集运行了1000万代，对于COI数据集运行了50万代，前25%的样本被丢弃作为燃烧期（Ronquist等人，2012年）。MCMC分析一直进行到收敛，收敛的标志是分裂频率的标准差达到0.01，以及所有参数的潜在尺度减少因子（PSRF）接近1.0。最大似然（ML）拓扑结构是使用PhyML v3.0生成的，分支支持通过1000次自助法复制进行评估（Guindon等人，2010年）。BA和ML分析的树可视化是在iTOL v7中完成的（https://itol.embl.de/login.cgi）（Letunic和Bork，2024年）。

2.7 分歧时间估计

本研究中的分歧时间是使用MEGA v12中实现的RelTime方法估计的，该方法减少了与BA分析相关的计算负担（Tamura等人，2012年；Mello等人，2017年；Mello，2018年）。串联的PCGs使用之前推断的ML拓扑结构（.nwk文件）作为参考树进行分析，并指定了适当的外群分类单元。在系统发育和古生物学研究中，广泛推荐使用化石记录作为主要校准点的分歧时间估计方法，因为它提供了直接和独立的时间约束（Duchêne等人，2014年；Parham等人，2012年）。然而，当相关的化石记录稀少或不可用时，使用次级校准点在方法学上也是可以接受的（Hipsley和Müller，2014年；Schenk，2016年）。因此，当前研究中无尾目进化历史的分歧时间分析使用了来自先前研究的两个次级校准点（Lavoué，2016年；Capobianco和Friedman，2024年）。这些校准点分别是：（i）现存非洲和亚洲刀鱼的分支可能发生在晚白垩世（95% HPD = 104.3–60.6 Ma），这远在东冈瓦纳和西冈瓦纳分裂之后；（ii）亚洲无尾目谱系（Notopterus vs. Chitala）的分支。然而，对于Notopterus和Chitala之间的分歧，没有报告明确的最小或最大年龄限制（Capobianco和Friedman，2024年）。因此，为了确保分歧时间分析的一致性，在两种情况下都应用了一个固定的最大时间界限，并使用MEGA v12中的TimeTree框架来实现（Ho等人，2015年；Mello，2018年）。

3 结果

3.1 线粒体基因组的结构和组织

C. borneensis（登录号OR466573，16,943 bp）和C. lopis（登录号OQ446559，16,176 bp）的环状线粒体基因组包含13个PCG、2个rRNA、22个tRNA和一个非编码的AT富集控制区域（CR）（图1b,c）。其中，28个基因位于重链上，而一个PCG（ND6）和八个tRNA（trnQ、trnA、trnN、trnC、trnY、trnS2、trnE和trnP）位于轻链上（表1）。C. borneensis和C. lopis中基因在重链和轻链上的分布与其他Chitala物种一致，线粒体基因组的长度从16,164 bp（C. ornata）到16,943 bp（C. borneensis）不等（表2）。C. borneensis和C. lopis的线粒体基因组分别有七个和六个基因重叠区域，总长度分别为34 bp和25 bp，两个物种中最长的重叠区域位于ATP8和ATP6之间。C. borneensis和C. lopis的线粒体基因组还包含总共66 bp的基因间间隔区，分别为11个和12个间隔区，每个物种中最长的间隔区位于trnN和trnC之间（表S2）。此外，使用Aragorn在Galaxy v1.1.6网络服务器上通过tRNA和tmRNA检测预测了C. borneensis和C. lopis的tRNA的二级结构（Laslett，2004年）。

