通过过表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）来稳定Phaeodactylum tricornutum中的异源蛋白表达

《Algal Research》：Stabilizing heterologous protein production in Phaeodactylum tricornutum through cystatin overexpression

　　艾丽莎·范蒂诺（Elisa Fantino）|娜塔莎·梅林多尔（Natacha Mérindol）|卡罗琳娜·加布里埃拉·加洪·罗布雷斯（Carolina Gabriela Gajón Robles）|法蒂玛·阿瓦德（Fatima Awwad）|凯伦·克里斯蒂娜·贡萨尔维斯·多斯桑托斯（Karen Cristine Gon?alves dos Santos）|金米-莉·雷奥姆（Kimy-Li Rhéaume）|玛丽-克莱尔·古莱（Marie-Claire Goulet）|多米尼克·米肖（Dominique Michaud）|伊莎贝尔·德加涅-佩尼克斯（Isabel Desgagné-Penix）
加拿大魁北克省特鲁瓦里维耶尔斯市魁北克大学生物化学、化学、物理学和法医科学系

**摘要**
海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum已成为代谢工程和重组蛋白生产的一个新兴平台。然而，在这种经过生物工程改造的硅藻中，异源蛋白的积累往往存在显著的细胞间差异，并且会随着世代的延续而减少。在本研究中，我们探讨了过表达一种内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂——半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin，简称PtCYS）是否能够稳定P. tricornutum中的异源蛋白表达。我们构建了共表达黄色荧光蛋白（yfp）基因和PtCYS的染色体外表达菌株。PtCYS的抗蛋白酶活性已在体外得到验证。YFP与全长PtCYS编码序列的共表达使得YFP的积累量增加了约1.6倍。与PtCYS的融合会降低异源蛋白的积累，且这种效应依赖于内源性信号肽的存在。将PtCYS重新引入三个初始荧光强度较低的仅含YFP的菌株后，其中一个菌株的YFP信号强度显著增加了约2倍，这突显了该策略的潜力以及菌株间的差异性。重要的是，YFP积累量的变化与yfp转基因拷贝数的增加无关。这些结果表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂介导的蛋白水解活性调节可以影响P. tricornutum中异源蛋白的稳定性，同时也揭示了这种调节作用受到特定环境和遗传背景的影响。这些结果为改进基于硅藻的生物工厂中的重组蛋白生产提供了关键的设计思路。

**1. 引言**
全球经济正致力于构建更加绿色和可持续的社会。在这一背景下，生物技术领域取得了显著进展，尤其是在Phaeodactylum tricornutum的工业应用方面。这种海洋硅藻已成为代谢工程和分子农业的宝贵平台[1]。P. tricornutum每年可产生132公吨的干生物量，显示出其作为高价值蛋白生产平台的巨大潜力。在利用该硅藻进行重组蛋白表达（例如SARS-CoV-2蛋白[2]）、治疗性代谢产物生产[3-11]以及Omega-3脂肪酸生产[12]方面也取得了重要进展。使用微藻生产重组蛋白的主要优势在于其N-连接糖基化途径与哺乳动物相似[13]，以及其能够折叠复杂的异源多聚蛋白，从而实现精确的翻译后修饰[14]。相比之下，细菌表达系统无法进行糖基化，而酵母生产系统产生的高甘露糖结构与哺乳动物的复杂糖链不同，可能导致抗原性[15, 16]。在昆虫和哺乳动物细胞中生产的重组蛋白成本高昂且耗时[17, 18]；此外，哺乳动物细胞培养容易受到病毒污染[18, 19]。植物虽然作为宿主具有生态学优势，但其基因操作耗时且需要肥沃的土地[20]。综合来看，硅藻结合了哺乳动物和植物的优点（作为光合生物），适用于重组蛋白、生物制药和疫苗的生产，具有高资源效率、易于扩大规模以及复杂的蛋白质折叠能力。自2008年其基因组测序和注释完成以来，P. tricornutum因其能在海水中生长而被认为是大规模培养的理想生物。尽管如此，仍存在一些挑战。Diamond等人报告称，在转化和长期培养过程中，外源DNA序列可能会发生改变[21]；Diaz-Garza等人观察到表型异质性[22]；Awwad等人记录到尽管DNA序列保守，代谢产物的产量却逐渐下降[6]，这表明可能存在转录后调控机制。Messaabi等人发现P. tricornutum细胞中存在内源性凝血酶活性，导致由凝血酶切割序列连接的两种蛋白质在体内发生分离[23]。所有这些发现表明，尽管P. tricornutum是一个高效的蛋白生产平台，但仍需进一步的分子工程、优化和调控以充分发挥其作为模式物种的潜力。

限制异源蛋白产量的主要因素之一是由内源性蛋白酶介导的蛋白水解作用，这些蛋白酶在许多生理过程中起着关键作用，包括细胞分裂、生长、繁殖、发育、光合作用、衰老、蛋白质周转、程序性细胞死亡和应激反应[24-27]。类似木瓜蛋白酶的肽酶（属于半胱氨酸蛋白酶类）因其在多种生物过程中的作用而受到广泛研究[28, 29]。在P. tricornutum中，蛋白酶在卵形形态中更为丰富，这与细胞应激有关[28]。鉴于蛋白酶在蛋白质积累中的关键作用，人们提出了多种策略来减少其对异源宿主的影响。竞争性抑制剂、反义RNA或RNA沉默技术已被成功用于提高植物中的重组蛋白积累[30-32]。例如，在番茄植株中共表达番茄组织蛋白酶D抑制剂（SlCDI）和牛aprotinin可以降低蛋白质提取过程中的组织蛋白酶D类似蛋白酶的水平[33]，并在马铃薯叶片中保护蛋白质[34]；辅助蛋白酶抑制剂的共分泌可以减少烟草根部分泌的IgG单克隆抗体的降解[35]，而沉默半胱氨酸蛋白酶则能增加烟草（Nicotiana tabacum）中重组人白细胞介素-10的积累[36]。半胱氨酸蛋白酶抑制剂通过与半胱氨酸蛋白酶的三个关键区域相互作用来发挥抑制作用：N端区域的两个保守甘氨酸残基、第一个β-发夹环中的高度保守的Gln-X-Val-X-Gly基序，以及C端第二个β-发夹环中的二肽基序（ProTrp或LeuTrp）[37, 38, 39]。在烟草（Nicotiana benthamiana）中共表达番茄半胱氨酸蛋白酶SlCYS8时，它作为伪底物阻断蛋白酶活性位点，从而提高了目标重组蛋白的产量，增加了近40%[40]。SlCYS8不仅提高了从叶片组织中纯化的完全组装的IgG抗体的数量，还增强了含有重链Fc结构域的活性抗体片段的稳定性[41]。同样，转基因烟草植株持续表达水稻半胱氨酸蛋白酶oryzacystatin-I后，半胱氨酸蛋白酶的活性降低，使得大肠杆菌谷胱甘肽还原酶在宿主植物中的积累和活性增加[42]。有趣的是，将SlCYS8与人类α1-抗胰凝乳蛋白酶（α1ACT）融合并在烟草中短暂表达后，α1ACT的积累增加，这种增加机制与蛋白酶抑制无关，而是通过改善翻译和稳定其三级结构来防止蛋白水解和/或聚合[43]。

