一种伪隐秘硅藻物种复合体Pinnularia acidicola的多相分类系统，包括新物种的描述

《European Journal of Phycology》：A polyphasic taxonomy of the pseudocryptic diatom species complex Pinnularia acidicola, including description of new species

　　摘要：硅藻是地球上物种最丰富、对环境影响最大的原生生物群体之一，在许多（半）水生生态系统的生物地球化学循环和食物网中发挥着重要作用。然而，它们的许多物种多样性超出了传统显微镜方法的分辨率范围，而这些方法通常是、有时甚至是唯一用于硅藻分类的方法。其中一个隐秘的物种复合体是Pinnularia acidicola，最近的研究表明它至少由三个不同的物种级谱系组成，这些谱系栖息在南半球的偏远岛屿上。在这里，我们（1）使用已发表和新建立的菌株，将P. acidicola复合体与其最近的亲属P. subcapitata和P. sinistra进行比较；（2）整合了所有现有的证据——包括光学和扫描电子显微镜观察、常规和几何形态测量、分子系统发育学、基于eDNA的生物地理学和生态学数据；（3）正式区分了这三个物种。P. acidicola这一名称保留给在Ile de la Possession和Marion Island发现的模式种群，而在Réunion发现的种群被描述为P. acidireunionensis。在Ile Amsterdam采集的种群被重新认定为之前已描述的P. vixconspicua，并指定了其表型特征和DNA序列。这三个物种在基因上是不同的，具有不重叠的地理分布，并且在壳瓣尺寸、带状结构和条纹方面存在细微但显著的形态差异。尽管如此，这三个物种似乎都偏好酸性土壤、池塘或溪流环境。总的来说，我们对P. acidicola物种复合体的全面分析强调了结合形态学和遗传学方法揭示硅藻物种多样性的重要性。

关键词：硅藻门；隐秘物种多样性；环境DNA（eDNA）；综合分类学；岛屿生物地理学；亚南极地区

引言：硅藻门（Bacillariophyta），通常被称为硅藻，是一类单细胞褐藻，其特征是具有复杂装饰的硅质细胞壁——即壳瓣。这种坚固且相对稳定的结构富含诊断特征，对于研究硅藻的科学家来说具有显著优势，与其他研究所谓软藻的藻类学家相比。事实上，到目前为止，壳瓣形态是硅藻分类的主要依据（Kollár等人，2025年），这与其他藻类群体形成了鲜明对比（Leliaert等人，2014年）。尽管在不同分类等级上壳瓣存在很大差异，但物种级别的形态差异往往很微妙。因此，仅凭壳瓣形态并不能完全反映硅藻的丰富物种多样性。据估计，现存硅藻有10万种，属于光合真核生物中物种最丰富的谱系之一（Mann & Vanormelingen，2013年），占所有有效描述的藻类物种的近40%（Guiry，2024年）。然而，越来越多的证据表明，许多已描述的物种实际上代表了隐秘物种复合体（Amato等人，2019年）。隐秘物种是在繁殖和基因上隔离的物种，它们在形态上无法区分（Mann & Evans，2008年）。虽然硅藻中也存在这样的物种（例如Stock等人，2019年；Pinseel等人，2020年），但很可能大多数甚至所有假定的隐秘物种实际上是伪隐秘物种。伪隐秘物种在形态上非常相似，但如果“足够小心”仍然可以区分（Mann & Evans，2008年），尽管仍存在较高的误识别风险。在这方面，例如通过扫描电子显微镜（SEM）检查、形态数据的统计分析（如几何形态测量；Poulí?ková等人，2010年），或者简单地超越传统的定量诊断特征（如壳瓣尺寸或条纹密度（在SEM或光学显微镜下观察；LM）可以实现足够的分辨率来界定物种。最后，由于我们对硅藻生物地理学的理解进展（例如Vyverman等人，2007年；Vanormelingen等人，2008a；Pinseel等人，2020年，2024年），也可以区分半隐秘物种。半隐秘物种可以根据形态数据准确识别，但前提是知道标本的地理来源或其他种群特征（Mann & Evans，2008年）。隐秘物种多样性在硅藻进化树中广泛存在（例如Mann等人，2004年；Sarno等人，2005年；Evans等人，2007年；Vanormelingen等人，2008b；Trobajo等人，2009年；Vanelslander等人，2009年；Poulí?ková等人，2010年；Souffreau等人，2013年；Amato等人，2019年；Kollár等人，2019年；Pinseel等人，2019年）。这种多样性不仅体现在隐秘物种复合体内的物种数量上（例如Pinnularia borealis组可能包含数百种；Pinseel等人，2020年），还体现在它们在群落中的相对丰度上（例如在一些附生硅藻群落中占25-90%的个体；Kollár等人，2015年）。解开隐秘物种多样性对于基础研究和应用研究都至关重要，包括生物多样性、进化、生态学和生物监测（Poulí?ková等人，2017年）。例如，只有正确界定参与特定环境条件适应的单元（即物种），才能研究其适应性（以及相应的生物指示潜力）。这些单元通常不是物种复合体，而是具有繁殖和基因隔离的个体物种（例如Kollár等人，2022年）。

Pinnularia是硅藻中最丰富的属之一（Liu等人，2018年）。它包含许多（伪）隐秘物种复合体，如Pinnularia borealis（Pinseel等人，2020年）和Pinnularia gibba（Kollár等人，2019年）组。后者还包括Pinnularia acidicola Van de Vijver & Le Cohu，该物种于2002年在亚南极地区的Ile de la Possession（克罗泽特群岛，南印度洋）被描述为两个变种（指名变种和var. elongata Van de Vijver & Le Cohu），它栖息在酸性土壤、苔藓和湖泊中（Van de Vijver等人，2002年）。自其描述以来，P. acidicola也在其他亚南极岛屿的样本中被记录到，如Heard Island（Van de Vijver等人，2004年）、Prince Edward Islands（Marion和Prince Edward Island；Van de Vijver等人，2008年）、Iles Kerguelen和Ile Amsterdam（Van de Vijver等人，2012年），以及印度洋的Ile de la Réunion（Kollár等人，2019年）和大西洋的Falkland Islands/Islas Malvinas（Jüttner等人，2018年），还有智利的安第斯山脉（Alvial等人，2008年；图1A）。在所有情况下，该分类单元都记录在贫营养、酸性的淡水中（记录的pH值在4.3到6.5之间），电导率范围广泛（在72到681 μS cm?1之间）。此外，var. elongata变种也在美国的大烟山国家公园被报道（Johansen等人，2007年），但由于缺乏已发表的照片和原始材料，这一记录无法验证（Johansen，个人通讯）。图1显示了研究的地理范围。A部分，Pinnularia acidicola物种复合体的成员用红点表示，其最近的亲属P. subcapitata和P. sinistra样株分别用橙点和黄点表示。空的红色圆圈代表没有序列数据的P. acidicola报告。点/圆圈中的数字代表每个物种/种群的单克隆菌株数量。个别观察的参考文献可以在文中找到。在美国发现的P. acidicola var. elongata用问号标出，因为参考文献中没有照片，因此我们无法验证其鉴定。需要注意的是，Ile Amsterdam的H物种在本研究中被重新认定为P. vixconspicua，而鉴定为P. acidicola的种群，尽管它们栖息在岛屿的不同区域，但尚未被培养（补充说明S2）。给出了P. acidicola复合体各物种之间的物理和遗传（基于核编码的28S基因的百分比）距离，以及与最近亲属（由具有可用28S序列的瑞典P. subcapitata种群表示）的距离。B部分显示了P. acidicola复合体物种与其最近亲属之间的遗传（28S）和物理距离关系。

Kollár等人（2019年）采用多相分类方法来界定P. gibba组（包括P. acidicola）内的物种，整合了多种遗传标记、形态学、生态学、生物地理学和繁殖数据。通过这种方法，他们发现P. acidicola不是一个单一物种，而是一个由至少三个在遗传上和可能的地理上隔离的物种级谱系组成的复合体，这些谱系分别位于Marion Island和Ile de la Possession（在Kollár等人，2019年中称为“物种G”）、Ile Amsterdam（“物种H”）和Ile de la Réunion（“物种I”）。仅根据形态学，这三个物种都被鉴定为P. acidicola（参见Kollár等人，2019年）。随后，Kollár等人（2021年）还发现这三个界定物种密切相关，共同拥有约600万至300万年前的共同祖先（Kollár等人，2021年）。此外，他们的补充形态学分析表明，壳瓣长度中被带状结构覆盖的比例存在小差异（带状结构是穿过壳瓣中部的透明区域；Cox，2012年），这表明这些界定物种可能是伪隐秘物种而不是真正的隐秘物种（Kollár等人，2019年）。

在这项研究中，我们在Kollár等人（2019年）关于P. acidicola的早期工作基础上，测试了他们提出的物种假说，并在未被反驳的情况下，通过描述新物种和修订现有物种来正式化这些假说。具体来说，我们（1）用更现代的方法补充了最初的分子物种界定；（2）整合了使用SEM的详细超微结构分析；（3）记录了自然种群中的形态变异；（4）对培养物、自然种群和文献数据应用了常规和几何（基于形状的）形态测量；（5）通过分析已发表的环境DNA（eDNA）数据集来估计地理分布；（6）提出了正式的分类学变更，包括描述一个新物种。

