饮食中甘草（Glycyrrhiza glabra）和生姜（Zingiber officinale）的联合效应对灰鲻鱼（Liza ramada）的生长性能、肠道和肝脏健康、抗氧化状态以及肠道微生物群组成的影响

《Aquaculture and Fisheries》：Combined effects of dietary licorice ( Glycyrrhiza glabra) and ginger ( Zingiber officinale) on growth performance, intestinal and hepatic health, antioxidant status, and gut microbiota composition in grey mullet ( Liza ramada)

　　穆罕默德·F·埃尔·巴苏伊尼 | 阿克拉姆·伊斯梅尔·谢哈塔 | 玛吉达·拉希德 | 米涅尔瓦·阿卜杜拉·加拉尔 | 阿卜杜勒阿齐兹·M·埃尔-海斯 | 艾利·A·索利曼 | 伊斯兰·I·泰巴 | 玛雅达·阿尔霍希 | 艾哈迈德·A·加布里 | 马哈茂德·S·格瓦利 | 埃斯拉姆·特法尔
坦塔大学农业学院，坦塔，31527，埃及

**摘要**
甘草（Glycyrrhiza glabra）和生姜（Zingiber officinale）是具有良好抗氧化、抗菌和免疫刺激特性的植物源饲料添加剂；然而，它们对灰鲻鱼（Liza ramada）的综合影响尚未被探索。本研究评估了这些添加剂对灰鲻鱼的生长、肠道和肝脏健康、抗氧化防御、免疫系统以及肠道微生物群的单独和联合效应（n = 360，初始平均体重 ± 标准误差 = 35.15 ± 0.26 克）。实验进行了60天的喂养试验，设置了四种饮食处理（n = 3 个重复组；每组30条鱼）：基础饮食（D1；对照组）、甘草（4 克/千克；D2）、生姜（10 克/千克；D3）或它们的组合（2 克/千克甘草 + 5 克/千克生姜；D4）。所有饮食的氮含量相同（31.27 ± 0.19% 的粗蛋白）和脂质含量相同（8.50 ± 0.14% 的粗脂质）。与对照组和单一添加剂组相比，组合补充剂（D4）显著提高了最终体重、体重增重百分比、特定生长率和饲料转化率（P < 0.05）。所有补充组的胃肠道酶功能（脂肪酶和蛋白酶）均得到显著增强，其中D4组的效应最为明显。组织学分析显示，D4组的肠绒毛长度、表面积和杯状细胞数量增加，肝实质组织有序，糖原沉积也增加。生化评估显示总蛋白和球蛋白水平升高，且对葡萄糖或肝脏和肾脏健康没有不良影响。饮食补充剂提高了溶菌酶水平，抑制了无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的生长，并减少了硝基蓝四唑（NBT）的还原量，其中D4组的效应最大（P < 0.05）。抗氧化反应在D4组中更为显著，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性增加，丙二醛（MDA）水平降低（P < 0.05）。此外，肠道微生物群分析显示，所有补充组中的病原菌（包括大肠杆菌、沙门氏菌属和葡萄球菌属）显著减少，而产酸发酵菌显著增加，其中D4组的效应最为明显。这些发现强调了将甘草（2 克/千克饮食）和生姜（5 克/千克饮食）结合使用作为天然饲料添加剂，以促进鲻鱼生长、健康和水产养殖可持续性的潜力。