在本研究中，我们评估了在硅藻中过表达一种新的内源性P. tricornutum半胱氨酸蛋白酶抑制剂（PtCYS）以抑制半胱氨酸蛋白酶并提高异源蛋白的稳定性和积累量的效果。我们从硅藻的蛋白质组学和转录组学数据库中鉴定出PtCYS候选基因，并在体外验证了其积累和活性。黄色荧光蛋白（YFP）被用作蛋白质稳定性的标志物，并与未成熟形式（缺乏分泌信号肽）和成熟形式（含有分泌信号肽）的PtCYS共表达。与未成熟形式的PtCYS共表达后，P. tricornutum细胞中的YFP荧光显著增强，证明了PtCYS作为辅助蛋白酶抑制剂在提高重组蛋白生产中的有效性。这些发现还揭示了半胱氨酸蛋白酶在硅藻中的功能作用，并为代谢工程和分子农业开辟了新的途径。

**2. 材料与方法**
2.1. 半胱氨酸蛋白酶的计算机分析和分子系统发育树
从最新的基因组注释数据中选取了Phatr3_EG01374.p1氨基酸序列[44]。使用UniProt数据库进行Blastp比对，确认Phatr3_EG01374含有半胱氨酸蛋白酶结构域。利用来自23种植物、3种绿藻、2种蓝细菌、1种硅藻和海洋微藻的半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列构建了系统发育树（表S1）。这些序列是通过Blastp搜索（BLAST+版本2.14 [45]）选出的，最大E值阈值为1×10^-5，查询序列为番茄（Solanum lycopersicum）的部分多半胱氨酸蛋白酶序列（AAF23128 [46]）。使用R包msa 1.34.0和默认参数，通过Clustal Omega对半胱氨酸蛋白酶结构域进行比对。随后使用Blosum62模型（phangorn 2.12.1）计算距离，并采用Neighbor Joining方法（ape 5.8–1）构建系统发育树，重复1000次。最终使用MEGA 12 [47]得到共识树。信号肽的预测使用SignalP网站版本6.0的默认设置完成[48]。氨基酸序列通过InterProScan [49]进行分析，蛋白质靶标序列的预测使用PHOBIUS版本5.6和默认参数[50]。

2.2. 半胱氨酸蛋白酶的建模和半胱氨酸蛋白酶对接模拟
使用AlphaFold3 [51]预测了P. tricornutum半胱氨酸蛋白酶（Phatr3_EG01374.p1，简称PtCYS）的蛋白质结构，并使用PyMOL版本2.6.0的默认参数，以Colocasia esculenta的tarocystatin（CeCys，来自晶体结构3IMA [52]）作为模板进行比对。使用PtCYS和预测的P. tricornutum肽酶（一种含有C1A木瓜蛋白酶C端结构域的蛋白质Phatr3_J4936.t1）作为目标蛋白酶，通过AlphaFold3进行酶-抑制剂相互作用模拟。预测的折叠结构和氢键通过PyMOL进行分析和显示。

2.3. 质粒构建
所有质粒构建均使用NEBuilder? HiFi DNA Assembly Bundle（New England Biolabs，加拿大）完成。用于组装的片段通过PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio，日本）按照制造商的协议进行扩增。Sh ble外源体携带Sh ble抗性基因，该基因受fucoxanthin叶绿素结合蛋白C（fcpC）启动子调控[7]。YFP外源体是通过从Awwad等人的PtOA3载体中去除TKS-OAC CDS并组装骨架得到的。PtCYS与YFP共表达的外源体（SPPtCYS-YFP、PtCYS-YFP和SP-YFP）是通过克隆实现的：分别克隆完整的半胱氨酸蛋白酶编码序列（不含5′端的66 bp序列）和成熟的半胱氨酸蛋白酶分泌信号肽（SP），并将其与YFP基因通过(GGGGS)3肽接头连接。含有PtCYS版本和YFP的外源体（SPPtCYS_YFP和PtCYS_YFP）通过克隆EF2启动子（来自TKK031质粒[53]）下游的编码序列，并在C端添加3xHemagglutinin（3xHA）标签后构建。SPPtCYS_nat外源体是通过将SPPtCYS表达盒（EF2prom::SPPtCys:3xHA::FcpA）克隆到N-乙酰转移酶（nat）外源体中得到的，该外源体具有抗诺瑟霉素（Nourseothricin）的抗性[14]。本研究中使用的所有DNA和引物序列分别列于表S2和S3中。

2.4. 微生物菌株、生长条件和转化
大肠杆菌（NEB? 10-beta，New England Biolabs，加拿大）在添加了适当抗生素（氯霉素，30 mg/L）的Luria-Bertani培养基（LB）中培养。质粒使用Biobasic EZ10 miniprep kit（NY，美国）提取，并由CCIB DNA Core（美国麻省总医院）测序以确认其正确性，然后扩增到Epi 300菌株中，以便与硅藻结合，如前所述[54]。简要来说，将1 mL野生型P. tricornum接种到0.5 X L1, 1%（w/v）琼脂平板上，在18°C下光照/黑暗循环条件下培养4天。转化前，向每个琼脂平板加入1 mL L1培养基，用移液管刮取细胞并收集到无菌管中。调整细胞浓度至5.0×10^8细胞/mL。将含有组装质粒的大肠杆菌培养物（25 mL）在37°C下培养至OD600为0.8，然后以3000 xg离心10分钟，再悬浮在250 μL SOC培养基中。通过将200 μL P. tricornum加入到200 μL大肠杆菌细胞中开始结合过程。将细胞混合物接种到0.5 X L1, 5%（w/v）琼脂平板上，在黑暗条件下培养90分钟，随后转移到18°C下继续培养2天。恢复期后，向平板中加入1 mL L1培养基以收集细胞。将细胞接种到0.5 X L1, 1%（w/v）琼脂平板上，添加Zeocin 50 mg/L或Zeocin加Nourseothricin 200 mg/L进行筛选，并在18°C下培养。2周后可见转化菌落。YFP强度测量
随机选择了72个P. tricornutum克隆，每个PtCYS外泌体包含一个克隆，并将其接种在添加了50 mg/L Zeocin的新选择性培养基上。10天后，每个菌株的31个菌落被转移到含有200 μL L1液体和Zeocin的96孔板中，每6天重新转移一次。经过五轮转移后，这些克隆（n=31）在配备有紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄绿色（561 nm）和红色（638 nm）激光的CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman-Coulter）中进行分析。取75 μL的4天培养物进行过滤，然后转移到每个孔含有200 μL L1的透明96孔板中。叶绿素自荧光在PerCP通道（690/50 nm）上检测，而YFP荧光在FITC通道（525/40 nm）上检测。记录了10,000个细胞的YFP荧光细胞百分比和平均荧光强度（MFI），这些数据来自三次生物学重复实验。图像和统计分析使用BD FlowJo软件（版本10，BD Biosciences，美国加州拉霍亚）进行。Sh ble菌株被用作阴性对照。