材料与方法：关于P. acidicola物种复合体（即物种G、H和I）的采样和培养的详细信息由Kollár等人（2019年）提供，其来源信息总结如下（另见补充表S1）。总共，物种G由39个菌株代表，物种H由10个菌株代表，物种I由8个菌株代表。虽然Kollár等人（2019年）只分析了其中的一部分菌株（这些菌株完全代表了它们的形态、遗传和地理变异），但本文使用了全部菌株。除了关注P. acidicola外，我们还将这个物种复合体的成员与其最近的亲属进行了比较。在P. gibba组的系统发育研究中（Kollár等人，2021年），最近的亲属是来自智利南部的菌株（Tor4)r。尽管Souffreau等人（2011年）最初仅将其鉴定为属级别，但它在形态上与Pinnularia sinistra Krammer（1992年）最为相似，后者也属于P. gibba组。令人惊讶的是，尽管这种物种被报道为全球分布广泛且数量众多（例如Krammer，2000年），但在公共数据库中只找到了一个DNA序列（即GenBank、GB；Barcode of Life Database，BoLD – Ratnasingham等人（2024年）；以及Diat.barcode v. 12.4 – Rimet等人（2019年）——这三个数据库均可在2025年8月13日访问）。该序列来自质体编码的rbcL基因，属于从英国Wooler Water分离的UK785菌株（补充表S1）。我们使用这个序列进行（系统）遗传比较，以及Souffreau等人（2011年）的菌株（Tor4)r，以及2017年从捷克共和国?astotice附近被淹没采石场的附生生物中分离的未发表的P. sinistra菌株LEV023。不幸的是，这些菌株没有可用的物理化学测量数据。单克隆菌株LEV023被培养在Wright’s Cryptophyte培养基（WC；Guillard & Lorenzen，1972年）中，未调整pH值也未添加维生素，培养条件为12°C和12:12的光照：黑暗周期。此外，我们还包括了P. siberiosinistra B024-1的模式菌株，其序列数据也是可用的（Kulikovskiy等人，2023年）。除了P. sinistra外，还加入了P. gibba组的另一个成员P. subcapitata Gregory（1856年），因其与P. acidicola在分子和形态上的相似性而被纳入比较（Souffreau等人，2011年；Kollár等人，2021年）。这包括来自荷兰的菌株Wie（Souffreau等人，引用2011年），以及从公共序列数据库中检索到的另外7个被鉴定为P. subcapitata的菌株序列：来自德国北部的菌株AT-100.01（Bruder等人，引用2008年），以及6个苏格兰菌株（UK105、UK111、UK122、UK126、UK159和UK212；Diat.barcode 12.4）。此外，我们还使用了来自瑞典P. subcapitata群体的未发表序列，这些序列由7个单克隆菌株代表（SE060 1G2和SE072 1G2来自Svartberget，以及SE099 P26A2、SE157 P26A4、SE159 P26B2、SE270 P26A3和SE271 P26B1来自Stridb?cken；下文为简洁起见仅使用SE部分），这些菌株于2019年在贫营养、酸性溪流中采集（2019年的pH值在4.5到6.2之间）。来自Stridb?cken的5个菌株首先用微量移液器接种到琼脂平板上（使用WC培养基），然后再次用微量移液器接种到WC培养基中（如Gon?alves等人，引用2018年所述）。来自Svartberget的2个菌株直接用微量移液器接种到WC培养基中。关于这些瑞典菌株的采样和培养的详细信息将在Kahlert等人（准备中）的单独文章中提供。总共，本研究收集的数据集包含了76个被鉴定为P. acidicola、P. sinistra或P. subcapitata的单克隆菌株。所研究菌株的地理来源总结在图1中，更多细节见补充表S1。

关于DNA提取、扩增和测序，Kollár等人（引用2019年）提供了P. acidicola复合体分类单元的详细信息。对于捷克菌株LEV023，按照Duff等人（引用2008年）的协议，使用100 μl InstaGene Matrix（Bio-Rad Laboratories, Inc., USA）从50 μl单克隆培养物中提取DNA，并进行了珠磨处理。通过聚合酶链反应（PCR）扩增了质体基因编码的RuBisCO酶大亚基（rbcL）和核基因编码的大亚基核糖体RNA（28S rDNA），反应体系包括1 μl DNA提取物、20 μl EmeraldAmp MAX HS PCR Master Mix（Takara Bio, Inc., Japan，包含DNA聚合酶和核苷酸）、每种引物各1 μl（浓度为5 μM）以及17 μl分子生物学级水（总反应体积为40 μl）。rbcL的引物对为DPrbcL1-F（AAGGAGAAATHAATGTCT）和DPrbcL7-R（AARCAACCTTGTGTAAGTCT；Daugbjerg & Andersen, 引用1997年），反应条件为：初始变性94°C 3分钟，40个循环的变性（94°C, 1分钟）、退火（55°C, 1分钟）和延伸（72°C, 1.5分钟），最后在72°C下延伸5分钟。28S rDNA的引物对为D1R-F（ACCCGCTGAATTTAAGCATA；Scholin等人，引用1994年）和T24U（SCWCTAATCATTCGCTTTACC；Hamsher等人，引用2011年），反应条件为：初始变性95°C 5分钟，35个循环的变性（94°C, 1分钟）、退火（55°C, 1分钟）和延伸（74°C, 1分钟），最后在72°C下延伸10分钟。PCR的成功通过1.5%（w/v）琼脂糖凝胶的凝胶电泳进行检测。PCR产物使用GenElute PCR Clean-Up Kit（Sigma-Aldrich, Inc., USA）按照制造商的协议进行纯化，并在荷兰的Macrogen Europe BV公司使用上述相同的引物以及NDrbcL13-F（CGTTTAGAAGATATGCGTATTC；Daugbjerg & Andersen, 引用1997年）和17-R（TGACCAATTGTACCACC；Jones等人，引用2005年）对rbcL进行测序，使用D2C-R（CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA；Scholin等人，引用1994年）和T16N（AMAAGTACCRYGAGGGAAAG；Hamsher等人，引用2011年）对28S rDNA进行测序。序列在BioEdit v. 5.0.9（Hall, 引用1999年）中组装。

关于瑞典菌株，所有7个菌株的DNA提取物均来自柏林植物园和植物博物馆（BGBM），这些菌株之前由收集者存入（Kahlert等人，准备中）。然后，按照Kollár等人（引用2019年，引用2021年）的方法扩增、纯化并进行了Sanger测序。来自菌株SE060的额外序列，包括rbcL和18S rDNA（编码小亚基核糖体RNA的核基因），是从比利时微生物协调收藏中心（BCCM）获得的，该菌株同样之前已存入（Kahlert等人，准备中）。

（系统）遗传学方面，使用MUSCLE算法（Edgar，引用2004年）在MEGA11（Tamura等人，引用2021年）中进行了多个序列的对齐，并在需要时手动进行了校正。遗传距离（p-距离，差异数量）在MEGA11中成对计算。为了探索新菌株的系统发育位置，将它们的DNA序列纳入了之前用于整个P. gibba群体分子系统发育推断的序列对齐中（Kollár等人，引用2021年），包括28S、18S和rbcL，以及编码光系统A的质体基因（psbA）和编码细胞色素氧化酶亚基1的线粒体基因（cox1）。因此，得到的对齐包含了5个基因、24个代表性菌株和5351个特征（补充表S2）。蛋白质编码的rbcL、psbA和cox1根据最长的开放阅读框（ORF）进行了修剪。核糖体28S和18S rDNA序列被检查是否存在高度可变的环区，并使用GBlocks v. 0.91b（Castresana，引用2000年）自动移除了潜在的非同源位点。

分子系统发育推断方面，使用IQ-TREE v2.3.6（Minh等人，引用2020年）通过最大似然（ML）和MrBayes v. 3.2.6（Ronquist等人，引用2012年）通过贝叶斯推断（BI）对核28S和18S、质体rbcL和psbA以及线粒体cox1的连接对齐进行了分区分析。替换模型根据IQ-TREE中计算的贝叶斯信息准则（BIC）定义。对于ML，28S的模型为TIM3 + F + I + G4，18S的模型为HKY + F + I，rbcL的模型为K3Pu + F + I + G4，psbA的模型为TPM2u + F + I，cox1的模型为GTR + F + I + G4。对于BI，28S和cox1的模型为GTR + G + I，18S和rbcL的模型为HKY + G + I，psbA的模型为HKY + G。在ML的情况下，通过1000代的超快自举近似计算分支的统计支持。在BI的情况下，进行了两次独立的马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）分析，每次分析运行1,000,000代。每次MCMC分析运行一个冷链和三个热链。每100代采样一次树，丢弃前25%的数据作为燃烧期。运行的收敛性在Tracer v1.7.1（Rambaut等人，引用2018年）中进行了检查。

Kollár等人（引用2019年）对P. gibba群体进行了广泛的分子物种界定。他们的研究基于两个快速进化的遗传标记（28S rDNA和cox1），并应用了三种自动化的分子物种界定方法：统计简约网络分析（SPNA；也称为Templeton–Crandal–Sing方法，TCS；Clement等人，引用2000年）、广义混合Yule-coalescent（GMYC；Pons等人，引用2006年）和Poisson树过程（PTP；Zhang等人，引用2013年）。我们在这里使用更新的方法——基于遗传距离的Assemble Species by Automatic Partitioning（ASAP；Puillandre等人，引用2021年）在原始的2019年数据集上验证了这些结果，但现在还包括了来自瑞典的新分离的P. subcapitata和来自捷克的P. sinistra菌株。分析是通过ASAP的网页界面（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap；最后更新于2023年5月22日）在默认设置下进行的。

在形态学方面，单克隆菌株和自然样本用30% H2O2处理过夜，然后按照Van der Werff（引用1955年）的方法固定在Naphrax?合成树脂中。使用配备Olympus DP27相机和浸入式物镜的Olympus BX43光学显微镜（最终放大倍数为400×和1000×）进行形态学观察。为了更详细地观察壳瓣结构，将氧化后的壳片通过10 μm IsoporeTM聚碳酸酯膜过滤（Merck Millipore?），固定在铝制支架上，并使用BAL-TEC MED 020模块化高真空涂层系统在100 mA下涂覆30 nm厚的铂层，持续30秒，然后用JEOL IT800扫描电子显微镜（SEM）进行观察。使用ImageJ v 1.48（Abràmoff等人，引用2004年）进行测量，以及照片的统一（旋转、裁剪和重新缩放）以进行几何形态测量。在壳瓣中，测量了壳瓣条纹从发散变为汇聚的区域，即条纹方向大致平行时的条纹密度。分类学参考文献包括Round等人（引用1990年）、Krammer（引用1992年，引用2000年）、Rumrich等人（引用2000年）和Van de Vijver等人（引用2002年）。描述硅质细胞壁各种结构的术语基于Cox & Ross（引用1981年；条纹结构）、Round等人（引用1990年；缝合结构）和Krammer（引用1992年，引用2000年；Pinnularia的属特征）。此外，我们使用Mann & Evans（引用2008年）中的隐秘、伪隐秘和半隐秘术语，并采用基于谱系的概率物种观点（Kollár等人，引用2022年）。需要注意的是，一个物种的“隐秘”状态不是内在的生物学属性，而是观察者和方法依赖的形态学（不）可区分性的诊断（对于半隐秘分类单元，来源信息是该诊断背景的一部分）。另外，我们在上文和下文使用括号中的“（系统）遗传学”以避免将系统发育推断与基于相似性的遗传分析混淆。

为了测试个别形态测量特征（壳瓣长度、壳瓣宽度、长度与宽度比、条纹密度、带状结构长度和相对带状结构覆盖率）的差异，共测量了155个样本（其中118个属于P. acidicola物种复合体，37个属于其最近的亲属），这些样本来自培养物（每个菌株一个代表性样本）、自然样本和文献。然后我们评估了参数分析的假设。使用Shapiro–Wilk检验（Shapiro & Wilk，引用1965年）测试了每个物种内数据的正态性，并使用Levene检验（Levene，引用1960年）评估了方差的同质性。如果满足这两个假设，我们应用了单因素方差分析（ANOVA；Fisher，引用1925年），随后使用Tukey的Honest Significant Difference（HSD；Tukey，引用1949年）进行事后成对比较。如果正态性或同质性假设不成立，我们使用了非参数的Kruskal–Wallis秩和检验（Kruskal & Wallis，引用1952年），然后使用Dunn的检验并进行Bonferroni校正（Dunn，引用1964年）进行多重比较。这些检验是在R版本4.4.2（R Core Team，引用2022年）中使用的，使用了car v. 3.1.3、FSA v. 0.9.6和ggpubr v. 0.6.0包，并使用ggplot2 v. 3.5.1包进行可视化。注意，ggplot2中的geom_jitter()函数引入了轻微的垂直“抖动”以最小化重叠点，这就是为什么即使是离散变量如条纹密度在箱形图上也显示为连续的原因。此外，使用scatterplot矩阵和Pearson相关性（Pearson，引用1896年）通过GGally v. 2.2.1 R包生成了形态测量变量之间的成对关系。