**1. 引言**
水产养殖提供了全球近50%的海产品供应，对于满足日益增长的蛋白质需求至关重要，尤其是在野生鱼类资源减少的情况下（Ahmad等人，2026；Nirmal等人，2024）。然而，集约化水产养殖面临重大挑战，包括疾病爆发、环境压力和抗生素的广泛使用，这些问题引发了对抗生素耐药性、产品安全和环境可持续性的担忧（Cherian等人，2023；Wang等人，2011；Wu等人，2018）。这些挑战突显了迫切需要可持续的替代传统疾病管理和生长促进策略（Reverter等人，2017；Rosle等人，2024）。
植物源饲料添加剂，特别是来自植物的植物活性物质，已成为提高水产养殖实践韧性和效率的有希望的候选者（Kamble等人，2024；Madhulika等人，2025）。这些化合物因其多方面的生物特性而受到认可，包括抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节作用，使其成为合成生长促进剂和抗生素的有效替代品（Jana等人，2018；Kalaiselvan等人，2024；Nazeemashahul等人，2024，第119-135页）。在这些植物活性物质中，甘草（Glycyrrhiza glabra）和生姜（Zingiber officinale）因其丰富的生物活性成分和在陆地和水生物种中改善健康结果的有效性而脱颖而出（Mohammed等人，2020；Sadek，2020）。然而，它们的综合效应尚未得到研究，尤其是在灰鲻鱼（L. ramada）中。
甘草是一种原产于地中海和亚洲的豆科植物，以其高含量的甘草苷、黄酮类化合物和皂苷而闻名。这些生物活性成分已被广泛研究其抗氧化、保护肝脏和免疫刺激作用（Abdel-Tawwab & El-Araby，2021；Darvishi等人，2022）。在水产养殖中，添加甘草已被证明对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、普通鲤鱼（Cyprinus carpio）和虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）等物种的生长、饲料利用效率和免疫系统有显著益处（Abdel-Tawwab & El-Araby，2021；Meng等人，2022；Zahrei等人，2021）。同样，生姜是一种在热带亚洲广泛种植的根茎，以其多种生物活性化合物而闻名，包括姜醇、姜辣素和精油（Destryana等人，2024）。这些成分具有强大的抗炎、抗菌和抗氧化作用，已被证明可以促进鱼类（如普通鲤鱼、斑马鱼、罗非鱼和虹鳟鱼）的生长、增强免疫防御和提高耐受性（Fazelan等人，2020；Mohammadi等人，2020；Ahmadifar等人，2019；Sukumaran等人，2016；Bakhtiari Aqmasjed等人，2023）。这些发现共同支持了将植物源添加剂作为可持续替代品在水产饲料中的兴趣日益增长。
虽然甘草和生姜的单独益处已有充分记录，但关于它们联合使用的信息有限，尤其是在灰鲻鱼中。联合补充是指同时使用两种饲料添加剂以潜在地提高其整体效果，作为一种提高天然饲料添加剂效果的策略（Shehata等人，2024）。甘草和生姜中的独特生物活性成分可能相互补充，增强它们的抗氧化、免疫刺激和生长促进作用（Mohammed等人，2020）。因此，它们的联合使用可能为改善水产养殖系统中的鱼类健康和生产力提供一种经济高效和可持续的方法（Hossain等人，2024）。
灰鲻鱼（L. ramada）是一种适应性很强的物种，在沿海生态系统中扮演重要角色，以藻类、有机碎屑和底栖微生物为食（Crosetti，2016）。其自然进食习惯，即持续摄入富含微生物和复杂有机物的碎屑物质，使得肠道健康、消化效率和微生物平衡对最佳生长和营养利用尤为重要。该物种对广泛盐度的耐受性使其能够在海洋和内陆水域中繁衍（Salman等人，2022），使其成为水产养殖中越来越重要的物种（El Basuini等人，2025；Potter等人，2015）。然而，集约化养殖条件使灰鲻鱼容易受到疾病爆发、环境压力和营养失衡的影响，从而损害消化性能和免疫功能（El Basuini等人，2024；Oglend，2020；Shehata等人，2024）。在这种情况下，具有抗菌、抗氧化和消化刺激特性的植物源饲料添加剂可能特别有利于支持这种以碎屑为食的物种的肠道完整性、微生物平衡和整体健康。
从微生物学的角度来看，鱼的肠道微生物群在多种生理功能中起着关键作用，包括营养消化和吸收、免疫系统发育和调节、抵御病原体以及调节宿主代谢（Nayak，2010；Ring?等人，2014）。在以碎屑为食的物种（如灰鲻鱼）中，肠道微生物组特别动态，并受到饮食输入的生态影响，因为这些鱼不断摄入含有多样化微生物群的有机沉积物（Crosetti，2016）。饮食组成是调节肠道微生物群结构和功能的最强因素之一，植物源添加剂越来越被认为能够选择性地抑制病原菌同时促进有益微生物种群（Hoseinifar等人，2019；Wang等人，2024）。饮食与宿主基因组背景之间的相互作用可以进一步影响微生物表型，饮食引起的肠道微生物组变化可能改变与免疫、代谢和应激反应相关的基因表达，这一概念在水产养殖中被称为饮食-基因型相互作用（Ring?等人，2014）。因此，研究甘草和生姜补充剂对灰鲻鱼肠道微生物群的影响不仅有助于了解它们的抗菌特性，还能提供这些植物源物质如何重塑更广泛的肠道生态系统以促进宿主健康的见解。
因此，本研究评估了饮食中甘草和生姜补充剂对灰鲻鱼生长性能、饲料利用效率、生理应激指标、抗氧化能力、免疫反应参数、肠道形态和肠道微生物群组成的单独和联合影响。研究旨在确定这些天然添加剂的组合是否比单独使用提供更好的效益，为可持续的水产养殖实践提供一种新颖且经济高效的方法。

