亚得里亚海北部浮游植物多样性：基于显微术与宏条形码技术的发现与不一致性

《Biology》：Phytoplankton Diversity in the Northern Adriatic Sea: Insights and Inconsistencies from Microscopy and Metabarcoding Giorgia Montali, Francesca Neri, Elisa Banchi, Federica Cerino, Timotej Turk Dermastia, Janja Francé, Patricija Mozeti?, Angela Pelusi, Tiziana Romagnoli and Stefano Accoroni + 2 authors

　　

浮游植物是海洋生态系统的关键组成部分，也是对环境变化敏感的指示因子。本研究结合了光学显微术（light microscopy, LM）与DNA宏条形码技术（DNA metabarcoding, MB）（针对18S-V4、18S-V9和rbcL基因区域），旨在评估亚得里亚海北部三个长期生态研究（LTER）站点之间浮游植物多样性与群落结构的差异，并评价不同方法对群落评估的影响。通过整合两种方法，共记录到329个属和527个种。宏条形码技术（MB）比光学显微术（LM）揭示了更高的分类学丰富度，特别是对于甲藻和小型植鞭毛藻类，而光学显微术在识别硅藻和颗石藻方面更具优势。相较于18S区域，rbcL标记基因为硅藻提供了更高的分类学分辨率。站点间共有的物种比例从光学显微术的13%提高至宏条形码技术的33%–42%，这表明宏条形码技术可以有效减少仅依赖光学显微术时所观察到的差异。基于物种相对丰度进行的聚类分析显示，样本首先按研究方法而非采样站点聚集，表明方法学变异超过了生态学差异。不同方法获得的相对丰度模式存在差异，但在应用基于18S rRNA基因拷贝数（GCN）的校正因子（CFs）后，两者结果变得更具有可比性，尤其对于甲藻而言。总体而言，宏条形码技术增强了生物多样性评估和站点间的可比性，而光学显微术对于形态学验证和丰度评估仍然必不可少。

一、 研究背景、问题与目的

浮游植物是海洋生态系统的基础，贡献了约50%的全球初级生产力，并是评估沿海生态系统生态状况的有效指示因子。亚得里亚海北部作为一个浅水、高河流输入且受人类活动与气候变化显著影响的区域，其浮游植物群落的长期监测至关重要。传统的监测方法主要依赖于基于光学显微术（LM）的细胞计数（如Uterm?hl方法）。尽管LM能够提供主要类群的丰度和生物量信息，但其在物种水平鉴定上存在局限性，例如对微小、脆弱或形态相似物种的识别困难，且过程耗时、依赖专业经验、易受主观性影响。

近年来，DNA宏条形码技术（MB）作为一种新兴的生物多样性研究工具，为物种鉴定提供了更快速、标准化的替代方案。然而，MB也存在其自身的挑战，包括遗传标记（条形码）和引物的选择、参考数据库的质量、以及生物信息学流程的准确性等。特别是，不同生物体间18S rRNA基因拷贝数（GCN）的差异可能导致某些类群（如甲藻）相对丰度的高估，从而影响群落组成的评估。此外，如何将MB数据与传统LM数据进行可比性整合，以及方法学选择（如不同标记基因、是否应用校正因子）如何影响对浮游植物群落结构的解读，仍是亟待解决的问题。

基于此，研究人员在亚得里亚海北部的三个长期生态研究站点（C1、00BF、SG01），对2019年采集的样本同步进行了LM分析和针对18S-V4、18S-V9及rbcL基因区域的MB分析。本研究旨在比较两种方法在揭示浮游植物多样性和群落结构方面的差异，评估校正因子的应用效果，并检验MB是否有助于减少以往仅依赖LM时观察到的站点间差异，从而为提升海洋生物多样性评估的准确性与可比性提供依据。本项研究成果发表在《Biology》期刊。

二、 主要关键技术方法

本研究在亚得里亚海北部三个长期生态研究站点采集表层水样。针对同一份水样，分别进行传统光学显微术分析和DNA宏条形码分析。对于LM分析，水样经甲醛固定后，使用倒置显微镜依据Uterm?hl方法进行鉴定和计数。对于MB分析，水样经不同孔径滤膜过滤收集生物质，提取总DNA。采用多重PCR扩增三个靶标基因区域：18S rRNA基因的V4和V9可变区，以及rbcL叶绿体基因（专用于硅藻）。扩增产物经Illumina MiSeq平台进行双端测序。获得的序列数据经过质量过滤、去噪和分类学分配等生物信息学流程处理。为比较两种方法的相对丰度结果，研究人员对MB数据应用了基于18S rRNA基因拷贝数（GCN）的组特异性校正因子（CFs）。所有统计分析（如丰富度比较、聚类分析、韦恩图等）均在R语言环境中完成，并仅基于各方法共有的采样月份数据进行，以确保公平比较。