为了评估P. acidicola复合体三个物种之间的整体多变量差异，我们进行了主成分分析（PCA）和排列多变量分析（PERMANOVA；Anderson，引用2001年）。在这些分析之前，所有变量都进行了标准化（均值中心化和缩放到单位方差）。PCA使用R中的prcomp()函数进行，结果使用ggfortify v. 0.4.17包中的autoplot()函数进行可视化。PERMANOVA使用vegan v. 2.6.10包中的adonis2()函数在标准化数据上进行（方法=‘euclidean’，9999次排列）。为了验证组内多变量分散的假设，我们使用betadisper()和permutest()（9999次排列）进行了分散同质性检验。然后选择了前四个PC轴，它们共同解释了99.6%的总方差，作为线性判别分析（LDA）的输入，以减少维度并保留几乎所有信息。LDA使用MASS 7.3.61 R包中的lda()函数进行，以物种作为分组因素。使用ggplot2和95%置信椭圆估计每个物种的线性判别得分，以可视化两组之间的分离。所有统计分析都在R版本4.4.2（R Core Team，引用2022年）中进行。

为了分析中央区域和壳瓣轮廓的形状，我们对来自克隆培养物（每个菌株一个代表性个体）、自然样本的127个样本应用了基于标志点的几何形态测量技术（Krammer，引用2000年；Van de Vijver等人，引用2002年，引用2012年）。必要时，我们校正了放大倍数并旋转了壳瓣，以确保所有图像中的中央缝合线末端指向同一侧。对于大多数几何形态测量分析，使用了TPS-series软件（Rohlf，引用2015年），并使用TpsUtil v. 1.83对图像进行了数字化。为了注册形状，在每个细胞上放置了总共68个标志点，使用TpsDig v. 2.31。八个地标代表了同源部分（两个位于细胞轮廓与顶端轴的交点处，两个位于中央缝合线末端，四个位于中央区域最长条纹的末端），以及60个沿瓣膜轮廓等距离分布的滑动地标（每侧30个；图8）。为了减少测量误差，每个瓣膜被数字化了两次，一次顺时针（CW），一次逆时针（CCW）。然后将CCW地标重新标记以匹配CW顺序，并对相应地标的坐标进行平均处理以用于进一步分析。由于沿顶端轴的侧面无法像顶端轴那样可靠地区分，因此根据Klingenberg等人（Citation2002）的方法，通过对沿顶端轴的侧面进行对称处理来消除不对称性。使用R包geomorph v.4.0.10（Adams & Otárola-Castillo, Citation2013）中的广义Procrustes分析方法将结果配置叠加在一起。Procrustes叠加消除了位置、方向和比例的差异，仅保留了形状变化（Zelditch等人，Citation2004）。分析配置确保同源地标保持固定位置，同时允许滑动地标沿着连接它们与最近邻居的轨迹移动。然后利用得到的部分变形分数来表示个体的形状，并将其用于排序方法。使用PCA分析了各组之间的形状差异，前12个轴的PC分数解释了99.9%的变异性，并进一步使用LDA进行排序。使用TpsSplin v.1.25和TpsRegr v.1.45中的薄板样条变形网格可视化了样本组之间的形状变化以及沿PC和LD轴的变化。

基于eDNA的地理范围估计
为了测试Pinnularia acidicola复合体中的三个界定物种是否出现在其已知范围之外，我们在Pérez-Burillo等人（Citation2025；补充表S3）汇编的12个已发表的硅藻宏条形码数据集中搜索匹配的rbcL条形码。由于这些已发表的数据集通常以多重或解复用的序列读取形式提供，因此我们使用QIIME2 v.2024.10（Bolyen等人，Citation2019）进行了处理。根据Vasselon等人（Citation2017）的rbcL引物，使用cutadapt插件（Martin，Citation2011）对读取数据进行解复用和修剪，通常得到263个碱基对（bp）的片段，不包括引物。使用DADA2流程（Callahan等人，Citation2016）进行去噪和扩增子序列变异（ASVs）推断，截断参数基于序列长度和质量（在Phred质量分数中位数低于25的位置截断，从而确保碱基调用准确率≥99.7%）。从P. acidicola物种复合体的模式株和代表性菌株中提取了特定于物种的rbcL参考条形码作为查询序列。使用BLASTn v.2.16.0+的命令行实现（Camacho等人，Citation2009）对从已发表数据集中推断出的ASVs进行了相似性搜索，最小身份阈值为99%。仔细检查了所有匹配的ASVs，并将其与样本元数据关联起来，以评估其地理分布和生态学特征（如果有的话）。

数据和材料的可用性
在物种层面总结了可用的地理、形态测量、序列（包括GenBank的访问号码）及相关环境数据（补充表S1），而特定菌株的信息，包括照片和地理坐标，可在BoLD上找到（DOI: https://dx.doi.org/10.5883/DS-PACI）。本研究中使用的DNA比对数据可以在补充材料（补充数据S1）中找到。所研究的P. acidicola复合体菌株的DNA提取物和凭证玻片由比利时根特大学的Protistology and Aquatic Ecology研究小组（PAE）保存，作为比利时协调微生物收藏（BCCM）的一部分。瑞典P. subcapitata种群的DNA样本和基础凭证标本存放在德国柏林植物园和植物博物馆（BGBM），并通过全球基因组生物多样性网络（GGBN；Droege等人，Citation2014）和全球生物多样性信息设施（GBIF）获取。此外，SE060 1G2的一个复制品保存在BCCM中，编号为DCG 1045。LEV023菌株的DNA提取物和永久玻片由捷克查尔斯大学生态学系的Diatoms in Cryospheric Ecosystems实验室（DiCE lab）保存。新描述的物种的模式标本保存在比利时梅斯植物园（BR）和查尔斯大学标本馆（PRC，捷克）中（见结果部分）。

为了分类目的，我们使用整个显微镜玻片作为命名类型（正模标本、等模标本、上模标本或同模标本，视情况而定），所有这些标本均来自单克隆菌株，遵循国际藻类、真菌和植物命名法规第8.2条（Turland等人，Citation2025）的通常解释。所有新物种均根据第42.4条（Turland等人，Citation2025）主动注册。

结果（系统）遗传学
为了评估Pinnularia acidicola物种复合体内的物种界限，并明确其与密切相关的分类单元的关系，我们分析了三种常用的分子标记的遗传变异：质体编码的rbcL、核编码的18S rDNA以及核编码的28S rDNA中变化较大的D1/D2区域。对复合体中的三个物种（即G、H和I，分别对应于P. acidicola Van de Vijver & Le Cohu、P. vixconspicua Chattová、Metzeltin & Van de Vijver和P. acidireunionensis Kollár, T. J. Kohler, Kopalová & Van de Vijver sp. nov.）进行序列比较，发现rbcL的种间差异一致，范围在0.4%到0.7%之间（1365 bp中的5–10 bp），18S的种间差异为0.4%（1562 bp中的6–7 bp）。在进化更快的28S标记中，序列差异更大，为1.7%–3.5%（538 bp中的9–19 bp），而其种内变异保持较低，不超过0.6%（图2A）。图2显示了Pinnularia acidicola物种复合体中的三个物种的遗传变异，即P. acidicola（G，来自Ile de la Possession和Marion Island的39个菌株）、P. vixconspicua（H，来自Ile Amsterdam的10个菌株）和P. acidireunionensis（I，来自Réunion的8个菌株），以及它们的最近亲缘物种P. subcapitata（SE，7个菌株）。A部分比较了三个遗传标记（1365 bp的rbcL、1562 bp的18S和538 bp的28S）的种间和种内变异。给出的种间变异百分比代表菌株对之间的最小观察值，而种内变异则表示最大观察比例。B和C部分显示了根据ASAP分析，四个物种的28S rDNA序列中种间和种内变异之间的条形码间隙（虚线红色）。在B部分，种间变异的峰值标有所属的物种对。

为了评估P. acidicola物种复合体内三个界定物种的独特性，并将其置于更广泛的P. gibba组中，我们将它们与一组代表已知最近亲缘物种的菌株进行了比较：P. subcapitata或P. sinistra。虽然公共序列数据库中只包含有限数量的相关标记（通常只有rbcL），但我们使用来自捷克P. sinistra种群（LEV023）和瑞典P. subcapitata种群（七个菌株，SE060–SE271）的新建立的单克隆菌株扩展了数据集。瑞典P. subcapitata菌株在rbcL上的差异为0.6%–0.8%（8–11 bp），在18S上的差异为0.8%–1.1%（12–17 bp）。在28S的D1/D2区域，差异更为明显，与物种G、H和I的差异为5.4%–6.7%（29–36 bp），远超复合体内的种内和种间变异。这些结果通过基于28S的ASAP物种界定分析得到了验证，该分析一致地恢复了三个不同的P. acidicola谱系（物种G、H和I），并将P. subcapitata作为一个单独的簇（图2B、C）。同样的方法也适用于P. sinistra的代表菌株（来自捷克共和国的LEV023和来自智利的Tor4r），它们也被确定为单独的物种（补充图S1）。

为了提供系统发育背景，我们将这些序列整合到之前发表的28S、18S、rbcL、psbA和cox1标记的串联比对中（Kollár等人，Citation2021），并再次进行了分析。结果树显示P. acidicola物种复合体是单系的，P. subcapitata和类似P. sinistra的谱系形成了连续的姐妹群（图3，完整树见补充图S2）。在P. subcapitata内部观察到了三个分支，这表明该分类单元是多系的，不代表单一物种实体。包含瑞典P. subcapitata的分支作为P. acidicola群的姐妹群（图3中的P. subcapitata 1分支）。图3显示了使用最大似然法在分区模型下从28S、18S、rbcL、psbA和cox1的串联比对中推断出的根系系统发育树。仅显示了包含感兴趣物种（即Pinnularia acidicola物种复合体及其最近亲缘物种）的终端分支，而完整的系统发育树见图S2。对于P. acidicola复合体的成员（红色），每个物种只包含一个代表性菌株。对于最近的亲缘物种P. subcapitata（橙色）和P. sinistra（黄色），具有相同序列的菌株被合并，原始菌株编号在括号内标明。节点值表示统计支持，以百分比表示：BI后验概率/ML超快自助法近似值。在BI系统发育树中因多分支而缺失的分支上出现了缺失值（用虚线表示）。分支标签显示：物种代码=分类单元–代表性菌株–地理来源（如果有多个菌株）。树按比例绘制，分支长度以每个位置的替换次数表示。