2.6 系统发育推断

总共选择了12个线粒体基因组，包括两个新测序的基因组和十个从公共数据库下载的基因组，代表了九种无尾目物种，用于构建系统发育数据集（表S1）。然而，为了评估所有有效物种的无尾目谱系，还从GenBank中检索了Chitala hypselonotus（登录号PP132012）和Papyrocranus afer（登录号HM882696）的部分COI序列，并将其纳入额外的数据集中以支持系统发育分析。作为外群的还包括代表Mormyridae科的Gnathonemus petersii（AP008928）的线粒体基因组和部分COI。所有13个PCG使用iTaxoTools v0.1软件进行了串联，以进行基于线粒体基因组的系统发育分析（Vences等人，2021年）。基于PartitionFinder v2计算的最低贝叶斯信息准则（BIC），选择了GTR + G + I模型作为最优模型（Lanfear等人，2017年）。贝叶斯推断（BA）树是在MrBayes v3.1.2中使用的，设置了nst = 6个MCMC链，一个冷链和三个热链，线粒体基因组数据集运行了1000万代，COI数据集运行了500,000代，前25%的样本被丢弃作为燃烧期（Ronquist等人，2012年）。MCMC分析一直进行到收敛，收敛的标志是分裂频率的标准差达到0.01，以及所有参数的潜在尺度减少因子（PSRF）接近1.0。最大似然（ML）拓扑结构是使用PhyML v3.0生成的，分支支持通过1000次自助法复制进行评估（Guindon等人，2010年）。BA和ML分析的树可视化是在iTOL v7中完成的（https://itol.embl.de/login.cgi）（Letunic和Bork，2024年）。

2.7 分歧时间估计

本研究中的分歧时间是使用MEGA v12中实现的RelTime方法估计的，该方法减少了与BA分析相关的计算负担（Tamura等人，2012年；Mello等人，2017年；Mello，2018年）。串联的PCGs使用之前推断的ML拓扑结构（.nwk文件）作为参考树进行分析，并指定了适当的外群分类单元。在系统发育和古生物学研究中，通常推荐使用化石记录作为主要校准点的分歧时间估计方法，因为它提供了直接和独立的时间约束（Duchêne等人，2014年；Parham等人，2012年）。然而，当相关的化石记录稀少或不可用时，使用次级校准点在方法学上也是可以接受的（Hipsley和Müller，2014年；Schenk，2016年）。因此，本研究中的无尾目进化历史的分歧时间分析使用了来自先前研究的两个次级校准点（Lavoué，2016年；Capobianco和Friedman，2024年）。这些校准点分别是：（i）现存非洲和亚洲刀鱼的分支可能发生在晚白垩世（95% HPD = 104.3–60.6 Ma），这远在东冈瓦纳和西冈瓦纳分裂之后；（ii）亚洲无尾目谱系（Notopterus vs. Chitala）的分支。然而，对于Notopterus和Chitala之间的分歧，没有报告明确的最小或最大年龄限制（Capobianco和Friedman，2024年）。因此，为了确保分歧时间分析的一致性，在两种情况下都应用了一个固定的最大时间界限，并使用MEGA v12中的TimeTree框架来实现（Ho等人，2015年；Mello，2018年）。Ka/Ks比率从COI基因的0.01293 ± 0.00491到ND4基因的1.04842 ± 0.07194不等，顺序为：COI < COII < ND4L < Cytb < ATP6 < ND1 < ND5 < ND3 < ND6 < ND2 < ATP8 < COIII < ND4（图2c；表S4）。密码子使用分析进一步表明，在五种Chitala物种的线粒体基因组（PCGs）中，编码精氨酸、亮氨酸和丝氨酸的密码子使用频率最高，而编码甲硫氨酸和色氨酸的密码子使用频率相对较低（图2d；表S5）。相对同义密码子使用分析显示，编码丙氨酸的密码子GCG在所研究的Chitala线粒体基因组中的使用频率明显低于其同义密码子（图3；表S5）。

**图2**
亚洲无鳍鱼类物种的遗传多样性和密码子使用情况。(a) 线粒体基因组（PCGs）中的核苷酸多样性（π）。(b) 基于FN84距离，散点图展示了转换（s）和颠换（v）与遗传分化之间的关系。(c) 每个PCG的成对Ka/Ks比率箱形图。(d) 五种Chitala物种中的密码子使用丰度。