2.6. 共聚焦显微镜
根据Awwad等人的方法[6]，使用Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems）和40×/1.30油浸物镜捕获了每个菌株的三个独立系的活细胞图像，并可视化了蛋白质定位。YFP的激发波长为488 nm，荧光信号的发射范围为500至525 nm。叶绿素自荧光在552 nm的激发波长下观察，荧光信号的发射范围为630至670 nm。使用Leica Las X生成组合图像，并通过Fiji软件进行分析。Sh ble菌株被用作阴性对照。

2.7. PtCYS:3xHA检测
将25 mL的SPPtCYS_YFP克隆（10、40和64）、YFP克隆（4）以及Sh ble菌株在含有50 mg/L Zeocin的L1培养基中培养6天，然后在4°C下以3500 xg离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在含有10%（v/v）甘醇的50 mM Tris-HCl中，并使用FisherbrandTM Model 505 Sonic Dismembrator（Thermo Fisher Scientific）以35%的振幅进行6次超声处理，每次处理30秒，间隔30秒，总共处理6分钟。蛋白质提取物在4°C下以20,000 xg离心30分钟。含有总可溶性蛋白质部分的上清液保存在4°C下，用于Western blot和cystatin活性测定。使用RC DC? Protein Assay Kit I（Bio-Rad，加拿大）对蛋白质进行定量。为了检测PtCYS:3xHA，加载25 μg的总蛋白质，并通过15%（w/v）SDS-PAGE进行分离。然后使用Trans-Blot? Turbo? Transfer System 1,704,150将蛋白质转移到0.2 μm PVDF膜上，设置条件为1.3 mA恒定电流和15 V电压，持续20分钟。所得到的印迹在5%（w/v）牛奶中封闭，并在4°C下与ThermoFisher Scientific（美国伊利诺伊州，商品编号#MA1-21316）的抗血凝素（α-HA）1:1000稀释液中共孵育过夜。用含有0.1%（v/v）Tween 20（TBST）的Tris缓冲盐水洗涤三次后，将印迹在Bio-Rad（加拿大安大略省，商品编号#1705047）的Immun-Star Goat Anti-Mouse（GAM）-HRP结合物1:20,000稀释液中孵育1小时。再次用TBST溶液洗涤膜三次。使用Clarity Max Western ECL Substrate-Luminol溶液（Bio-Rad，加拿大）进行蛋白质检测，并通过ChemiDoc Imaging System和Image Lab?软件（Bio-Rad，美国）可视化化学发光和Ponceau S染色（5% v/v冰醋酸，0.1% m/v Ponceau Red染料）。

2.8. P. tricornutum蛋白酶测定
cystatin酶活性测定根据Tremblay等人的方法[55]进行。简要来说，将7 μg的总蛋白质与10 mM l-cysteine和14 μM的合成肽底物Z-Phe-Arg-methylcoumarin混合在50 mM Tris-HCl（pH 7）中，最终体积为100 μL。使用BioTek Synergy H1荧光计（Agilent Technologies，加拿大）在25°C下监测底物水解10分钟，激发和发射滤光片分别为360 nm和450 nm。

2.9. YFP荧光恢复
为了检查cystatin的过表达是否可以恢复YFP强度，选择了六个YFP单独克隆（1、11、32、36、41、68），这些克隆的YFP强度较低。首先通过菌落PCR确认YFP盒的存在[6]，使用10 μL煮沸的P. tricornutum培养物作为模板，Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，加拿大）和引物FcpCt PCR F和pPtGE30 bb R（见补充表3）。热循环条件如下：初始变性95°C 30秒，然后是35个循环，每个循环包括95°C变性30秒、51°C退火30秒、68°C延伸1分45秒，最后在68°C下延伸5分钟。三个独立的阳性菌落克隆：YFP-alone 1、32和36，使用SPPtCYS_nat或nat外泌体进行转化，如2.4节所述。转化后，每个菌株的36个克隆（YFP_1_SPPtCYS_nat、YFP_32_SPPtCYS_nat、YFP_36_SPPtCYS_nat、YFP_1_nat、YFP_32_nat和YFP_36_nat）被随机选择并接种在添加了50 mg/L Zeocin和200 mg/L Nourseothricin的选择性培养基上。10天后，每个菌株的31个菌落被转移到含有200 μL L1液体和Zeocin及Nourseothricin的96孔板中，每6天重新转移一次。经过五轮转移后，如前所述，在流式细胞仪中分析了三次生物学重复实验的4天培养物（n=31，每个菌株）。Sh ble_nat菌株被用作阴性对照。

2.10. DNA提取和拷贝数定量
为了比较YFP36_SPPtCYS_nat（克隆2、5、7、10、26）、YFP36_nat（克隆1、8、9、15、20）和sh ble_nat菌株之间的YFP质粒拷贝数，根据[56]的方法提取DNA。简要来说，将15 mL的4天藻类培养物在17,000 xg下离心1分钟。细胞沉淀物在200 μL提取缓冲液（2% [w/v] cetyltrimethylammonium bromide（CTAB）、100 mM Tris-HCl、pH 8.0、20 mM EDTA、1.4 M NaCl中溶解，其中含有2%（v/v）新鲜添加的β-mercaptoethanol，通过涡旋混合，然后加入200 μL氯仿/异戊醇（24:1）并在65°C下振荡1200 xg孵育20分钟。在17,000 xg下离心10分钟后，将水相中的DNA转移到新的微量离心管中。通过加入0.7体积的异丙醇使DNA沉淀，并在室温下孵育10分钟，然后在17,000 xg下离心10分钟。用1 mL 70%（v/v）乙醇洗涤沉淀物，将空气干燥的沉淀物重新悬浮在含有1 μL RNase A（10 mg/mL）的无DNase水中，并在37°C下孵育15分钟。使用Nanophotometer（IMPLEN）通过qPCR测量YFP基因的相对拷贝数。根据制造商的协议，使用Luna Universal Master Mix（New England Biolabs，加拿大）进行YFP基因的拷贝数测定。扩增YFP和参考基因（Tubulin α和Elongation factor 1 α）的引物来自Augustine等人[57]，而检测Sh ble的寡核苷酸来自Diaz-Garza等人[22]。使用YFP载体来确定拷贝数。使用5到1000 pg的载体稀释液进行标准曲线测定。根据Integrated DNA Technologies的计算公式（YFP载体（ng）* 6,022,1023）/ (YFP（MW）* 1109）估计质粒拷贝数。根据标准曲线方程y = a*log(x) + b，使用Luna Universal Master Mix从100 ng的DNA中确定每个菌株的YFP基因拷贝数（图S2）。每个样本的拷贝数然后使用公式10((Ctsample?b)/a)确定，如Beauchemin等人[58]所述，并根据DNA重量（ng）进行归一化。所有用于qPCR的引物列在补充表3中。