这些结果共同强化了P. acidicola复合体内物种G、H和I的独特性，并提供了一个明确的系统发育框架，使其能够与其最近的现存亲缘物种进行有意义的比较。鉴于这些分类单元在公共数据库中的序列数据历史匮乏，纳入新建立的P. subcapitata和P. sinistra的菌株对于这一解释至关重要。

形态学
显微镜观察
Pinnularia acidicola物种复合体的三个物种（严格意义上的P. acidicola，G；P. vixconspicua，H；以及P. acidireunionensis，I）具有相同的定性LM特征（瓣膜轮廓、顶端形状、轴向区域和存在带状结构；图4）。所有物种都具有线性到线性披针形的瓣膜，（略微）延长的、圆润的、有时或多或少呈亚帽状的顶端，相对狭窄的轴向区域，并具有带状结构，即贯穿瓣膜顶部的中央透明区域。然而，这三个物种可能在瓣膜轮廓上有所不同，尤其是在较大标本中瓣膜边缘的差异更为明显。在命名物种（G）中，瓣膜边缘略微凸起，在P. acidireunionensis（I）中略微凹陷，而P. vixconspicua（H）的边缘处于弱凸起到平行边缘的中间状态（比较图4 G1、H1和I1，另见补充图S7A–C）。此外，定量形态测量分析揭示了多个显著的种间差异，支持这三个物种的界定（见下文）。在扫描电子显微镜（SEM）下，未观察到任何物种特异性的结构差异（图4）。更多细节见下文（见物种描述）。图4显示了Pinnularia acidicola复合体的三个物种，即P. acidicola Le Cohu & Van de Vijver（G）、P. vixconspicua Chattová, Metzeltin & Van de Vijver（H）和P. acidireunionensis（I）。顶部行（G1–I2）展示了SEM下的外部（1s）和内部（2s）视图，底部部分（G3–I12）按比例展示了LM下的三个物种。星号表示来自培养物的个体：（G1,2,6）MIC13-21，（G3）MIC3-10，（G4）CRO12-24-10，（G8）MIC5-16，（H1,2,5）W095b，（H3）W076e，（H6）W118b，（H10）W067c，（H12）W076d，（I1,2,12）REU-12-9-14，（I5）REU12-26-12。其余的在相应的环境样本中拍摄。上模标本CRO12-24-10（P. acidicola Van de Vijver & Le Cohu）和W095b（P. vixconspicua Chattová, Metzeltin & Van de Vijver）以及正模标本REU12-9-14（P. acidireunionensis Kollár, T. J. Kohler, Kopalová & Van de Vijver sp. nov.）用感叹号标出。CRO12-24-10的SEM图像见补充图S8。图例说明：图4 G1–I2的刻度尺为1微米；图4 G3–I12的刻度尺为10微米。可查看全尺寸图像。

**传统的形态测量分析**
所有三个物种的壳长范围为12–59微米（样本总数n=118），其中P. acidireunionensis的中位数最小（26.2 ± 2.9微米；样本数n=28），而P. acidicola sensu stricto（s.s.）和P. vixconspicua的壳长较大（分别为32.5 ± 10.1微米和40.2 ± 7.5微米；样本数分别为36和54）。这些差异在统计学上具有显著性（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 43.5，p < 0.001），P. acidireunionensis与P. vixconspicua之间（Dunn检验，p < 0.001），以及P. acidireunionensis与P. acidicola s.s.之间也存在显著差异（p < 0.001；见图5A）。同样，壳宽也具有鉴别价值，P. acidireunionensis的壳宽明显小于P. acidicola s.s.和P. vixconspicua（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 54.816，p < 0.001；Dunn检验，I与G以及I与H之间的差异均显著）。然而，由于中位数差异仅为1微米（P. acidireunionensis为5.0 ± 0.4微米，而其他两个物种为6.0 ± 0.5微米），这一特征的实际应用价值有限（见图5B）。此外，由于P. acidireunionensis的壳形较窄，其壳长也相对较长，这种差异具有显著性（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 25.184，p < 0.001；通过Dunn检验与P. vixconspicua相比，p < 0.001；与P. acidicola s.s.相比，p = 0.044；见图5C，补充表S1）。

**图5. Pinnularia acidicola物种复合体的传统单变量形态测量数据，包括P. acidicola s.s.（G）、P. vixconspicua（H）和P. acidireunionensis（I）**。共检查了118个样本（G、H和I分别为36、54和28个），这些样本来自不同培养物、自然样本以及文献中的照片。测量指标包括壳长（A）、壳宽（B）、长宽比（C）、条纹密度（D）、带状结构长度（E）和相对带状结构覆盖度（F）。显著差异用星号标示（Kruskal–Wallis检验；*p < 0.05，** < 0.01，*** < 0.001）。与P. subcapitata和P. sinistra的最近亲缘关系的比较见补充图S3，单变量密度图见补充图S4。

**条纹密度**（以每10微米壳长上的条纹数量计算）也显示出鉴别价值。Pinnularia acidicola s.s.的条纹密度显著低于P. vixconspicua和P. acidireunionensis（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 46.769，p < 0.001；Dunn检验，G与H以及G与I之间的差异均显著；见图5D）。同样，带状结构长度在P. acidicola s.s.与其他两个物种之间也存在显著差异（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 28.128，p < 0.001；Dunn检验，G与H之间的差异显著，G与I之间的差异为p = 0.004），前者具有稍长的透明中央区域（见图5E）。相对带状结构覆盖度（带状结构长度占壳长的比例）在不同物种间也有所差异，P. vixconspicua的带状结构相对较短（Kruskal–Wallis检验，χ2 = 51.294，p < 0.001；Dunn检验，p < 0.001），与P. acidireunionensis相比也是如此（Dunn检验，p < 0.001；见图5F）。P. acidicola物种复合体与其最近亲缘关系P. subcapitata和P. sinistra的单变量比较以及双变量散点图详见补充材料S4。

为了探索整体形态变异并评估是否可以在多变量形态空间中区分P. acidicola复合体的三个物种，我们进行了主成分分析（PCA）后接PERMANOVA（见图6A）。前两个主成分解释了总方差的78.9%（PC1 = 43.9%，PC2 = 35.0%）。PC1主要反映了壳的整体尺寸（长度、宽度及其比例），而PC2则受到条纹密度和带状结构指标的强烈影响。这些物种在PCA空间中形成了部分重叠的簇，这与它们的伪隐秘状态一致。尽管存在重叠，PERMANOVA仍揭示了三个物种之间的显著多变量形态差异（F = 27.54，R2 = 0.324，p < 0.001），表明物种身份解释了大约32%的形态变异。多变量分散的同质性检验显示三个物种之间的分散可能存在差异（F = 4.05，p = 0.0173），这增加了解释的复杂性。使用解释99.6%方差的前四个主成分轴作为输入，线性判别分析（LDA）同样显示了三个物种在LD空间中的部分分离（见图6B），尽管仍存在一定程度的重叠。

**几何形态测量分析**
与图6的结果相反，基于标志点的几何形态测量数据的PCA显示P. acidicola物种复合体三个物种之间存在显著重叠，前两个主成分解释了97%的形状变异（见补充图S6）。此外，PERMANOVA未发现物种间的显著差异（F = 1.01，R2 = 0.026，p = 0.277），表明壳的轮廓和中央区域的形状在该物种复合体内的区分能力有限。然而，当将最近亲缘物种纳入分析时，三个形态物种之间的差异变得显著（PERMANOVA，F = 32.69，R2 = 0.345，p < 0.001；分散同质性检验，F = 0.40，p = 0.673），表明壳的形状和中央区域的形状有助于区分P. acidicola物种复合体的成员与其最近亲缘物种（见图7）。这些差异主要由位于第一条条纹末端的同源标志点驱动，这些标志点界定了壳的带状结构（见图8），这与基于传统单变量形态测量的结果一致（见补充图S3E，F）。

**综合分析**
综上所述，尽管P. acidicola复合体的三个物种在形态上相似且在某些特征上存在部分重叠，但仍然可以通过壳的比例、条纹密度和带状结构覆盖度的组合可靠地区分它们。另一方面，壳的形状在该复合体内部缺乏区分能力，但在区分其与P. subcapitata和P. sinistra的最近亲缘物种时仍有一定作用。这些差异进一步强调了通过分子系统发育和地理结构确定的每个物种的独特性。

**生物地理学与生态学**
根据现有样本，P. acidicola复合体的三个物种似乎具有异域分布。2011年和2012年的考察在Marion岛和Crozet群岛共分离出了150多个硅藻菌株，其中约60个属于Pinnularia属，其中39个被归类为P. acidicola物种复合体，且仅属于G谱系（P. acidicola s.s.）。2007年在Ile Amsterdam的考察中分离出了120个菌株，其中包括33个Pinnularia属菌株，其中10个属于H谱系（P. vixconspicua）。2012年在Réunion岛还分离出了33个Pinnularia属菌株，其中8个属于I谱系（P. acidireunionensis）。如此大量的培养工作支持了这三个物种在地理分布上基本不重叠的结论，至少在所研究的岛屿上是如此。

我们进一步筛选了12个已发表的rbcL宏条形码数据集，这些数据集涵盖了北半球（如加利福尼亚、俄亥俄、加拿大、不列颠、芬诺斯堪的亚、法国、西班牙、西藏）和南半球（如马约特）的地点（见补充表S3），总共有超过1.4亿条eDNA读段，涉及河流、湖泊和废水样本。没有一个ASV与P. acidicola复合体的三个物种的条形码完全匹配，只有5个ASV的序列相似度达到或超过99%（即Vasselon等人2017年研究的263 bp rbcL条形码中有1或2个碱基对的不同）。这些ASV的详细信息见补充表S4。其中三个ASV在1个碱基对上存在差异：一个分布于整个欧洲（ASV1），一个分布于美国和西欧（ASV2），另一个分布于马约特岛（ASV3）。

ASV1出现在来自西班牙（Nistal-García等人，2021年）、法国（Rimet等人，2018年；Tardy等人，2021年）、英国（Kelly等人，2020年）和芬兰（Bailet等人，2020年）的数据集中，这些样本来自河流、湖泊、池塘和废水。它与P. acidicola s.s.（G）和P. vixconspicua（H）在1个碱基对上不同（见补充表S4），而与P. acidireunionensis（I）在4个碱基对上不同。另一方面，该ASV与捷克系的P. sinistra（LEV023）和模式标本P. siberiosinistra（B024-1）相同，但与英国系的P. sinistra（UK785）在1个碱基对上不同。鉴于P. acidicola s.s.和P. vixconspicua也与捷克和西伯利亚的菌株在1个碱基对上不同，因此ASV1可能属于P. sinistra类群。由于其广泛的分布和栖息地范围，它似乎是一个相当普遍的类群，尽管在硅藻群落中并不占主导地位（平均相对丰度为每个处理样本的0.2 ± 0.1%；见补充表S4）。