**图3**
五种Chitala物种的相对同义密码子使用（RSCU）的比较分析，x轴按氨基酸分组，y轴显示RSCU值。

**3.4 核糖体RNA和转运RNA基因**
在C. borneensis和C. lopis的线粒体基因组中，rRNA基因的总长度分别为2673 bp和2674 bp，分别占总线粒体基因组的15.77%和16.52%。这些基因包括一个小的核糖体RNA（12S rRNA，长度为972 bp）和一个大的核糖体RNA（16S rRNA，长度为1701 bp）（表1）。在其他Chitala物种中，rRNA基因的长度从C. chitala的2658 bp到C. lopis和C. ornata的2674 bp不等。rRNA基因具有AT偏好性，AT含量从C. lopis的53.83%到C. ornata的55.31%不等。比较分析显示，AT偏斜值从C. chitala的0.270到C. lopis的0.309不等，而GC偏斜值从C. lopis的?0.134到C. chitala的?0.098不等（表2）。此外，两个线粒体基因组都包含22个tRNA基因，长度从66 bp（trnC）到75 bp不等，分别占总线粒体基因组的9.17%（C. borneensis）和9.60%（C. lopis）（表1）。在Chitala物种中，tRNA的AT偏好性从C. blanci的56.40%到C. borneensis的57.01%不等，AT偏斜值从C. ornata的0.036到C. chitala的0.053不等，GC偏斜值从C. chitala的0.015到C. ornata的0.033不等（表2）。C. borneensis和C. lopis的大多数tRNA形成了典型的三叶草结构，除了trnS1，它缺乏二氢尿苷（DHU）茎。在C. borneensis中，13个tRNA（trnL2、trnQ、trnW、trnA、trnN、trnC、trnY、trnS2、trnD、trnG、trnH、trnE和trnP）同时使用Watson-Crick和摆动碱基配对，而其余9个仅使用Watson-Crick配对（图4）。在C. lopis中，15个tRNA（trnL2、trnI、trnQ、trnW、trnA、trnC、trnY、trnS2、trnD、trnG、trnR、trnH、trnE和trnT）使用这两种类型的碱基配对，其余7个仅使用Watson-Crick配对。与GenBank中的C. lopis线粒体基因组（AP008922）的比较分析进一步揭示了trnQ、trnC和trnR中的替代碱基配对（图5）。

**图4**
C. borneensis中22个tRNA的二级结构，标有全名和IUPAC-IUB单字母氨基酸代码，最后一个结构显示了核苷酸位置和茎环细节。Watson-Crick和摆动碱基配对分别用黑色和红色条表示，突出显示了结构差异。

**3.5 母系系统发育关系**
使用完整的线粒体基因组和部分COI序列，通过BA和ML方法构建了无鳍鱼类物种的母系系统发育关系（图6a–d）。值得注意的是，由于缺乏线粒体基因组数据，两种无鳍鱼类物种C. hypselonotus（来自亚洲）和P. afer（来自非洲）仅包含在COI系统发育分析中。总体而言，无论是基于线粒体基因组还是部分COI，所有系统发育树都一致地恢复了两个主要的地理分支，分别对应于非洲和亚洲的分类群。非洲棕色刀鱼（Xenomystus nigri）形成了一个单系群，并与其他非洲Papyrocranus属的无鳍鱼类紧密聚类。我们的分析进一步支持了两个亚洲亚支系（包括Chitala和Notopterus属）的单系性，具有较高的自举概率和后验概率值。新测序的C. borneensis序列在BA和ML系统发育树中都被确定为C. lopis的姐妹群。此外，新测序的C. lopis标本（OQ446559）与之前发表的东南亚序列（AP008922）紧密聚类，证实了它们的种内身份（图6a–d）。然而，在部分COI基因的BA分析中，观察到几种Chitala物种（C. hypselonotus、C. blanci和C. ornata）之间存在多分支现象（图6c）。

**3.6 无鳍鱼类的分化时间**
在ML框架内实现的RelTime方法根据当前数据集提供了Notopteridae物种所有内部节点的分化时间估计。因此，TimeTree表明非洲和亚洲谱系的分化发生在白垩纪（104.3 Ma），与马达加斯加-塞舌尔-印度大陆块从非洲分离的时间一致（图7a,b）。在亚洲支系中，Notopterus和Chitala属之间的分化发生在渐新世（32 Ma）。当前的分化时间估计还表明，两个非洲属Papyrocranus和Xenomystus在始新世（约67 Ma）分化。在Chitala属内，大陆物种（C. blanci、C. ornata和C. chitala）与岛屿物种（C. borneensis和C. lopis）之间的分化发生在中新世（约17至18 Ma）。值得注意的是，本研究的重点物种C. borneensis和C. lopis也在中新世分化（约13 Ma）。在Notopterus属中，南亚的N. synurus与东南亚的N. notopterus的分化估计发生在约18 Ma，与大陆和岛屿Chitala物种的分化时间一致（图7a）。