3. 结果和讨论
3.1. PtCYS，一种来自P. tricornutum的cystatin候选物，表现出植物cystatin的核心结构特征
为了选择和鉴定P. tricornutum的cystatin以用于进一步实验，提取了两个被称为“cystatin domain”的序列（Phatr3_EG00714和Phatr3_EG01374），这些序列来自最新的基因组注释[44]。只有Phatr3_EG01374序列通过针对UniProt数据库的blastp分析得到验证，并与一个被注释为cystatin/cystatin inhibitor的UniProt条目有显著匹配。第二个蛋白质Phatr3_EG00714没有blastp匹配，因此被排除在进一步分析之外。此外，使用来自Solanum lycopersicum的部分多cystatin cystatin序列（AAF23128；[46]）作为查询，针对Ensembl档案（protists.ensembl.org；[44]）中的Phatr3注释数据库，以检测任何先前未注释的含有cystatin domain的序列；然而，没有发现额外的序列。

构建了一个系统发育树，包括Phatr3_EG01374和23种植物物种的cystatin domain序列、两个来自蓝细菌的假想cystatin、一个来自绿藻Trebouxia sp. A1-2的cystatin序列以及一个来自海洋微藻Emiliania huxleyi的cystatin序列（补充数据/表1）。系统发育分析表明，cystatin分为三个主要簇，PtCYS包含两个亚组。候选物与Hibiscus syriacus的cystatin domain-like蛋白（HsCYS-like）的序列相似度为85%，序列同一性为34.78%，与绿藻Trebouxia sp. A1-2的cystatin domain（TaCYS）的序列同一性为31.58%（图1A）。此外，PtCYS与陆地蓝细菌Crinalium epipsammum（CeCYS）的序列也有较高相似性，序列覆盖率为69%，同一性为28%。在同一支系中的两个绿藻物种Raphidocelis subcapitata（RsCYS）和Klebsormidium nitens（KnCYS）的序列同一性分别为26.60%和34.78%，序列覆盖率分别为87%和39%（图1A）。总体而言，PtCYS主要与微藻和蓝细菌的cystatin序列聚类，而不是与高等植物的cystatin聚类，HsCYS-like和黄瓜cystatin序列（Cucumis sativus；CsCYS）的相似性较低（19.57%）。假想的序列编码了一个包含22个氨基酸的分泌信号肽的163个氨基酸蛋白，类似于几个cystatin家族成员[59]（图1B，上图）。完整（未成熟）序列的分子量为18.8 kDa，而缺乏分泌信号肽的成熟版本的分子量为11.7 kDa。这些大小与已报道的植物cystatin的分子量一致，因为大多数植物cystatin的分子量在7.8–16 kDa范围内[56]，[60]，少数由于C末端延伸而具有大约23 kDa的分子量，这有助于抑制legumain-like蛋白酶活性[61]、[62]。