ASV2出现在两个美国数据集中，分别来自俄亥俄州的河流（Smucker等人，2020年）和加利福尼亚州（未发表；见补充表S3）、英国的河流（Kelly等人，2020年）、法国的河流（Rivera等人，2020年）以及废水样本（Tardy等人，2021年）。ASV2与P. vixconspicua在1个碱基对上不同，而与P. acidicola s.s.和P. acidireunionensis分别在3个和2个碱基对上不同。此外，当从原始读段数据中检索到该ASV的引物区域并纳入比较时（总共312个碱基对），与P. vixconspicua的差异从1个碱基对增加到5个碱基对。同样，它与捷克和西伯利亚的P. sinistra类群在2个碱基对上不同。像ASV1一样，这个变体在来源样本中并不占主导地位（丰度为0.13 ± 0.04%；见补充表S4）。

**补充分析**
**图8. 基于标志点的几何形态测量数据，显示了Pinnularia acidicola复合体（A）、P. subcapitata（B）和P. sinistra（C）的壳形差异**。左侧的变形网格显示了平均壳形，右侧的面板展示了与整个数据集平均形状相比的个体标志点位移向量（D）。同源标志点用红色标出。注意，三个分类单元中界定带状结构的四个同源标志点的向量方向不同（见图A–C）。

综上所述，这些结果表明，尽管P. acidicola复合体的三个物种在形态上相似且在某些特征上存在部分重叠，但仍可以通过壳的比例、条纹密度和带状结构覆盖度的组合可靠地区分它们。另一方面，壳的形状在该复合体内部缺乏区分能力，但在区分其成员与P. subcapitata和P. sinistra的最近亲缘物种时仍然有用。这些差异进一步强调了通过分子系统发育和地理结构确定的每个物种的独特性。

**生物地理学与生态学**
根据现有样本，P. acidicola复合体的三个物种似乎具有异域分布。2011年和2012年的考察在Marion岛和Crozet群岛共分离出了150多个硅藻菌株，其中约60个属于Pinnularia属，其中39个被归类为P. acidicola物种复合体，且仅属于G谱系（P. acidicola s.s.）。同样，在2007年的Ile Amsterdam考察中分离出了120个菌株，其中包括33个Pinnularia属菌株，其中10个属于H谱系（P. vixconspicua）。2012年在Réunion岛还分离出了33个Pinnularia属菌株，其中8个属于I谱系（P. acidireunionensis）。这些大量的培养工作支持了这三个物种在地理分布上基本不重叠的结论，至少在所研究的岛屿上是如此。

我们进一步分析了12个已发表的rbcL宏条形码数据集，这些数据集涵盖了北半球（如加利福尼亚、俄亥俄、加拿大、英国、芬诺斯堪的亚、法国、西班牙、西藏）和南半球（如马约特）的地点（见补充表S3），总共有超过1.4亿条eDNA读段，涉及河流、湖泊和废水样本。没有一个ASV与P. acidicola复合体的三个物种的条形码完全匹配，只有5个ASV的序列相似度达到或超过99%（即Vasselon等人2017年研究的263 bp rbcL条形码中有1或2个碱基对的不同）。这些ASV的详细信息见补充表S4。其中三个ASV在1个碱基对上存在差异：一个在整个欧洲都有发现（ASV1），一个在美国和西欧有发现（ASV2），另一个在马约特岛有发现（ASV3）。

ASV1出现在来自西班牙（Nistal-García等人，2021年）、法国（Rimet等人，2018年；Tardy等人，2021年）、英国（Kelly等人，2020年）和芬兰（Bailet等人，2020年）的数据集中，这些样本来自河流、湖泊、池塘和废水。它与P. acidicola s.s.（G）和P. vixconspicua（H）在1个碱基对上不同（见补充表S4），而与P. acidireunionensis（I）在4个碱基对上不同。另一方面，该ASV与捷克系的P. sinistra（LEV023）和模式标本P. siberiosinistra（B024-1）相同，但与英国系的P. sinistra（UK785）在1个碱基对上不同。鉴于P. acidicola s.s.和P. vixconspicua也与捷克和西伯利亚的菌株在1个碱基对上不同，因此ASV1可能属于P. sinistra类群。由于其广泛的分布和栖息地范围，它似乎是一个相当普遍的类群，尽管在硅藻群落中并不占主导地位（平均相对丰度为每个处理样本的0.2 ± 0.1%；见补充表S4）。

ASV2出现在两个美国数据集中，分别来自俄亥俄州的河流（Smucker等人，2020年）和加利福尼亚州（未发表；见补充表S3）、英国的河流（Kelly等人，2020年）、法国的河流（Rivera等人，2020年）以及废水样本（Tardy等人，2021年）。ASV2与P. vixconspicua在1个碱基对上不同，而与P. acidicola s.s.和P. acidireunionensis分别在3个和2个碱基对上不同。此外，当从原始读段数据中检索到该ASV的引物区域并纳入比较时（总共312个碱基对），与P. vixconspicua的差异从1个碱基对增加到5个碱基对，每个引物区域都有2个碱基对的不同（三个P. acidicola复合体物种的引物区域相同）。同样，它与捷克和西伯利亚的P. sinistra类群在2个碱基对上不同。像ASV1一样，这个变体在来源样本中也不占主导地位（丰度为0.13 ± 0.04%；见补充表S4）。

在所研究的ASV中，ASV3可能与P. acidicola复合体的某个物种具有最高的同种可能性。它出现在马约特岛（Vasselon等人，2017年），该岛距离Réunion岛约1450公里，与P. acidireunionensis在1个碱基对上不同（与P. acidicola s.s.和P. vixconspicua分别在6个和4个碱基对上不同）。然而，包括引物区域后，差异增加到3个碱基对。该ASV在马约特岛的两条溪流（Chajou和Longoni）中的相对丰度分别为0.19%和0.05%（见补充表S4）。遗憾的是，原始研究中没有提供这些地点的额外环境数据，限制了对其生态学的进一步解释。关于P. acidicola复合体三个物种的栖息地偏好，更多详细信息见下方的物种描述。

**物种描述：**
Pinnularia acidicola这一名称及其两个变种（P. acidicola var. acidicola和P. acidicola var. elongata）最初与栖息在Ile de la Possession的典型种群相关联（Van de Vijver等人，参考文献2002），后来在Marion Island上也得到了确认（作为物种“G”在Kollár等人，参考文献2019、2021中）。由于该物种最初描述时缺乏遗传数据，我们在此指定来自Ile de la Possession的典型种群的表型菌株为正模标本，包括rbcL和18S条形码以及其他序列数据。物种“H”最初被鉴定为P. cf. acidicola，或者根据观察到的最大标本（图4H3），被鉴定为P. acidicola var. elongata（Kollár等人，参考文献2019、2021）。然而，在这项研究中，基于采样地点、生态特征和形态学特征，它被认定为P. vixconspicua Chattová, Metzeltin & Van de Vijver（Van de Vijver等人，参考文献2012）（更多细节见补充说明S2）。剩余的物种“I”目前仅在Ile de la Réunion发现，并被鉴定为P. cf. acidicola（Kollár等人，参考文献2019、2021），现在被确认为科学上未知的新物种，命名为P. acidireunionensis Kollár, T. Kohler, Kopalová & Van de Vijver sp. nov.。为了通过DNA条形码进行物种鉴定（Hebert等人，参考文献2003），P. acidicola复合体的三个物种似乎可以通过标准的硅藻条形码明确区分：rbcL区域（由Vasselon等人定义的263 bp长区域内至少有1 bp的差异）和18S区域（由Zimmermann等人定义的397 bp长区域内至少有2 bp的差异）。请注意，我们没有重复使用Van de Vijver等人（参考文献2002）和Van de Vijver等人（参考文献2012）已经发表的P. acidicola s.s.和P. vixconspicua的照片，因此图4并不旨在展示这些已知物种的所有变异。对于新物种P. acidireunionensis，我们在补充图S9中展示了所有已知的壳片，在图4中选择了一些代表样本。

**分类学信息：**
门：Bacillariophyceae Haeckel 1878
目：Naviculales Bessey 1907
科：Pinnulariaceae D.G. Mann 1990
属：Pinnularia Ehrenberg 1843
**Pinnularia acidicola** Van de Vijver & Le Cohu 2002

**正模标本（在Van de Vijver等人（参考文献2002）中指定）：** CAS-220096（美国加州科学院）。
**表型标本：** 由于P. acidicola最初描述时没有序列数据，我们在此指定上述正模标本的表型标本为BR-4931玻片，该玻片保存在比利时Meise植物园。它包含单克隆菌株CRO12-24-10（类型标本如图4 G4所示，SEM图像见S8），该菌株由Bart Van de Vijver于2012年在Ile de la Possession采集的自然样本CRO12-24中分离得到。已知的序列信息包括18S序列1129 bp（GB登录号PX837018）、28S序列921 bp（MH670432）、psbA序列762 bp（PX849512）、rbcL序列1386 bp（PX849513）和cox1序列615 bp（PX849514）。
**国际表型标本：** PRC290016玻片，保存在捷克共和国查理大学植物标本馆，包含菌株CRO12-24-10。
**条形码信息：** http://phycobank.org/106524

**形态学特征：** 根据培养样本和自然样本（n = 36）的数据，观察到的特征与原始描述相比有所扩展：壳片长度通常为（12）21–58 μm（而非24–56 μm），壳片宽度为5–8 μm（而非4.5–7 μm），壳片长度与宽度的比例通常为（1.8）3.5–5.5（而非9.4），条纹密度为每10 μm有10–14条条纹（而非11–12条），以及壳片长度的相对条纹覆盖率为6–20%（见补充表S1）。

**生态与分布：** 除了Ile de la Possession（Crozet群岛）的典型产地外，P. acidicola还栖息在Marion Island、Prince Edward Island（Van de Vijver等人，参考文献2008）、Heard Island（Van de Vijver等人，参考文献2004）、Kerguelen群岛（Van de Vijver等人，参考文献2012）和Falkland Islands/Islas Malvinas（Jüttner等人，参考文献2018）。在Ile Amsterdam记录的P. acidicola种群尚未进行培养和测序，但它明显不同于Ile Amsterdam的物种H，后者被认定为P. vixconspicua（见下文和补充说明S2）。关于P. acidicola在其他地区的报道，如智利安第斯山脉（Alvial等人，参考文献2008）和美国大烟山（Johansen等人，参考文献2007），由于缺乏序列数据和已发表的照片，目前无法验证。从生态学角度来看，P. acidicola s.s.主要栖息在“酸性土壤、导电率较低的池塘和湖泊中（< 90 μS cm?1）”（Van de Vijver等人，参考文献2002）。然而，值得注意的是，对低导电率、微酸性的淡水环境的偏好在Pinnularia属中是普遍存在的特征（例如Krammer，参考文献2000）。