**2. 材料与方法**
2.1. 伦理批准和实验室条件
喂养阶段在NIOF的Baltim研究单元进行（坐标：31°33′08.2″N，31°05′29.6″E）。灰鲻鱼来自埃及Kafr El-Sheikh市的一家非政府水产养殖生产商。养殖系统包括一个主要适应池（5 × 10 × 1 米）和12个养殖池（2 × 5 × 1 米），所有池都配备了通风设备，以提供最佳生长条件和最小压力，这得到了先前关于灰鲻鱼养殖研究的支持（El Basuini等人，2025a，2025c）。池子用100毫克/升的氯消毒，然后用洗涤剂、淡水、海水依次冲洗，最后用微咸水冲洗。实验方案得到了埃及KSIU沙漠农业学院动物护理委员会的批准（批准号KSIU/2025/DA-6），遵循ARRIVE指南v2.0。
2.2. 实验规格
在14天的适应期内，鱼被喂食基础对照饮食（表1）。适应期结束后，鱼（体重：35.15 ± 0.26 克）被随机分配到12个实验池中（每池30条鱼），分为三组。养殖系统是一个流动系统，通过连接在鼓风机上的气石持续供气。60天的养殖试验在标准化条件下进行：12小时光照/黑暗周期，水温24.89 ± 0.27°C，盐度18.5 ± 1.2 ppt，溶解氧6.61 ± 0.41毫克/升，总氨0.02 ± 0.001毫克/升，pH值7.55 ± 0.34。每天更换30%的水以保持水质。
**表1. 基础饮食的成分和近似营养成分**
| 成分 | g/千克 |
| ---- | ---- |
| 大豆粉（44% CP） | 350 |
| 黄玉米 | 200 |
| 鱼粉（65% CP） | 150 |
| 小麦麸皮 | 70 |
| 小麦粉 | 60 |
| 米糠 | 50 |
| 谷蛋白 | 50 |
| 鱼油 | 30 |
| 大豆油 | 20 |
| 二钙磷酸盐 | 10 |
| 维生素和矿物质预混料 | a | 10 |
| 植物源添加剂 | b | 总计 | 1000 |
| 近似营养成分 | | |
| 粗蛋白（%） | 31.27 ± 0.19 |
| 粗脂质（%） | 8.50 ± 0.14 |
| 纤维（%） | 4.2 ± 0.11 |
| 灰分（%） | 7.8 ± 0.09 |
| 总能量（MJ/Kg） | c | 18.15 ± 0.11 |
a. 维生素和矿物质混合物由Shehata等人（2024）提供。
b. 植物源添加剂由小麦粉替代。D1：无添加剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4 克/千克）；D3：基礎饮食 + 姜（10 克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2 克/千克）+ 姜（5 克/千克）。
c. 总能量使用以下值估算：蛋白质23.6 千焦/克，脂质39.5 千焦/克，碳水化合物17.2 千焦/克。
2.3. 饲料制备和喂养
准备了四种测试饮食：D1（对照组）：基础或未经处理的饮食；D2：基础饮食 + 甘草（G. glabra，4 克/千克）（Meng等人，2022）；D3：基础饮食 + 姜（Z. officinale，10 克/千克）（Fazelan等人，2020；Naliato等人，2021）；D4：基础饮食 + 甘草（2 克/千克）和姜（5 克/千克）。甘草根粉和姜根粉由埃及King Salman国际大学农业学院的植物学家采购并鉴定。甘草根和姜根在阴凉处干燥，研磨成细粉（颗粒大小<250 微米），并在4°C下密封保存直至使用。植物化学分析使用高效液相色谱法（HPLC）进行，方法依据Pastorino等人（2018）对甘草和Mao等人（2019）对生姜的研究。甘草粉含有甘草苷（4.8% w/w）、总黄酮类化合物（2.3% w/w）和总皂苷（8.1% w/w）。姜粉含有姜醇（1.9% w/w）、姜辣素（0.7% w/w）和总酚类化合物（3.4% w/w，以没食子酸当量计）。通过HPLC分析验证了饲料加工和储存过程中生物活性化合物的稳定性，分别在制粒后立即和储存60天后在4°C下进行。甘草补充饮食中的甘草苷保留率为94.3% ± 2.1%，姜补充饮食中的姜醇保留率为91.7% ± 2.8%。这些保留率与先前研究一致，表明这些化合物在常规饲料制粒过程中的热稳定性（Mao等人，2019；Pastorino等人，2018）。
每种饮食的蛋白质（31.27% ± 0.19%）和脂质水平（8.50% ± 0.14%）相似。饮食的近似分析基于AOAC（2000）程序进行：水分（烤箱脱水，105°C）、灰分（点火，550°C）、脂质（Soxhlet技术）、蛋白质（Kjeldahl协议）和纤维（Van Soest等人，1991）。表1展示了基础饮食的配方和组成。饮食被制成颗粒（直径3毫米），空气干燥，并保持在4°C。鱼每天分三次（06:30、12:30和18:30）喂食至明显饱腹。喂食后30分钟通过虹吸收集未食用的饲料，在60°C下干燥至恒重，并称重以计算实际饲料消耗量。**生长表现与采样**