三、 研究结果

3.1. 浮游植物属与种的丰富度

整合两种方法，共记录到329个属和527个种。MB分析（V4和V9标记）在属和种水平上检测到的丰富度均高于LM。MB检测到的高丰富度主要体现在甲藻和植鞭毛藻类，而LM在识别硅藻和颗石藻方面更优。使用专门针对硅藻的rbcL标记基因，在多个站点检测到了比LM和18S标记更多的硅藻属和种。

3.2. 物种水平的浮游植物多样性

LM分析在所有站点共鉴定出118个物种，其中仅13%为三个站点所共有。MB分析（V9和V4）分别鉴定出144和175个物种，且站点间共有的物种比例显著提高（V9为33%，V4为42%）。这表明MB可能有助于减少仅依赖LM时观察到的站点间差异。

3.3. 群落组成与校正因子

未应用校正因子时，两种方法获得的浮游植物群落相对丰度模式差异显著：LM数据显示植鞭毛藻类占主导，而MB数据显示甲藻占主导。应用基于GCN的校正因子后，MB数据中植鞭毛藻类的相对丰度大幅增加，甲藻丰度大幅降低，使得MB的丰度估算更接近LM结果，特别是对甲藻的校正效果明显。然而，校正后的MB数据仍低估了硅藻的相对丰度。

3.4. 聚类分析

基于物种相对丰度（经中心对数比转换）的层次聚类分析显示，样本主要按分析方法（LM、V9、V4）而非采样站点聚为三类。这表明方法学差异对群落结构评估的影响超过了站点间的生态差异。热图分析进一步揭示，LM主要高丰度检测到部分硅藻物种，而MB（V4/V9）则更多地检测到一系列甲藻、植鞭毛藻类及其他硅藻物种。

四、 讨论与结论总结

讨论部分总结：

本研究表明，结合多标记MB与LM可更全面地揭示浮游植物多样性。MB在检测甲藻和植鞭毛藻类（特别是小型、脆弱类群）方面优势明显，而LM在鉴定具有明显形态特征的较大型类群（如硅藻、颗石藻）方面仍不可或缺。MB显著增加了站点间共有物种的比例，提示其可减少因LM方法局限性和观察者差异导致的站点间差异。聚类分析结果进一步证实，方法学变异是造成群落结构差异的主要因素。

MB与LM在相对丰度估算上的差异，部分源于不同类群细胞DNA含量（如甲藻的高基因拷贝数）导致的扩增偏倚。应用组特异性基因拷贝数校正因子（CFs）可部分调和这种差异，使MB的丰度估算（尤其对甲藻）更接近LM结果。然而，对于硅藻等类群，由于个体生物量及基因拷贝数变异大，通用CFs的校正效果有限，未来需开发属或种水平的特异性校正因子。此外，参考数据库的不完整（如许多颗石藻物种缺乏序列数据）也限制了MB对部分类群的识别能力。

研究结论翻译：

理解浮游植物多样性和群落组成对于评估生态系统健康和监测环境变化至关重要，这需要准确的物种鉴定。在本研究中，多标记宏条形码技术（针对18S rRNA基因的V4和V9区域以及rbcL基因）与传统光学显微术的结合应用揭示，在亚得里亚海北部的三个长期生态研究站点，宏条形码技术比光学显微术检测到更高的浮游植物丰富度，特别是对于甲藻和植鞭毛藻。通过整合两种方法，共记录了329个属和527个种，突显了两种方法的互补优势。宏条形码还增加了站点间共享物种的比例，改善了站点间的可比性。

尽管采样站点和当地环境条件存在差异，但亚得里亚海北部浮游植物组成的总体相似性表明存在一个共享的区域物种库。虽然确实存在一些生态变异，但观测到的站点间差异主要归因于方法学选择，例如使用宏条形码技术与光学显微术以及分子标记的选择。

光学显微术与宏条形码技术在相对丰度估计上的差异进一步凸显了对精学校正因子的需求。尽管校正因子可以部分协调两种方法（例如在应用校正因子后减少了对甲藻的高估），但它们对其他类群的效果仍然不足。因此，开发分类单元特异性校正因子和扩展经过质量检查的条形码数据库，是提高分子评估定量可靠性的关键步骤。

总体而言，本研究证明，整合分子和形态学方法为长期浮游植物监测提供了一个更全面的框架。这种整合策略改善了生物多样性评估，并增强了监测站点间的数据可比性。未来的工作应侧重于跨站点的方案统一、分类单元特异性定量校准以及持续改进参考序列库，以加强长期生态研究网络等监测网络内部的数据可比性。