**DNA条形码：** Marion Island（由菌株MIC5-16代表）和Ile de la Possession（菌株PinnC7代表；两岛相距约1000公里）的种群似乎具有相同的rbcL条形码（由Vasselon等人定义的引物确定，差异为2–5 bp），这在P. acidicola复合体及其近亲（如P. subcapitata相差3–7 bp，P. sinistra-like谱系相差1–4 bp）中是独特的。同样，这两个岛的种群在18S条形码上也相同（由Zimmermann等人定义的引物确定，差异为2–5 bp），这在P. acidicola复合体及其近亲中也是独特的。条形码序列见补充说明S1，GB登录号见补充表S1。

**备注：**
该物种在Kollár等人（参考文献2019、2021）的研究中也被称为物种G，在本研究中被称为Pinnularia acidicola sensu stricto（s.s.）。尽管在Crozet群岛的典型产地进行了大量的培养尝试（建立了近90个硅藻菌株，其中28个属于该物种），但未观察到P. acidicola种群之间的遗传差异。然而，最大的菌株壳片长度约为32 μm，长度与宽度的比例为约5.3（基于10个个体），这意味着来自Ile de la Possession的培养和测序标本均不能被鉴定为var. elongata。因此，这一变种在遗传上尚未被捕捉到。尽管缺乏相反的证据，我们仍认为var. elongata表示同一生物实体的更长标本。关于其与P. vixconspicua（物种H）和P. acidireunionensis（物种I）的区别，请参见下文的备注。P. acidicola与P. subcapitata Gregory的区别仍然有效：“P. subcapitata Gregory的条纹图案不同，尤其是在中央缝线末端。P. acidicola的条纹较短，向两极逐渐变长，而P. subcapitata（及其变种elongata Krammer）的条纹较长且更平行”（Van de Vijver等人，参考文献2002）。

**Pinnularia vixconspicua Chattová, Metzeltin & Van de Vijver 2012：**
**形态学特征：** 壳片呈线性至线性椭圆形，边缘略凸或平行。顶端延长，较小个体呈亚平卧至亚帽状。根据培养样本和自然样本（n = 54）的数据，观察到的特征如下：壳片长度（16）23–54（59）μm，壳片宽度5–7 μm，长度与宽度的比例为（2.7）4.0–7.7（9.1）。轴区狭窄，向中央区域逐渐变宽。中央区域形成相对狭窄的条纹带，覆盖壳片长度的3–17%，有时缺失。缝线细长，中央缝线末端轻微弯曲。末端缝线裂口呈钩状，在低倍显微镜下可见。条纹在中间部分呈辐射状分布，向顶端逐渐汇聚，每10 μm有12–16条条纹（见补充表S1）。

**生态与分布：** 到目前为止，Pinnularia vixconspicua仅在印度洋南部的Ile Amsterdam岛上发现。该物种在该岛顶部火山口的湖泊和池塘中较为常见（海拔700–800米）。这些湖泊和池塘的特点是pH值在5.0–6.8之间，导电率非常低（<100 μS cm?1），营养物质和离子浓度极低，氯化物和硫酸盐浓度也较低（<20 mg l?1）。样本主要由各种喜酸生物组成，如Frustulia lebouvieri Van de Vijver & Gremmen、Eunotia insularum Van de Vijver & Lange-Bertalot、E. manguinii Van de Vijver & Jüttner、E. lecohui Van de Vijver、Kobayasiella subantarctica Van de Vijver & Vanhoutte，以及多种Pinnularia物种，如P. amsterdamensis Chattová, Metzeltin & Van de Vijver和P. vixconspicua。

**DNA条形码：** 据我们所知，该物种具有独特的rbcL和18S条形码，这有助于在元条形码研究中明确区分。rbcL条形码与P. acidicola s.s.相差2 bp，与P. acidireunionensis相差3 bp，与P. subcapitata-like谱系相差3–6 bp，与P. sinistra-like谱系相差1–4 bp。18S条形码也与P. acidicola s.s.相差2 bp，与P. acidireunionensis相差2 bp，与P. subcapitata-like谱系相差4–5 bp。条形码序列见补充说明S1，GB登录号见补充表S1。

**其他信息：**
在Kollár等人（参考文献2019、2021）的研究中，该物种也被称为物种G，在本研究中被称为Pinnularia acidicola sensu stricto（s.s.）。尽管在Crozet群岛的典型产地进行了大量的培养尝试，但未观察到P. acidicola种群之间的遗传差异。然而，最大的菌株壳片长度约为32 μm，长度与宽度的比例为约5.3（基于10个个体），这意味着来自Ile de la Possession的培养和测序标本均不能被鉴定为var. elongata。因此，这一变种在遗传上尚未被捕捉到。尽管缺乏相反的证据，我们仍认为var. elongata表示同一生物实体的更长标本。关于其与P. vixconspicua（物种H）和P. acidireunionensis（物种I）的区别，请参见下文的备注。P. acidicola与P. subcapitata Gregory的区别仍然有效：“P. subcapitata Gregory的条纹图案不同，尤其是在中央缝线末端。P. acidicola的条纹较短，向两极逐渐变长，而P. subcapitata（及其变种elongata Krammer）的条纹较长且更平行”（Van de Vijver等人，参考文献2002）。**Raphe filiform**，中央略微偏斜，末端具有钩状的裂隙。在两种培养环境和自然样本中（n = 28），测量得到的壳片尺寸为：长度22–35微米，宽度4.5–6.0微米，长度/宽度比为4.7–5.9，条纹密度为每10微米12–16条，相对带状结构覆盖率为8–24%（补充表S1，补充图S9）。

**词源**：种加词**acidireunionensis**来源于（1）原始分类单元**P. acidicola**的名称，这反映了该物种对酸性至中性环境的共同适应性；以及（2）其模式产地——留尼汪岛。该物种在Kollár等人（Citation2019, Citation2021）的研究中曾被称为物种I。

**生态与分布**：目前仅在印度洋的留尼汪岛上得到确认。模式标本采集自贝布尔森林（Forêt de Bébour）中一条几乎干涸的河流岩石上形成的小水坑中的沉积物，该河流靠近塔卡马卡路（Route Takamaka）。此外，我们对已发表的eDNA数据集的调查显示，该物种也可能存在于距离留尼汪岛约1450公里的马约特岛（Mayotte）。然而，rbcL条形码并不完全相同，因此根据现有数据无法确定马约特岛的种群是否属于同一物种，或是该复合体中的另一个物种。

**DNA条形码**：据我们所知，**P. acidireunionensis**具有独特的rbcL和18S条形码，这有助于基于DNA进行明确的物种鉴定。其rbcL条形码与**P. acidicola s.s.**相差5个碱基对（bp），与**P. vixconspicua**相差3个bp，与**P. subcapitata**类群相差4–7个bp，与**P. sinistra**类群相差4–7个bp。同样，18S条形码与**P. acidicola s.s.**相差4个bp，与**P. vixconspicua**相差2个bp，与**P. subcapitata**类群相差2–3个bp，与**P. sinistra**类群相差3–4个bp。目前已知该物种的正模标本具有以下四个DNA序列：1365 bp的质体rbcL（GenBank登录号OR524799）、920 bp的核28S（MH670442）、1568 bp的18S（PX243525）以及629 bp的线粒体cox1（MH681086）。

**正模标本**：凭证玻片BR-4933存放在比利时的Meise植物园，其中包含单克隆菌株REU12-9-14（模式标本见图4 I1,2,12），该菌株由Bart Van de Vijver于2012年12月在留尼汪岛贝布尔森林（Forêt de Bébour，坐标21°5’S, 55°29’E）采集的自然样本REU12-9中分离得到。

**等模标本**：凭证玻片PRC290018存放在捷克共和国布拉格的查尔斯大学（Charles University）植物标本馆，其中也包含菌株REU12-9-14。

**Phycobank注册**：http://phycobank.org/106506

**备注**：该物种与其他两个复合体成员（即**P. acidicola s.s.**和**P. vixconspicua**）在壳片轮廓上有所不同，**P. acidireunionensis**的较大标本在壳片中部有轻微的收缩。尽管对每种物种检查了超过30个个体（包括不同培养环境、自然样本和文献中的数据），但在其他两个物种中未观察到这一特征（见图4, 5）。相反，**P. acidicola s.s.**的壳片边缘呈凸状，而**P. vixconspicua**的壳片边缘介于两者之间。此外，**P. acidireunionensis**相对于其他两个成员更为纤细，这可能体现在其相对较短的壳片长度和宽度上（见图5A–C）。其带状结构也比**P. vixconspicua**更发达（中位数±标准差占壳片长度的12.2±3.7% vs 7.4±3.3%；见图5F）。另一个用于区分该物种的特征是条纹密度：**P. acidireunionensis**的条纹密度更高，每10微米有14.0±1.2条条纹，而**P. acidicola s.s.**为12.0±1.1条（见图5D）。在区分**P. subcapitata**方面，情况也与**P. acidicola**类似（见上述备注）。

**讨论**：多相分析方法是解析隐秘物种多样性的关键。在本研究中，我们分析了来自**Pinnularia acidicola**物种复合体及其密切相关的**P. subcapitata**和**P. sinistra**类群的75多个单克隆菌株（以及相应的自然样本和文献，总计超过150个标本）。这些菌株来自多个地点，包括波塞松岛（Ile de la Possession）、马里恩岛（Ile Marion）、阿姆斯特丹岛（Ile Amsterdam）、留尼汪岛（Ile de la Réunion）、捷克共和国、荷兰、英格兰、苏格兰、瑞典、西伯利亚和智利。通过多相分析方法，结合了形态学分析（LM和SEM）、传统和几何形态测量学，以及基于28S、18S、rbcL、psbA和cox1的分子系统发育学。利用已发表的环境DNA数据集和可用的环境信息，探讨了这些物种的地理分布范围。研究结果确认了**P. acidicola**物种复合体内的三个遗传上不同的、可能具有地理隔离的进化支系，每个支系都应被视为独立物种：**P. acidicola Van de Vijver & Le Cohu**、**P. vixconspicua Chattová, Metzeltin & Van de Vijver**和**P. acidireunionensis Kollár, T. Kohler, Kopalová & Van de Vijver sp. nov.**。尽管存在明显的遗传差异和可能的地理隔离，但现有数据未能检测到生态上的分化。这些物种主要分布在酸性土壤、池塘或湖泊中。然而，现有的环境数据相对较少，通过详细的野外观察或在实验室条件下进行生态生理实验，仍有潜力发现更多的生态分化。