**4 讨论**
**4.1 线粒体基因组的见解**
本研究揭示了Chitala物种的全面线粒体基因组特征，揭示了Notopteridae科内特定谱系的结构性、组成特征和进化动态。一致的核苷酸组成和明显的AT偏好性，以及观察到的遗传变异，可能反映了影响线粒体功能的谱系特异性突变压力，这种模式在其他硬骨鱼类中也有所报道（Kundu等人2024；Aini等人2025）。在C. borneensis和C. lopis中观察到的链特异性偏斜模式表明可能存在影响线粒体复制和转录效率和方向性的进化限制（Satoh等人2016）。Chitala物种中不完全终止密码子的频繁出现表明PCGs中存在转录后多聚腺苷酸化（Izaki等人2025）。C. borneensis和C. lopis的tRNA基因显示出高度保守的结构特征，仅有轻微的种间变异，反映了它们在蛋白质合成和基因组完整性中的关键作用（Sebastian等人2022）。此外，trnS1中缺乏DHU茎以及这两种Chitala物种中多个tRNA存在摆动碱基配对可能代表了保持线粒体翻译效率的适应机制（Yoon等人2024）。亚洲无鳍鱼类物种的核苷酸多样性分析揭示了显著的种内变异，表明了复杂的进化历史（Ord等人2023）。替换饱和度评估进一步证实了这些线粒体基因组的系统发育效用，验证了它们用于进化推断的可行性（Aini等人2025）。在亚洲无鳍鱼类物种的PCGs中，Ka/Ks比率主要为< 1，表明存在净化选择。相比之下，ND4基因显示出最高的Ka/Ks比率（1.048），这应谨慎解释，可能反映了放松的净化选择或随机效应，而不是强选择的证据（Nei和Kumar 2000）。亚洲无鳍鱼类物种的PCGs之间Ka/Ks排名的变化强调了与线粒体能量代谢相关的功能限制（Ballantyne 2001）。五种Chitala物种中的密码子使用模式可能受到核苷酸组成、翻译效率需求和选择压力的影响（Sebastian等人2022）。五种Chitala物种中精氨酸、亮氨酸和丝氨酸的主要密码子可能反映了它们在线粒体蛋白质中的结构和能量重要性（Ballantyne 2001），而代表性不足的密码子，包括甲硫氨酸和色氨酸，可能优化了翻译的准确性和效率（Cope和Gilchrist 2022）。

**4.2 Notopteridae的母系进化历史**
无鳍鱼类的进化历史最初是根据形态数据推断的（Nelson 1968；Hilton 2003）。随后使用部分线粒体标记、完整的线粒体基因组和核基因的分子研究细化了这些谱系的系统发育理解（Inoue等人2009；Kumazawa和Nishida 2000；Lavoué和Sullivan 2004）。因此，基于线粒体基因组的当前系统发育分析通过揭示非洲和亚洲无鳍鱼类谱系之间的明显生物地理分离，证实了之前的进化研究（Inoue等人2009；Lavoué 2016；Capobianco和Friedman 2024）。这种扩散历史也与地质框架一致，即印度板块向欧亚大陆北部漂移期间发生的重大构造事件（Ali和Aitchison 2008）。估计的分化时间表明，非洲和亚洲无鳍鱼类在白垩纪分化（约130–160 Ma，van Hinsbergen等人2011；Yoshida和Hamano 2015）。这些观察表明，亚洲无鳍鱼类可能起源于印度板块从非洲分离后的一个祖先谱系，并随后经历了长时间的隔离。在此期间，印度大陆可能起到了“生物渡轮”的作用，促进了亚洲无鳍鱼类的进化。值得注意的是，分化时间的估计进一步表明，亚洲Notopterus和Chitala谱系的分化发生在印度板块与欧亚大陆完全碰撞之前（约35–55 Ma）。此外，几种Chitala物种在中新世期间的进一步多样化可能反映了碰撞后的扩散事件（Leroy等人2023）。类似的生物地理模式在其他硬骨鱼类谱系中也有很好的记录，这些谱系表现出非洲和亚洲鱼类之间的强烈亲缘关系（Capobianco和Friedman 2024；Yamahira等人2021）。