编码的蛋白质显示了植物cystatin家族成员的特征结构基序（图1B），包括N末端区域的保守Gly-Gly基序（或N-trunk）、类似于植物cystatin的保守α-helix的Ser-Ala-Ala-Phe-Ala-Val-Ser-Lys-Leu-Ser-Glu氨基酸序列、中央区域的Gln-X-Val-X-Gly基序用于蛋白酶抑制，以及位于135位的色氨酸残基，与第二个C末端抑制环的保守Pro-（或X）-Trp基序相匹配（图1B）[63]。此外，PtCYS在保守的α-helix和Gln-X-Val-X-Gly基序之间有一个扩展序列，这在其他cystatin中不常见。结构上，PtCYS包括四个典型的反平行β链，围绕植物cystatin的中央α-helix[63]。还观察到了与Cys蛋白酶相互作用的N末端主干和两个抑制环（图1C）。计算机结构预测表明，PtCYS包含独特的二级结构元素，包括两个额外的α-helix：一个位于保守的XX-Ala-X-Phe-Ala-Val基序附近，另一个位于C末端区域。当与tarocystatin CeCYS叠加时，保守区域紧密对齐，而结构差异，特别是在C末端区域，变得明显。这些观察表明，虽然PtCYS保留了植物cystatin的核心结构特征，但它也表现出独特的区域，特别是在其C末端环中，这可能影响其对Cys蛋白酶的抑制活性。基于氨基酸序列的系统发育树构建了PtCYS（Phatr3_EG01374.p1）以及23种植物（At，拟南芥；Cp，紫羊茅；Cs，黄瓜；Eg，油棕；Gm，大豆；Gs，大豆；Ha，向日葵；Hs，木槿；Jc，麻风树；Ks，西伯利亚诺林吉亚；Lj，日本莲；Ms，紫花苜蓿；Ps，西特卡松；Pp，地钱；Si，芝麻；Sl，番茄；Sp，佩内利番茄；St，马铃薯；Th，塔伦亚哈斯勒里亚纳；Tc，可可；Wn，高贵沃尔梅亚；Zm，玉米）的序列。此外，还包含了来自蓝细菌的两个假定的cystatin结构域（Ce，Crinalium epipsammum和Ma，微囊藻）和一个来自硅藻Pseudo-nitzschia multistriata的cystatin序列，以及三个来自绿藻（Kn，Klebsormidium nitens；Rs，Raphidocelis subcapitata和Ta，Trebouxia sp. A1-2）的序列，还有一个来自海洋微藻Emiliania huxleyi的序列。使用邻接法推断的进化历史在MEGA 12中进行了分析。PtCYS序列（加粗显示）与H. syriacus的cystatin结构域（HsCYS-like）、C. sativus（CsCYS）、三种绿藻（T. sp. A1-2（TaCYS）、R. subcapitata（RsCYS）和K. nitens（KnCYS）以及陆地蓝细菌C. epipsammum（CeCYS）聚类在一起。该树是通过邻接法构建的，进行了1000次自助法迭代。仅显示自助法结果大于或等于50%的。B. PtCYS蛋白的一级结构表示，其中N端22个氨基酸长的分泌信号肽（SP）和成熟的cystatin结构域（位置37–115）被突出显示（图的上部）。蛋白质中保守基序的氨基酸残基也被突出显示，包括N端区域的Gly-Gly（GG）基序和第一个抑制环的Gln-X-Val-X-Gly（QxVxG）基序（图的下部）。橙色背景表示脂肪族氨基酸，绿色和红色背景分别表示酰胺和酸性氨基酸。C. PtCYS（PtCYS，EG01374）的卡通表示（金色）与野生芋头Colocasia esculenta、cystatin CeCYS（青绿色；PDB 3IMA：[52]）叠加。N端的Gly-Gly基序显示为粉色，第一个抑制环（Gln-X-Val-X-Gly）显示为红色，第二个抑制环显示为蓝色。D. P. tricornutum papain样蛋白酶候选物（PtPap，J4936.t1）的预测折叠卡通表示，活性位点残基显示为黄色，催化残基Gln22、Cys31、His202、Asn224和Trp226显示为橙色棒状。E. PtCYS（金色卡通表示）与PtPap（灰色表面，黄色活性位点）的预测折叠和相互作用（左图），以及3IMA CeCYS（青绿色带状）与木瓜蛋白酶（PDB：3IMA，灰色表面）的晶体结构相互作用（右图）。P. tricornutum候选物的结构和相互作用是用Alphafold3建模和对接的。N端环中的Gly-Gly基序显示为粉色，携带Gln-X-Val-X-Gly基序的发夹环显示为红色，C端发夹环显示为蓝色。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）3.2. 为了进一步验证PtCYS作为cystatin候选物的潜在功能，我们研究了其与类似papain的Cys蛋白酶的相互作用，这是通过计算机模拟预测的。类似papain的蛋白酶是cystatin的主要靶标[64]。从P. tricornutum的转录组数据中，使用EnsemblProtist数据库[51]鉴定出十个预测的类似papain的Cys蛋白酶候选物（表S4）。第一个候选物被选中进行进一步分析，并使用AlphaFold3进行建模。得到的结构与已知的papain结构高度相似[29]，具有两个大小相似的裂片，由贯穿整个蛋白质宽度的活性位点裂隙分隔（图1D）。这个裂隙包含典型的papain催化残基，即Gln22、Cys31、His202、Asn224和Trp226，Cys25和His159形成催化二聚体，而支持残基Gln19、Asn175和Trp177维持对蛋白水解活性至关重要的亲核特性[29]。PtCYS与预测的类似papain的蛋白酶之间的相互作用使用AlphaFold3进行了建模[65]（图1E，左图），并与结晶的tarocystatin（CeCYS）-papain复合物（PDB 3IMA）的结构进行了比较（图1E，右图）。在参考晶体结构中，tarocystatin与papain紧密结合，形成一个由两个插入活性位点的环和与酶表面氨基酸残基相互作用的N端主干组成的三部分楔形结构（图1E）[66]。对接分析显示PtCYS与类似papain的蛋白酶候选物的结合方式相似，其中PtCYS的N端主干和两个发夹环与目标酶的活性位点裂隙相互作用。推断的相互作用涉及类似papain的蛋白酶中的关键残基，包括Asn21-His23、Tyr27-Trp32、Gly69、Ala70-His78、Glu108、Thr177-Tyr186、Thr200-Ile203、Asn224、Trp226-Gln231和Glu260。这些残基包括催化活性位点残基（Gln22、Cys31、His202、Asn224和Trp226），表明存在保守的相互作用。这种对接分析强烈表明PtCYS能够有效地与类似papain的蛋白酶相互作用，进一步证实了它与其他cystatin的相似性，并暗示了其通过类似机制抑制Cys蛋白酶的潜力。3.3. PtCYS的亚细胞定位及其对YFP积累的影响基于上述计算机模拟分析，该分析表明PtCYS是Cys蛋白酶抑制的合理候选物，我们旨在实验评估过表达这种抑制蛋白对异源蛋白积累的影响。使用40SRP8启动子控制的YFP作为报告蛋白，假设YFP荧光强度反映了蛋白积累情况。将没有信号肽的成熟PtCYS版本和PtCYS信号肽（SP）分别融合到YFP的N端，生成了SPPtCYS-YFP、PtCYS-YFP和SP-YFP菌株（图2A）。为了评估PtCYS的亚细胞定位，使用共聚焦显微镜观察了染色体外表达系，以获取YFP荧光（黄色）和叶绿素自荧光（蓝色显示）（图2B）。产生可溶性YFP的YFP菌株作为阳性对照，而含有Zeocin抗性基因的sh ble菌株用于设置读数参数并最小化细胞自荧光。在第4天，YFP对照菌株中的YFP荧光在整个细胞质中可见。同时，SP-YFP和SPPtCYS-YFP定位于两个质体裂片之间的类团块结构中，靠近叶绿体区室，可能由较小的网状结构组成，这种荧光模式在P. tricornutum中已被报道为转运到分泌途径的蛋白质[8]、[67]、[68]、[69]、[70]。可溶性版本的酶PtCYS-YFP表现为细胞质蛋白，尽管其荧光模式比单独的YFP更为分散。在转染了非融合GFP质粒的哺乳动物细胞中也观察到了类似的现象，Western blot显示GFP蛋白的量比GFP与HIV-1包膜蛋白融合的量更多[71]。这种差异可能是由于蛋白质错误折叠、稳定性降低或与融合蛋白相关的细胞毒性所致。总体而言，PtCYS的信号肽将YFP转运到类团块结构中。这一发现表明PtCYS的SP导致YFP进入分泌途径（42），而全长cystatin融合蛋白SPPtCYS-YFP则在内质网和细胞质中都积累了YFP。这种定位模式表明PtCYS可以转运到分泌途径，尽管在测试条件下这种转运可能是部分的或效率较低的。为了测试PtCYS是否有助于增加YFP的产量或积累，通过流式细胞术分析了每个构建的三十一个独立克隆，测量了YFP+细胞的百分比（图2C）和平均荧光强度（MFI），后者相对于每个细胞中积累的荧光YFP量（图2D）。这些结果与表达单独YFP的对照构建（YFP）进行了比较，并从每个构建中减去了对照菌株Sh ble的背景荧光（?MFI）。下载：下载高分辨率图像（294KB）下载：下载全尺寸图像图2. P. tricornutum PtCYS过表达菌株。A. 表达不同版本的PtCYS序列的重组盒示意图，这些序列在N端融合：SP-YFP、SPPtCYS-YFP和PtCYS-YFP，由40SRPS8启动子驱动，并携带Zeocin抗性的Sh ble基因，由fucoxanthin叶绿素结合蛋白C（fcpC）启动子驱动。该图使用BioRender.com [72]创建。B. SPPtCYS-YFP、SP-YFP和PtCYS-YFP的亚细胞定位。通过共聚焦激光显微镜观察产生SPPtCYS-YFP、SP-YFP、PtCYS-YFP和可溶性YFP的转基因系的YFP荧光、叶绿素自荧光以及三个场的合并情况。使用Sh ble对照菌株设置参数以避免细胞自荧光。比例尺=10 μm。C. 监测了每个构建的31个独立系的YFP阳性细胞百分比的箱形图，所有YFP阳性培养物均以Sh ble自荧光菌株进行了归一化。SPPtCYS或PtCYS与YFP的融合并未增加YFP细胞的百分比。D. 减去Sh ble菌株背景荧光后的YFP平均荧光强度（MFI）的箱形图（?MFI）。SP PtCYS或PtCYS与YFP的融合并未增加细胞中的YFP ?MFI。使用单因素ANOVA和Tukey检验进行了统计比较。相同的字母表示样本之间没有统计学差异（p值< 0.01）。有趣的是，当YFP与PtCYS信号肽（SP-YFP）或未成熟的前体蛋白（SPPtCYS-YFP）融合时，YFP+细胞的百分比显著下降，分别为7.3±5.6%和4.7±2.9%，而单独的YFP为28.7±12.4%（p<0.01）。SP-YFP细胞群的?MFI达到369.9±316.3，SPPtCYS-YFP细胞群的?MFI为648.7±338.5，约为YFP单独的?MFI的4.7倍和2.7倍（图2C和D）。SP-YFP和SPPtCYS-YFP之间的YFP+细胞百分比没有显著差异。这些结果可能表明信号肽在YFP通过细胞分泌途径的过程中使其不稳定。这已在GFP和其他荧光蛋白[43]、[73]中报道过。尽管荧光强度与荧光蛋白积累之间存在相关性，但YFP荧光水平可能受到除表达之外的其他因素的影响，例如在翻译融合构建中可能触发的影响[48]。将成熟的PtCYS融合到YFP的N端（PtCYS-YFP）显著增加了YFP荧光（21.4±13.4%；?MFI=1748±736），与SP-YFP和未成熟的SPPtCYS-YFP相比（p<0.01；图2C和D），进一步证实了SP可能导致YFP在细胞内的表达减少。然而，YFP的总体积累（?MFI）仍然显著低于单独的YFP（p<0.01），这与共聚焦图像的观察结果一致（图2B）。这些结果与研究表明，当荧光蛋白单独表达时比与目标蛋白融合时积累量更高[71]、[74]一致。同样，当Vanillia planifolia香兰素合成酶（VpVAN）与eGFP标记并在不同的P. tricornutum细胞区室中异源表达时，未检测到VpVAN重组蛋白，尽管检测到了荧光，证实了其亚细胞定位。这表明融合蛋白的产生量低于检测水平[75]。总体而言，这些发现表明将PtCYS融合到YFP并未增强P. tricornutum细胞中异源蛋白的积累，与使用植物cystatin（如番茄cystatin SlCYS8作为融合伴侣在N. benthamiana的农杆菌浸润叶片中促进α1ACT产量时的结果相反[43]。正如之前在P. tricornutum[2]、[8]中观察到的，YFP N端的SP的存在对转染细胞的荧光水平产生了负面影响，可能是由于报告蛋白在细胞分泌途径中的稳定性或折叠不足。类似地，之前的研究在硅藻中也发现异源蛋白的细胞分泌与低蛋白产量[2]、[67]和蛋白降解[8]相关，而与细胞内积累相比。YFP单独构建观察到的更高荧光表明，将PtCYS融合到YFP会损害其荧光。基于这些发现，在第二组实验中，我们分别表达了PtCYS和YFP，以减轻SP的影响，并使重组cystatin能够作用于更稳定的YFP蛋白，从而可能增强荧光。PtCYS的完整和截短编码序列在C端标记了三个血凝素（3xHA），由延长因子2（EF2）启动子控制，而yfp表达由40SRPS8启动子序列驱动（图3A）。两种构建体SPPtCYS_YFP（包含SP序列）和PtCYS_YFP（不含SP）以及单独的YFP构建体作为阳性对照进行了测试。在这种设置中，三种条件下的YFP+细胞百分比没有显著差异（YFP对照群体为30±3.7%，SPPtCYS_YFP为35±2.9%，PtCYS_YFP为25±4.1%）（图3B）。另一方面，与YFP群体相比，SPPtCYS_YFP群体中的YFP ΔMFI显著增加（ΔMFI = 2500±289.8 vs 4000±377.3，p<0.01），这支持了直接融合到YFP可能会损害其荧光或积累的假设，并且通过分泌途径输送的PtCYS可以稳定细胞质中保留的YFP（图3C）。结果表明，PtCYS可以在P. tricornutum中增强YFP的积累，但只有在独立表达并且存在其SP时才会如此。这与番茄cystatin SlCYS8的情况相反，后者作为翻译融合伙伴可以增加异源蛋白的积累，但单独在细胞质中共表达时则不能 [43]。然而，先前的研究也强调了连接序列和长度对cystatin活性的重要性，表明未来的研究可以帮助改进将这些PtCYS元素作为表达蛋白的融合伙伴的效果。最后，PtCYS的序列和结构特征可以在一定程度上解释与高等植物cystatin相比观察到的差异，特别是在抑制范围和效率方面。例如，N端和C端的轻微变化可能会影响抑制活性、效率和针对Cys蛋白酶的特异性 [55]、[76]、[77]。实际上，对C端延伸部分的定点突变表明Asn在抑制legumain样Cys蛋白酶中是必需的 [61]。需要进一步的研究来阐明这一重要结构元素在PtCYS针对目标Cys蛋白酶的作用机制中的作用。