经过一夜禁食后，测量了初始（W0）和最终（W60）体重、总长度（TL）以及内脏（VW）、肝脏（LW）和肠道（IW）的重量，用于指数计算：

- **体重增长（WG, %）** = (W60 - W0) / W0 × 100
- **特定生长率（SGR, %/day）** = Ln(W60 / W0) / 60 × 100
- **存活率（SR, %）** = (Fish_count_60day / Fish_count_0day) × 100
- **Fulton条件因子（K factor）** = (W60 / TL) × 3 × 100
- **饲料转化率（FCR）** = (FI_gW_60day, g) - (W0day, g) / W0
- **肝体指数（HSI, %）** = (LW_gW_60day, g) × 100
- **内脏体指数（VSI, %）** = (VW_gW_60day, g) × 100
- **肠道体指数（ISI, %）** = (IW_gW_60day, g) × 100

为了评估生长表现，在试验开始和结束时对每个水箱中的所有鱼类进行了整体称重。采样前，鱼类被要求禁食一夜（最后一次喂食后约16小时，时间为18:30）。采样在次日上午08:00至10:00之间进行。对于生化和组织学分析，每个处理组随机选择了9条鱼（每个水箱3条鱼）并实施安乐死。为了最小化死后微生物种群和酶稳定性的变化，收集了用于酶活性和微生物分析的肠道样本，并在收集后30分钟内进行处理。

**3.2. 肠道和肝脏健康**

- **肠道酶和微生物**
- 消化酶活性在每个生物样本中进行了三次重复测定（技术重复），并在25°C的受控温度下使用平均值进行统计分析，以获得最佳和可重复的酶活性测量结果，如之前的鱼类营养研究中所描述的（Champasri等人，2021年；Sanz-Latorre等人，2025年；Wang等人，2019年）。蛋白酶活性使用商业检测试剂盒（Sigma-Aldrich）进行测定，以酪蛋白作为特定底物，按照制造商的说明操作（Cupp-Enyard，2008年）。脂肪酶和淀粉酶活性使用从南京建城生物工程研究所（中国）获得的商业试剂盒通过分光光度法测定。淀粉酶活性（AMS，目录号C016-1-1）在660 nm处测量，而脂肪酶活性（LPS，目录号A054-1-1）根据制造商的协议在420 nm处定量。
- **微生物评估**
- 从每组7条鱼中收集肠道样本（n = 21），用生理盐水（PBS，pH 7.5；1:10 w/v）冲洗后进行匀浆。然后将匀浆液在4°C下以6800×g离心5分钟，上清液用于消化酶活性分析。肝脏样本在0.86% NaCl（1:9 w/v）中使用FSH-2A VEVOR匀浆器进行匀浆。匀浆后，在4°C下以13,600×g离心10分钟。随后的上清液用于抗氧化评估。