**4.3 Chitala物种在Sundaland的扩散模式**
当前的Chitala物种系统发育分析在很大程度上支持了先前的假设，并强烈支持C. lopis和C. borneensis之间的密切关系（Inoue等人2009；Wibowo等人2023）。当前的分化时间估计表明，这两个物种在中新世分化，并在印度尼西亚的苏门答腊岛和婆罗洲岛上表现出重叠的地理分布。考虑到它们的分化历史和共存分布，这两种物种的重叠范围可能受到北Sunda河流网络的古排水系统的影响（de Bruyn等人2013；Sholihah等人2021）。此外，最近在泰国中部的Pasak河发现的C. lopis，以及其在爪哇岛（西部和中部河流流域）的有限分布，进一步支持了受Siam-North Sunda和East Sunda河流网络影响的歷史生物地理模式（图7c）。尽管如此，在基于分子系统发育（BA）和最大似然（ML）的框架下，大陆和岛屿分布的Chitala物种之间的关系往往呈现出复杂的情景，这支持了不同的进化假说。特别是，大陆物种C. blanci在基于线粒体基因组的BA分析中被认为是Chitala物种中最早分化的谱系，或者在基于COI（细胞色素c氧化酶I）的BA树中被描绘为与C. ornata和C. hypselonotus同时分化。相比之下，基于线粒体基因组和COI数据的ML分析表明，C. blanci与岛屿物种C. lopis和C. borneensis是从一个共同的祖先同时分化出来的。此外，仅从部分COI序列推断出的C. hypselonotus的系统发育位置在不同的分析方法中有所不同。BA分析显示C. hypselonotus、C. blanci和C. ornata属于一个多分支群，而ML分析则将C. hypselonotus作为C. ornata的姐妹群。因此，另一种假说是C. hypselonotus可能是C. ornata或C. blanci的姐妹谱系。另外，考虑到C. hypselonotus在大陆和岛屿上的分散分布，可以推断其种群的异域扩散可能是由于与古代马六甲海峡和北巽他河流网络相关的古排水系统所促进的（图7c）。总体而言，基于线粒体基因组和COI的系统发育拓扑结构表明，东南亚特别是巽他地区的Chitala物种的进化历史比简单的单向祖先扩散模型更为复杂。此外，Chitala在印度尼西亚群岛中的当前分布和遗传连通性模式表明，历史上通过广泛的陆桥和古河流排水网络存在连通性（Voris 2000；Cheng和Faidi 2025）。进一步的证据表明，尽管末次冰盛期之前的景观连通性可能促进了大量的基因流动，但最近的系统地理学和群体遗传学分析揭示了Chitala和其他淡水鱼类在印度尼西亚岛屿上的不同种群和隐秘的遗传多样性（Utami等人2022；Wibowo等人2023）。这种遗传多样性很可能反映了由于冰后期海平面上升和古排水系统的破碎化而导致的长期地理隔离和历史上的殖民过程。