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图3. YFP与SPPtCYS的共表达增加了YFP的平均荧光强度（MFI），而PtCYS是一种活性Cys蛋白酶抑制剂。A. 重组蛋白盒的示意图，设计用于在40SRPS8启动子下表达YFP，以及两种版本的PtCYS，在延长因子α2（EF2）下表达，并在C端标记了三个血凝素序列（3xHA）。PtCYS构建体要么包含SPPtCYS:3xHA序列（带有天然信号肽），要么包含PtCYS:3xHA序列（不带信号肽）。所有构建体都携带由fucoxanthin叶绿素结合蛋白C（fcpC）启动子驱动的Sh ble基因，该基因赋予Zeocin抗性。该图使用BioRender.com创建 [72]。B. 对每种构建体的31个独立系中监测到的YFP阳性细胞百分比的箱形图。所有YFP阳性培养物均以Sh ble自荧光菌株为基准进行标准化。C. 在从Sh ble菌株中减去背景荧光后，YFP的平均荧光强度（ΔMFI）的箱形图。实验重复了三次，每个基因构建体有31个独立系。不同的字母表示菌株之间的统计差异，p<0.01（Post-ANOVA Tukey检验）。D. 三个选定的CYS_YFP菌株显示出较高的YFP ΔMFI值。E. 通过Western blotting检测到的SPPtCYS:3xHA（23 kDa）蛋白（上图）使用抗血凝素（α-HA）和/或用Red Ponceau（RP）染色（下图）。F. 与单独表达YFP的菌株相比，三种菌株显示出更高的Cys蛋白酶抑制活性。数据以Sh ble菌株为基准进行标准化。呈现的数据是三个生物学重复实验的平均值±标准差。不同的字母（a, b, c）表示菌株之间的统计差异，p<0.01（post-ANOVA Tukey检验）。

为了确定在硅藻细胞中过表达PtCYS是否可以在体内赋予Cys蛋白酶抑制活性，选择了三个独立SPPtCYS_YFP菌株的4天龄培养物（图3D），这些菌株显示出较高的YFP ΔMFI，并将其与表达YFP的菌株进行了比较。通过免疫印迹确认了所有SPPtCYS_YFP菌株中存在PtCYS:3xHA（23 kDa）（图3E）。测试了这三个SPPtCYS_YFP菌株的蛋白提取物对P. tricornutum内源性Cys蛋白酶在Z-Phe-Arg-甲基香豆素水解过程中的抑制作用。结果，所有三个克隆都显示出更高的Cys蛋白酶抑制活性；分别为50.2%、82.1%和75.1%，与单独表达YFP的菌株（10.4%）相比（p<0.01）（图3F）。这些观察结果共同证实了在P. tricornutum蛋白质组数据库中被鉴定为候选cystatin的PtCYS确实是一种功能性cystatin。尽管需要使用纯化蛋白进行进一步分析以确定动力学参数，但这些结果证实了这种cystatin作为重组蛋白积累的有效辅助抑制剂的潜力，这与在表达PtCYS的菌株中观察到的更高Cys蛋白酶抑制活性一致。