我们的详细形态学分析揭示了这三个物种在单个特征和多变量形态空间上的细微但统计上显著的差异。单变量比较显示，条纹密度和带状结构覆盖率是区分**P. acidicola s.s.**和**P. vixconspicua**的关键特征，而壳片比例（即长度、宽度及其比率）有效区分了**P. acidireunionensis**（见图5）。基于传统形态测量数据的多变量分析（PCA和LDA）显示，这三个物种占据的形态空间部分重叠但统计上不同（见图6），证实了即使在形态上高度相似的物种，也能通过定量分析种群水平变异来可靠地划分。与传统形态测量特征相比，几何形态测量分析显示**P. acidicola**复合体内的三个物种之间的分化程度较低（见补充图S6）。这表明壳片和带状结构的形态特征在区分物种方面的能力有限，可能反映了它们与祖先状态的差异较小，而非趋同进化（参见Lefebvre等人，Citation2017）。总体而言，形态上的相似性强调了**P. acidicola s.s.**、**P. vixconspicua**和**P. acidireunionensis**的伪隐秘状态。这也突显了物种形成的连续性，以及依赖少数诊断特征进行物种划分的局限性（参见Verbruggen，Citation2014）。另一方面，过度收集数据（无论其质量或诊断价值如何）可能会因非信息性特征而模糊物种界限，导致物种群聚集在共同平均值附近（参见Stebbins，Citation1984）。换句话说，只有部分特征会演化为其衍生状态，而许多特征在进化上保持不变，因此对物种划分帮助不大（参见De Queiroz，Citation2007）。因此，在划分物种时，应仔细分析单个特征及其组合的诊断价值（例如，我们通过单独分析每个特征并限制用于LDA的PC轴数量来实现这一点）。

此外，值得强调的是，未来的形态学物种鉴定应基于整个种群的分析，而不仅仅是少数个体的检查。在本研究中，一致发现了独特的rbcL和18S条形码，这表明这些标记至少在当前采样的种群中可以实现明确的物种水平鉴定。然而，需要进一步的测序来评估种内变异，并确认这些标记在整个地理和遗传范围内的稳定性。

**进化意义和系统发育背景**：多种因素可能导致**P. acidicola**物种复合体内壳片形状的形态停滞。在相似的生态条件下，稳定选择可能维持了相似的壳片形状，尽管存在遗传分化（参见Pinseel等人，Citation2019）。或者，可能尚未经过足够的进化时间来允许形状分化。然而，根据化石校准的分子钟估计，**P. acidicola**物种复合体内的物种形成时间约为6±3百万年（参见Kollár等人，Citation2021）。原则上，这样的时间跨度应该足以导致形态分化（参见Stelbrink等人，Citation2018），尽管地质时间并不等同于进化时间（参见Gingerich，Citation2001）。此外，由于化石记录稀少且不均匀，基于化石校准的分子钟估计的分化时间存在不确定性（参见Parfrey等人，Citation2011）。虽然硅藻化石的数量相对较多，但可用的校准点仍然有限（参见Theriot等人，Citation2010），尽管这一数量正在增加（参见Bry?ka等人，Citation2024）。这可能会影响分子钟估计的准确性。

例如，我们的三个伪隐秘物种研究系统似乎是岛屿隔离物种形成的理想候选者（参见Whittaker等人，Citation2017）。然而，地质记录表明，这些物种栖息的大多数火山岛出现的时间晚于估计的分化时间（6±3百万年；参见Kollár等人，Citation2021）：阿姆斯特丹岛和马里恩岛约0.5百万年（参见Watkins等人，Citation1975；Hall等人，Citation2011），留尼汪岛约2百万年（参见Lénat等人，Citation2001）。这种差异可能表明分子钟对分化时间的估计过高，或者该复合体内可能存在未被发现的物种，它们可能栖息在其他陆地上。更精确的校准（或人口统计建模；参见Bendif等人，Citation2019），以及更广泛的采样，对于解决这些问题至关重要。鉴于硅藻的化石记录相对丰富，它们可能是实现这一目标的最佳原生生物模型之一。

**系统发育关系**：由于基因树的一致性不足，**Pinnularia acidicola**复合体中三个伪隐秘物种之间的系统发育关系尚未明确。基于28S的单基因分析将**P. acidicola s.s.**置于复合体的基部（与串联分析结果一致，见图3），而18S、rbcL和cox1的分析则将**P. acidireunionensis**置于基部（参见Kollár等人，Citation2021）。额外的遗传数据可能会解决这一问题。另一方面，最近的一项大规模系统基因组学研究表明，无论使用多少遗传数据，硅藻生命树中的某些节点都无法解决（参见Alverson等人，Citation2025）。这主要是由于替代饱和导致的大量基因不一致性，即相同位置的重复替代掩盖了系统发育信号。尽管在深层进化时间尺度上存在这些限制，但在物种水平上，这些限制通常不那么明显，因为分化时间通常较短，基因序列不太可能达到饱和状态（参见Alverson等人，Citation2025中的图3C，其中基因一致性随节点年龄的增加而提高）。此外，对于**Pinnularia gibba**组（包括**P. acidicola**复合体），没有标记显示出饱和迹象（参见Kollár等人，Citation2021）。因此，**P. acidicola**复合体中观察到的基因树不一致性不太可能是由于技术误差（如未检测到的序列饱和），而可能反映了不完全的谱系分选或物种形成过程中的网状进化（参见Roux等人，Citation2016）。尽管如此，总体上的形态相似性强调了**P. acidicola s.s.**、**P. vixconspicua**和**P. acidireunionensis**的伪隐秘状态。这也突显了物种形成的连续性，以及依赖少数诊断特征进行物种划分的局限性（参见Verbruggen，Citation2014）。另一方面，过度收集数据（无论其质量或诊断价值如何）可能会因非信息性特征而模糊物种界限，使物种群更接近共同平均值（参见Stebbins，Citation1984）。换句话说，只有部分特征会演化为其衍生状态，而许多特征在进化上保持不变，因此对物种划分帮助不大（参见De Queiroz，Citation2007）。因此，在划分物种时，应仔细分析单个特征的诊断价值及其组合。

此外，未来的形态学物种鉴定也应基于整个种群的分析，而不仅仅是少数个体的检查。在本研究中，一致发现了独特的rbcL和18S条形码，这表明这些标记至少在当前采样的种群中可以实现明确的物种水平鉴定。然而，需要进一步的测序来评估种内变异，并确认这些标记在整个物种地理和遗传范围内的稳定性。

**进化意义和系统发育背景**：几种因素可能导致**P. acidicola**物种复合体内壳片形状的形态停滞。在相似的生态条件下，稳定选择可能维持了相似的壳片形状，尽管存在遗传分化（参见Pinseel等人，Citation2019）。或者，可能尚未经过足够的进化时间来允许形状分化。然而，根据化石校准的分子钟估计，**P. acidicola**物种复合体内的物种形成时间约为6±3百万年（参见Kollár等人，Citation2021）。原则上，这样的时间跨度应该足以导致形态分化（参见Stelbrink等人，Citation2018），尽管地质时间并不等同于进化时间（参见Gingerich，Citation2001）。此外，由于化石记录的稀少和不均匀，基于化石校准的分子钟估计的分化时间具有不确定性（参见Parfrey等人，Citation2011）。虽然硅藻化石的数量相对较多，但可用的校准点仍然有限（参见Theriot等人，Citation2010），尽管这一数量正在增加（参见Bry?ka等人，Citation2024）。这可能会影响分子钟估计的准确性。

例如，我们的三个伪隐秘物种研究系统似乎是岛屿隔离物种形成的理想候选者（参见Whittaker等人，Citation2017）。然而，地质记录表明，这些物种栖息的大多数火山岛出现的时间晚于估计的分化时间（6±3百万年；参见Kollár等人，Citation2021）：阿姆斯特丹岛和马里恩岛约0.5百万年（参见Watkins等人，Citation1975；Hall等人，Citation2011），留尼汪岛约2百万年（参见Lénat等人，Citation2001）。这种差异可能表明分子钟对分化时间的估计过高，或者岛屿物种形成是主要的物种形成方式存在挑战，或者该复合体内可能存在未被发现的物种，它们可能栖息在其他陆地上。更精确的校准（或人口统计建模；参见Bendif等人，Citation2019），以及更广泛的采样，对于解决这些问题至关重要。鉴于硅藻的化石记录相对丰富，它们可能是实现这一目标的最佳原生生物模型之一。

**系统发育关系**：由于基因树的一致性不足，**Pinnularia acidicola**复合体中三个伪隐秘物种之间的系统发育关系尚未明确。基于28S的单基因分析将**P. acidicola s.s.**置于复合体的基部，与串联分析结果一致（见图3），而18S、rbcL和cox1的分析则将**P. acidireunionensis**置于基部（参见Kollár等人，Citation2021）。额外的遗传数据可能会解决这一问题。另一方面，最近的一项大规模系统基因组学研究表明，无论使用多少遗传数据，硅藻生命树中的某些节点都无法解决（参见Alverson等人，Citation2025）。这主要是由于替代饱和导致的基因不一致性，即同一位置的重复替代掩盖了系统发育信号。尽管在深层进化时间尺度上存在这些限制，但在物种水平上，这些限制通常不那么明显，因为分化时间通常较短，基因序列不太可能达到饱和状态。这已在硅藻研究中得到证实（参见Alverson等人，Citation2025中的图3C，其中基因一致性随节点年龄的增加而提高），以及**Pinnularia gibba**组（包括**P. acidicola**复合体），其中没有标记显示出饱和迹象（参见Kollár等人，Citation2021）。因此，**P. acidicola**复合体中观察到的基因树不一致性不太可能是由于技术误差（如未检测到的序列饱和），而可能反映了物种形成过程中的不完全谱系分选或网状进化（参见Roux等人，Citation2016）。尽管存在这种系统发育上的不确定性，但分子标记、形态学和生物地理学的一致证据支持将它们视为独立演化的不同物种。

然而，Alverson等人（Citation2025）的发现强调了多相分析的价值，因为即使广泛的基因组数据集也可能无法提供完整的系统发育分辨率，这是由于遗传过程中的固有因素（如替代饱和和不完全的谱系分选）。在这种情况下，其他证据——包括形态学、生态学或生物地理学——可能提供补充见解。重要的是，这也强调了DNA条形码、物种划分和系统发育推断在分子分类学中的根本差异（参见DeSalle等人，Citation2005）。在物种水平分类和进化历史的交叉点工作时，认识到这些差异和局限性至关重要。