4.4 限制与建议

本研究报道了两种Chitala物种（C. borneensis和C. lopis）的完整线粒体基因组，并研究了它们的系统发育关系和分化时间，以推断历史生物地理模式，尽管应承认一些限制。为了将全球Notopteridae谱系置于上下文中，从GenBank中获取了部分线粒体COI序列，包括亚洲的C. hypselonotus和非洲的P. afer的序列。虽然这些序列为系统发育推断提供了初步支持，但它们不足以完全解决母系进化关系。因此，未来的研究应优先生成这两种Notopteridae物种的完整线粒体基因组，以便更准确地重建它们的进化历史。此外，目前对C. lopis和C. borneensis的分析都仅依赖于线粒体标记，这些标记仅反映了母系遗传。因此，为了更全面地了解它们的进化历史，未来的研究应整合额外的遗传标记，特别是核基因和系统基因组学方法。因此，对南亚和东南亚所有Chitala物种进行彻底采样，并结合多基因位点的系统地理学分析，将进一步阐明它们在大陆和岛屿生态系统中的真实遗传多样性和种群扩散模式。此外，本研究中的分化时间估计仅基于Notopteridae谱系，并且由于仅依赖于先前研究中的两个次要校准点以及仅使用线粒体数据而受到限制。因此，未来的研究应扩展Osteoglossomorpha谱系的全面分子数据集，并纳入额外的校准点，包括主要化石证据，以获得更精确和可靠的分化时间估计。最后，基于地质和水文数据重建古排水系统的持续进展提供了有希望的机会。因此，将这种精细的古排水模型与分子钟分析相结合，将大大增强我们推断巽他生物多样性热点地区这些淡水物种的进化历史和扩散动态的能力。

5 结论

本研究提供了C. borneensis和C. lopis线粒体基因组的全面特征描述，大大扩展了Notopteridae科的可用遗传资源。两个线粒体基因组都表现出保守的基因内容和顺序，以及整体上偏向AT的核苷酸组成。系统发育分析强有力地支持了亚洲和非洲Notopteridae的单系性，并确定C. borneensis和C. lopis是姐妹群。分化时间估计与历史生物地理重建一致，表明中新世的构造事件推动了Chitala物种与其他亚洲Notopteridae物种的分化。此外，末次冰盛期期间的古排水系统重组在塑造巽他地区岛屿栖息地中Chitala的当前种群结构方面发挥了关键作用。总的来说，这些发现为Chitala的线粒体基因组结构和进化动态提供了宝贵的见解，建立了支持分类学解析的稳健分子框架。鉴于这些物种的分布受限和高度脆弱性，扩大采样范围和生成额外的分子数据对于有效的种群监测、指导保护遗传学以及确保这些淡水鱼类在巽他生物多样性热点地区的长期存在至关重要。

作者贡献

Flandrianto Sih Palimirmo：数据管理（支持）、正式分析（支持）、方法学（支持）、写作——初稿（支持）。Angkasa Putra：数据管理（支持）、正式分析（支持）、方法学（支持）、软件（支持）、写作——初稿（支持）。Arif Wibowo：资金获取（平等）、资源（支持）、监督（支持）、验证（支持）。Sarifah Aini：方法学（支持）、软件（支持）。Ah Ran Kim：软件（支持）、可视化（支持）。Soo Rin Lee：调查（支持）、可视化（支持）。Hye-Eun Kang：正式分析（支持）、调查（支持）。Jung Hwa Choi：可视化（支持）、写作——审阅和编辑（支持）。Kurniawan Kurniawan：数据管理（支持）、验证（支持）。Vitas Atmadi Prakoso：方法学（支持）、验证（支持）。Indah Lestari Surbani：数据管理（支持）、调查（支持）。Hye-Woo Kim：概念化（平等）、项目管理（平等）、资源（支持）、监督（支持）、写作——审阅和编辑（支持）。Kyoungmi Kang：资金获取（平等）、验证（支持）、可视化（支持）、写作——审阅和编辑（支持）。Shantanu Kundu：概念化（平等）、项目管理（平等）、资源（支持）、监督（支持）、写作——初稿（支持）、写作——审阅和编辑（支持）。

致谢

作者衷心感谢印度尼西亚国家研究与创新机构（BRIN）的实验室同事们在这项研究中的支持。F.S.P.和A.W.感谢联合国粮食及农业组织（FAO）和全球环境基金（GEF）项目“高保护价值淡水生态系统中的内陆渔业实践（IFish）”提供的资金支持，FAO项目代号：GCP/INS/303/GFF，GEF ID：5759。作者还衷心感谢Imon Abedin和Muhammad Misi Muslimin对本文中地图制作的宝贵贡献。

资金支持

本研究得到了韩国海洋与渔业部资助的“全球蓝色食品领导项目（RS-2025-02373103）”的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可在NCBI GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中公开获取，访问编号分别为OR466573和OQ446559。