3.4. PtCYS过表达在YFP+细胞百分比低的菌株中恢复YFP荧光
为了测试PtCYS过表达是否可以恢复表现出低YFP水平的转接子中的YFP产生，选择了三个独立的YFP克隆（YFP_1、YFP_32和YFP_36，YFP+细胞百分比分别为0.19%、3.56%和0.13%），这些克隆具有完整的YFP表达盒（40SRPS8prom::YFP::FcpAter，图S1）。这三个克隆通过与第二种质粒共轭进行了新的转化，该质粒携带赋予Nourseothricin抗性的SPPtCYS:3xHA和nat基因（图4A，上图），或者使用空载体（nat，图4A，下图）。然后，对每种E. coli共轭物的31个独立克隆（YFP_1_nat、YFP_1_SPPtCYS_nat、YFP_32_nat、YFP_32_SP-PtCYS_nat、YFP_36_nat和YFP_36_SP-PtCYS_nat）进行了流式细胞术分析，以测量YFP+细胞的百分比和ΔMFI（图4B和C）。使用Sh ble_nat菌株作为阴性对照以减去自荧光。尽管来自YFP_1_SPPtCYS_nat和YFP_32_SPPtCYS_nat的克隆显示出比其对照（YFP_1_nat和YFP_32_nat）略高的YFP+细胞百分比，但观察到的差异并不显著（图5B，p>0.01）。相比之下，来自YFP_36_SPPtCYS_nat的31个克隆显示出比不表达cystatin的31个YFP_36_nat克隆显著更高的YFP+细胞百分比（约4倍增加，平均值分别为9±3% vs 2±3%，p<0.0001）。YFP_36_SPPtCYS_nat中的YFP积累量也显著增加（约2倍增加，MFI分别为670±170 vs 370±248，p<0.0001），遵循相同的模式（图4C）。在这些转接子中，结果高度可重复，因为在31个克隆中有30个在PtCYS:3xHA过表达后，在细胞（MFI）和群体（%）水平上增加了YFP的丰度。

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图4. 通过引入在C端标记有三个血凝素序列的SPPtCYS:3xHA，在YFP荧光较低的细胞中恢复YFP荧光。A. 表达YFP的重组盒的示意图，以及将SPPtCYS:3xHA引入第二个携带Nourseothricin抗性的nat基因的episome中，该基因由fucoxanthin叶绿素结合蛋白C（fcpC）启动子驱动（SPPtCYS_nat，上图）或空载体（nat，下图）。该图使用BioRender.com创建 [45]。B. 转化有nat（灰色）或SPPtCYS_nat（白色）episome的YFP阳性细胞百分比的箱形图。所有培养物（n=31）均以Sh ble_nat自荧光菌株为基准进行标准化。C. YFP的平均荧光强度（ΔMFI）的箱形图。D. 转接子中的YFP拷贝数。选择了五个YFP36_SPPtCYS_nat克隆（YFP+细胞百分比高）和五个YFP36_nat克隆（YFP+细胞百分比低）（灰色框）来检查YFP基因拷贝数（黑色圆圈），并归一化到总DNA。****表示nat和CYS_nat克隆之间的显著差异（p值<0.01，双因素ANOVA后进行Tukey检验）。

为了确定在硅藻细胞中过表达PtCYS是否可以在体内赋予Cys蛋白酶抑制活性，选择了三个独立SPPtCYS_YFP菌株的4天龄培养物（图3D），这些菌株显示出较高的YFP ΔMFI，并将其与表达YFP的菌株进行了比较。通过免疫印迹确认了所有SPPtCYS_YFP菌株中存在PtCYS:3xHA（23 kDa）（图3E）。测试了这三个SPPtCYS_YFP菌株的蛋白提取物对P. tricornutum内源性Cys蛋白酶在Z-Phe-Arg-甲基香豆素水解过程中的抑制作用。结果，所有三个克隆都显示出更高的Cys蛋白酶抑制活性；分别为50.2%、82.1%和75.1%，与单独表达YFP的菌株（10.4%）相比（p<0.01）（图3F）。这些观察结果共同证实了在P. tricornutum蛋白质组数据库中被鉴定为候选cystatin的PtCYS确实是一种功能性cystatin。尽管需要使用纯化蛋白进行进一步分析以确定动力学参数，但这些结果证实了这种cystatin作为有效辅助抑制剂以增强该生物体中重组蛋白积累的潜力，这与在表达PtCYS的菌株中观察到的更高Cys蛋白酶抑制活性一致。

3.4. PtCYS过表达在YFP+细胞百分比低的菌株中恢复YFP荧光
为了测试PtCYS过表达是否可以恢复表现出低YFP水平的转接子中的YFP产生，选择了三个独立的YFP克隆（YFP_1、YFP_32和YFP_36，YFP+细胞百分比分别为0.19%、3.56%和0.13%），并且具有完整的YFP表达盒（40SRPS8prom::YFP::FcpAter，图S1）。这三个克隆通过与第二种质粒共轭进行了新的转化，该质粒携带SPPtCYS:3xHA和赋予Nourseothricin抗性的nat基因（图4A，上图），或者使用空载体（nat，图4A，下图）。然后，对每种E. coli共轭物的31个独立克隆（YFP_1_nat、YFP_1_SPPtCYS_nat、YFP_32_nat、YFP_32_SP-PtCYS_nat、YFP_36_nat和YFP_36_SP-PtCYS_nat）进行了流式细胞术分析，以测量YFP+细胞的百分比和ΔMFI（图4B和C）。使用Sh ble_nat菌株作为阴性对照以减去自荧光。尽管来自YFP_1_SPPtCYS_nat和YFP_32_SPPtCYS_nat的克隆显示出比其对照（YFP_1_nat和YFP_32_nat）略高的YFP+细胞百分比，但观察到的差异并不显著（图5B，p>0.01）。相比之下，来自YFP_36_SPPtCYS_nat的31个克隆显示出比不表达cystatin的31个YFP_36_nat克隆显著更高的YFP+细胞百分比（约4倍增加，平均值分别为9±3% vs 2±3%，p<0.0001）。YFP_36_SPPtCYS_nat中的YFP积累量也显著增加（约2倍增加，MFI分别为670±170 vs 370±248，p<0.0001），遵循相同的模式（图4C）。在这些转接子中，结果高度可重复，因为在31个克隆中有30个在PtCYS:3xHA过表达后，在细胞（MFI）和群体（%）水平上增加了YFP的丰度。