**环境测序**：在马约特岛的溪流中检测到一种与**P. acidireunionensis**仅在rbcL条形码上相差一个核苷酸的密切相关的ASV，这提示其分布可能更广泛。值得注意的是，这种核苷酸替代引起的氨基酸变化（Leu ? Ile）是保守的，不太可能影响蛋白质功能。此外，马约特的ASV似乎与Vasselon等人（Citation2017）的OTU000657相同，后者在四个马约特岛的溪流中以较低的读取频率存在（每个样本1–13次读取，0.02–0.22%；根据我们的相对丰度，为0.05–0.19%）。这表明该谱系可能属于稀有生物圈（Lynch & Neufeld, Citation2015），这可能会使未来在培养中分离它或通过显微镜研究它变得更加复杂。考虑到P. acidireunionensis与其姐妹类群在rbcL条形码上的差异较大（与其他两种P. acidicola复合物种相比有3-5个碱基对的差异，与P. subcapitata和P. sinistra类群相比有4-7个碱基对的差异），马约特种群可能是同种。马约特和留尼汪之间的距离约为1450公里，与马里恩岛和克罗泽特之间的距离（约1000公里）相当，这两个地方都存在P. acidicola s.s.的种群，这表明P. acidireunionensis的这种广泛分布是可行的。然而，当加入引物位点时（将比较区域从263个碱基对扩展到312个碱基对），差异数量从1个增加到3个碱基对。鉴于Pinnularia属中rbcL的相对保守性（Kollár等人，Citation2019），这样的差异是相当大的。重要的是，在P. acidicola复合物种的三个物种中都没有观察到rbcL条形码的种内变异，即使在地理上分布广泛的P. acidicola s.s.中也是如此（它们分别栖息在马里恩岛和克罗泽特群岛），这反映在它们更快速进化的28S基因上。综合所有这些因素，并且由于没有检测到完全匹配，我们假设所检查的任何ASV都不是该复合物种中的任何一个物种。尽管如此，仍应考虑全长标记序列、形态学比较和环境背景，以最终确定马约特谱系是P. acidireunionensis已知范围的扩展还是该物种复合体中的独立物种。同样，鉴于P. acidicola物种复合体的（伪）隐秘性质以及缺乏序列数据，我们无法仅凭文献记录（图1）来验证P. acidicola s.s.（物种G）的同种性，包括来自德尔卡诺的阿姆斯特丹岛种群（Van de Vijver等人，Citation2012；补充说明S2）。这些种群应在未来的研究中优先进行针对性采样。更广泛地说，这项研究强调了公共eDNA数据集在生物地理学和生态学推断中的效用（和局限性）。同时，几个挑战限制了它们的常规使用。首先，高质量的硅藻eDNA数据集仍然稀缺，特别是在南半球。其次，目前硅藻宏条形码分析中使用了不同的rbcL条形码区域。尽管两种最常见的选项（Vasselon等人，Citation2017；Kelly等人，Citation2018）有重叠，但它们不同的引物位点可能会影响捕获的类群范围。然而，这不太可能影响我们的分析，因为这两种引物集都能捕获所有已知的P. acidicola物种复合成员。第三，单个eDNA样本的元数据往往不完整，有时仅限于其地理来源，从而阻碍了潜在的生态学推断。最后，许多宏条形码研究没有为推断的OTUs或ASVs提供代表性序列，需要重新处理原始读数，这既耗时又计算密集。这个问题还因原始数据格式的不一致性而加剧，包括多重测序的程度、读数配对和合并的不同。因此，研究人员应该更加意识到需要与其出版物一起发布他们的协议、生物信息学代码和关键输出（如推断OTUs或ASVs的代表性序列）。所有这些障碍都阻碍了标准化、可扩展的流程的发展，并限制了没有高级生物信息学技能和资源的研究人员进行基于eDNA的生物地理学分析的能力。

关于最亲近的亲属的分类学见解，基于形态学和（系统）遗传学，Pinnularia subcapitata和Pinnularia sinistra被确定为P. acidicola物种复合体已知的最亲近的现存亲属。根据（系统）遗传学，P. subcapitata至少由三个不同的组组成（图3），证实了该分类单元实际上是一个亚种复合体（Krammer，Citation2000），尽管它是多系的（因为物种复合体通常被认为是隐含的单系的）。因此，P. subcapitata被揭示为一个普遍使用的名称，“用于任何表面分类为某种‘常用名称’的标本”的分类单元（Williams，Citation2025），在这种情况下是基于subcapitate顶端（图8B）的P. subcapitata Gregory（Citation1856）。然而，这一特征状态是非共形的，可能是同塑的（参见补充图S2和Kollár等人，Citation2019，图4），这是由于趋同或平行进化造成的。目前手头的序列数据无法确定P. subcapitata的三个系统组是否代表三个独立的物种，或者它们本身也是物种复合体。为了方便下面的讨论，我们将保守地认为它们只是三个物种。其中一组（P. subcapitata 3，图3）可能与比利时苔藓样本中描述的变种P. subcapitata var. elongata同义。虽然Krammer（Citation2000）认为所有P. subcapitata变种在古北地区都有分布，但他指出P. subcapitata var. elongata在德国北部比南部更为常见。在古北地区，AlgaeBase记录了这种变种在比利时、捷克北部、芬兰、法国、德国、荷兰、波兰、斯堪的纳维亚和俄罗斯远东的存在（具体参考文献见www.algaebase.org，访问日期2025年4月10日）。现有的序列数据属于来自荷兰的P. subcapitata var. elongata菌株（Wie）（Souffreau等人，Citation2011）。此外，根据现有照片，来自德国北部的P. subcapitata菌株AT-100.01也可以识别为这一变种（Bruder等人，Citation2008）。综合这些信息，表明P. subcapitata var. elongata应该提升为物种级别，因为它代表了至少一种主要分布在欧洲中部到北部的物种（大约从北纬50度线开始）。有趣的是，属于P. subcapitata其他两个系统组（P. subcapitata 1和2，图3）的四个菌株（UK105、111、159和212）以及两个菌株（UK122和126）在苏格兰的Allt a’ Bhalachain溪流中同域起源（补充表S1）。毫无疑问，这两组菌株代表两个不同的物种，因为它们不仅在系统树的不同部分出现，而且它们的rbcL序列至少有18个碱基对的差异（1.3%）。此外，由于P. subcapitata的模式标本来自苏格兰（Gregory，Citation1856），其中一个组可能与模式种群相同。如果是这样，那么根据壳瓣轮廓，P. subcapitata组1更有可能对应于模式种群，尽管它的带状结构似乎比Krammer（Citation2000；图版88，图49和50）中描绘的P. subcapitata Gregory的模式标本和等模式标本更大。另一方面，P. subcapitata组2中的菌株（UK122、126和CZECH-NOS2-7）与P. subcapitata var. subrostrata Krammer（Citation1992）更为相似（尽管不完全相同）。关于P. sinistra，除了智利的P. cf. sinistra菌株（Tor4)r外，来自英格兰（UK785）、捷克（LEV023）和西伯利亚（B024-1）的可用菌株在统计上支持其单系性。同样，由于缺乏适合物种界定的序列数据（例如Pinnularia中的28S基因，仅在西伯利亚菌株中有数据），无法确定这三个种群是否代表一个物种，尽管最近根据“壳瓣末端更明显的锥形和轴向区域更宽”的特征将西伯利亚种群描述为独立的物种P. siberiosinistra（Kulikovskiy等人，Citation2023）。P. siberiosinistra的rbcL序列与捷克菌株有1个碱基对的差异（0.1%），与英格兰菌株有1个碱基对的差异（位于不同的位置）。此外，捷克种群? 带状结构比来自德国的P. sinistra模式种群更大（覆盖了壳瓣长度的20-27% vs 8-19%）。这些差异是种间还是种内变异尚不清楚。尽管如此，鉴于P. subcapitata和P. sinistra在某些大小群体中的部分形态重叠（Krammer，Citation2000），应使用具有种群水平采样和分辨率的序列数据（例如28S或cox1；Kollár等人，Citation2019）来界定这两个形态组内的物种。

综上所述，我们的发现强调了结合分子物种界定、系统遗传学、传统和几何形态测量以及地理数据在解决硅藻隐秘物种多样性方面的重要性。通过将这种多阶段方法应用于Pinnularia acidicola物种复合体，我们能够界定并正式确认三个基因上不同的、可能在地理上分离的物种，尽管它们在形态上非常相似。我们的结果表明，即使在分类学层次较浅的情况下，壳瓣形状的差异可能很小，仔细的统计分析也能揭示出微妙但一致的诊断差异，表明它们是独立物种。同时，我们的研究强调了依赖单一特征或小样本量的局限性，并强调了种群水平采样和综合数据分析对于稳健的物种级别分类的重要性。更广泛地说，这些发现揭示了即使是形态上保守的硅藻群体背后的进化复杂性，强调了继续开发能够可靠界定和描述生命隐藏多样性的综合分类方法的需求。

作者贡献：
J. Kollár：研究设计和监督，LM，成像和形态测量，DNA提取和扩增，DNA和eDNA分析，统计分析，数据管理，手稿起草，图表和表格制作，手稿编辑；
B. Van de Vijver：在Possession岛、阿姆斯特丹岛和留尼汪岛的样本采集，样本处理，LM，成像，分类框架和验证，手稿编辑；
J. Kulichová：几何形态测量的监督和分析，图表制作，手稿编辑；
E. Hejduková：样本处理，LM，成像，手稿编辑；
R. Viso：几何形态测量的成像，手稿编辑；
T.J. Kohler：项目监督，统计分析监督，手稿编辑；
M. Kahlert：在瑞典的样本采集，样本处理，培养，管理，手稿编辑；
E. Pinseel：提供材料、培养物和DNA序列，手稿编辑；
A. Poulí?ková：提供材料，手稿编辑；
J. Zimmermann：菌株管理，DNA提取；
J. Neustupa：几何形态测量的监督，手稿编辑；
W. Vyverman：提供材料、培养物和DNA序列，手稿编辑；
K. Kopalová：样本处理，LM，SEM，图表制作，手稿编辑。

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以下补充材料可通过文章在线页面上的“补充内容”标签访问：https://doi.org/10.1080/09670262.2026.2626682
补充说明S1. DNA条形码
补充说明S2. 关于将物种H重新鉴定为Pinnularia vixconspicua
补充表S1. 本研究中涉及的分类单元总结
补充表S2. 本研究中使用的比对特征
补充表S3. eDNA数据集
补充表S4. eDNA发现总结
补充图S1. 关于研究组内物种界限的替代ASAP假设
补充图S2. 基于串联比对的完整物种级别系统发育树
补充图S3. Pinnularia acidicola复合体及相关分类单元的传统单变量形态测量比较
补充图S4. Pinnularia acidicola复合体的传统双变量形态测量散点图和密度图
补充图S5. 包括Pinnularia acidicola复合体及相关分类单元的传统多变量形态空间
补充图S6. 不包括相关分类单元的几何多变量形态空间
补充图S7. Pinnularia acidicola复合体内三个物种的变形网格
补充图S8. 物种G（即严格意义上的Pinnularia acidicola）的模式菌株的SEM图像
补充图S9. 所有已知的Pinnularia acidireunionensis sp. nov. 标本
补充图S10. 基于28S rDNA的完整系统发育树，包括所有Pinnularia acidicola物种复合体的菌株
补充图S11. 每个Pinnularia acidicola复合体物种的平均样本附近的细胞
补充数据S1. 本研究中使用的DNA序列比对