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图4. 通过引入在C端标记有三个血凝素序列的SPPtCYS:3xHA，在YFP荧光较低的细胞中恢复YFP荧光。A. 表达YFP的重组盒的示意图，以及将SPPtCYS:3xHA引入第二个携带Nourseothricin抗性的nat基因的episome中，该基因由fucoxanthin叶绿素结合蛋白C（fcpC）启动子驱动（SPPtCYS_nat，上图）或空载体（nat，下图）。该图使用BioRender.com创建 [45]。B. 转化有nat（灰色）或SPPtCYS_nat（白色）episome的YFP阳性细胞百分比的箱形图。所有培养物（n=31）均以Sh ble_nat自荧光菌株为基准进行标准化。C. YFP的平均荧光强度（ΔMFI）的箱形图。D. 转接子中的YFP拷贝数。选择了五个YFP36_SPPtCYS_nat克隆（YFP+细胞百分比高）和五个YFP36_nat克隆（YFP+细胞百分比低）（灰色框）来检查YFP基因拷贝数（黑色圆圈），并归一化到总DNA。****表示nat和CYS_nat克隆之间的显著差异（p值<0.01，双因素ANOVA后进行Tukey检验）。

为了确定YFP_36_SPPtCYS_nat和YFP_36_nat组之间YFP百分比和ΔMFI的差异是否是由于细胞中的YFP基因拷贝数造成的，选择了五个YFP+细胞百分比高的克隆（克隆2、5、7、10和26）和五个YFP_36_nat百分比低的克隆（克隆1、8、9、15、20）并进行分析（图4D，右侧y轴，显示为灰色）。十个克隆和Sh ble_nat菌株的YFP基因拷贝数归一化到总DNA。结果表明，YFP百分比和强度都不依赖于YFP基因拷贝数（图4D，左侧y轴，显示为黑色），因为拷贝数与YFP百分比和强度无关。Díaz-Garza等人也报告了类似的结果，他们发现中等和低GFP荧光群体之间的质粒拷贝数没有显著差异，而高GFP荧光的克隆携带更高的质粒拷贝数 [22]。

总体而言，在所有来自三个转接子的菌株中观察到的YFP强度和YFP+细胞百分比的增加表明，PtCYS的过表达可以以基因组依赖的方式增加YFP的积累。YFP和其他荧光蛋白不是Cys蛋白酶的特异性底物；然而，间接地，抑制内源性Cys蛋白酶活性可能会减少错误折叠或不稳定重组蛋白的降解，从而增加YFP的积累。几个遗传和生理因素可能导致菌株之间的差异。首先，独立的转接子可能在基础蛋白酶库和激活状态上有所不同，包括在P. tricornutum中与应激相关的形态类型中富集的类木瓜蛋白酶 [28]。在这种情况下，当Cys蛋白酶介导的降解是主要限制时，预计PtCYS将提供更大的益处。其次，克隆之间的episome完整性和基因表达输出以及已报道的episomal系统的转录后沉默机制 [21]、[22] 可能会产生低荧光表型，这些表型不是主要由蛋白水解驱动的，因此不会通过cystatin表达得到恢复。第三，蛋白质稳态能力的变异性（即折叠、未折叠蛋白反应或自噬）可能会使重组蛋白远离Cys蛋白酶。最后，区室化可能很重要：我们的共表达系统中对PtCYS信号肽的需求表明，靶向分泌途径可能是抑制相关蛋白酶所必需的，而克隆之间的运输效率差异可能会调节PtCYS对其目标的访问。

因此，这项研究强调了PtCYS过表达作为提高episomal编码异源蛋白生产的新策略的潜力。PtCYS的作用机制可能与原位抑制内源性Cys蛋白酶有关，也可能涉及非抑制效应，例如番茄SlCYS8对N. benthamiana叶片中人类α1ACT整体结构的稳定作用 [43] 所示。然而，我们的结果还表明，内源性蛋白酶可能会阻碍某些转接子中的最佳YFP积累，这增加了其他最近提出的沉默机制 [22]，这些机制可以针对代谢工程进行改进。

抑制性cystatin在微藻中的功能和活性仍需进一步了解。需要进一步的研究来阐明它们在细胞质外空间、质膜以及细胞壁重组和聚合中的作用，以及在调节P. tricornutum细胞形态类型转变中的作用。还有待观察的是，这种微藻中Cys蛋白酶和cystatin活性的相对活性是否参与了细胞间通信、群体动态或底栖簇的形成等过程。

除了分子农业之外，硅藻越来越多地被探索作为食品和营养补充剂的可持续蛋白质和生物活性肽的来源。最近的研究强调了人们对替代蛋白质基质和水解物在功能性食品和健康相关应用中的兴趣 [78]、[79]、[80]。在这方面，旨在限制细胞内蛋白水解的策略，如cystatin过表达，可能有助于提高内源性硅藻蛋白质的回收。尽管本研究专注于异源蛋白的积累，但未来的工作将需要确定调节半胱氨酸蛋白酶活性是否会影响硅藻中的总蛋白质产量或肽谱。

4. 结论
多年来，硅藻P. tricornutum一直被用作可持续的异源蛋白生产平台。然而，仍存在一些挑战，因为一些目标蛋白难以表达 [8]、[75]、[81]。在其他蛋白质表达系统中，如细菌或酵母中，已经开发了各种策略，包括工程化更能耐受有毒蛋白表达的菌株或更适合细胞质表达富含二硫键的蛋白 [82]，以及优化培养基以减少蛋白酶活性和氧化应激。在这里，我们将之前在N. benthamiana [43] 中开发的知识和方法应用到了微藻蛋白质生产平台中。作为首次对硅藻cystatin进行表征并探索其可能作用机制的研究，这项工作为在P. tricornutum中稳定异源蛋白质的生产提供了概念验证，尽管此处使用的模型目标YFP并非半胱氨酸蛋白酶的直接底物[36]。我们的结果表明，PtCYS的过表达可以在P. tricornutum中诱导多种效应，从而在特定条件下增加或稳定有价值的重组蛋白的积累。这项研究进一步丰富了人们对光合生物中cystatin功能的认识，并展示了它们在改善分子工程结果方面的潜在应用。这样的进展对于全面利用基因工程工具，在新的分子农业宿主（如P. tricornutum）中更轻松、更可控地表达重组蛋白至关重要。

**作者贡献声明：**
Elisa Fantino：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、概念化。
Natacha Mérindol：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、数据分析、概念化。
Carolina Gabriela Gajón Robles：撰写 – 审稿与编辑、数据分析。
Fatima Awwad：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、数据分析、概念化。
Karen Cristine Gon?alves dos Santos：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件使用、数据分析。
Kimy-Li Rhéaume：撰写 – 审稿与编辑、数据分析。
Marie-Claire Goulet：撰写 – 审稿与编辑、概念化。
Dominique Michaud：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集、概念化。
Isabel Desgagné-Penix：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金筹集、概念化。