**3.3. 组织学检查**

- **肝脏和肠道组织的组织形态学分析**
在喂食阶段结束时进行了肝脏和肠道组织的组织形态学分析。鱼类被麻醉后，打开腹腔以提取组织。收集的样本在10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）中保存48小时。固定后，组织通过分级乙醇系列（70%–100%）脱水，用二甲苯清洗，然后嵌入石蜡中。使用RM2035旋转切片机（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）切割5 μm厚的切片，放置在玻璃载玻片上，并按照Bancroft和Gamble（2008年）的描述用苏木精和伊红染色。染色切片在Leica DM500显微镜下观察，并使用Leica EC3相机（Leica，德国）拍摄图像。定量组织形态学分析由一名对处理组不知情的训练有素的观察者使用ImageJ软件（版本1.53，NIH，美国）对数字化图像进行。对于每个鱼类样本（每组n = 5），测量了十个方向一致的绒毛切片。测量的参数包括绒毛高度（μm）、绒毛宽度（μm）、绒毛表面积（μm2）和杯状细胞数量。对于肝脏组织学，根据Bancroft和Gamble（2008年）描述的方法，基于细胞质空泡化的强度和分布定性评估了糖原沉积。

**3.4. 血清生化谱**

- **血清生化谱** 使用市售检测试剂盒根据制造商的说明进行测定。白蛋白（g/dL，AB 10 10）、总蛋白（g/dL，TP 20 20）和球蛋白（g/dL，通过总蛋白与白蛋白的差值计算）使用Bio-Diagnostic试剂盒（开罗，埃及）进行定量。生化评估还包括甘油三酯（mg/dL，TG 20 11）、胆固醇（mg/dL，TC 20 10）、肾功能参数（血尿素氮，mg/dL，UR 21 10；肌酐，mg/dL，CR 12 50）和肝酶（ALT，IU/L，AT 10 34；AST，IU/L，AT 10 45）。使用葡萄糖氧化酶（mg/dL）方法测量葡萄糖水平（ng/mL），并使用Bayer Diagnostics ELISA试剂盒（Spinreact Co., 西班牙）评估皮质醇浓度。

**3.5. 免疫标志物**

- **溶菌酶反应（LYZ）** 通过使用Micrococcus lysodeikticus作为底物的浊度法进行评估（Demers & Bayne，1997）。简要来说，将50 μL血清加入2 mL M. lysodeikticus悬浮液（0.2 mg/mL在0.05 M磷酸盐缓冲液中，pH 6.2），并在25°C下使用分光光度计在530 nm处测量0分钟和60分钟时的吸光度下降。使用Hen蛋清溶菌酶（Sigma-Aldrich）作为标准，溶菌酶活性表示为μg/mL血清当量。
- **杀菌活性（BA）** 按照El Basuini等人（2024）的方法进行评估。将25 μL血清与25 μL Streptococcus agalactiae悬浮液（调整至1 × 10^6 CFU/mL在无菌磷酸盐缓冲液中，PBS）在96孔微孔板中在25°C下孵育2.5小时。孵育后，向每个孔中加入200 μL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），并在25°C下进一步孵育18小时。细菌生长抑制通过分光光度法在570 nm处测量。包括阴性对照（细菌+在56°C下热灭活的血清）和阳性对照（细菌+不含血清的PBS）。杀菌活性计算为：BA (%) = [(OD阳性对照 - OD样本) / OD阳性对照] × 100。
- **中性蓝四唑（NBT）还原试验** 用于评估中性粒细胞的呼吸爆发活性，按照Anderson和Siwicki（1995）的方法进行。简要来说，将100 μL肝素化血液与100 μL 0.2% NBT溶液（Sigma-Aldrich溶解在PBS中）在微离心管中混合，并在25°C下孵育30分钟，每10分钟轻轻混合一次。孵育后，向每个管中加入1 mL N,N-二甲基甲酰胺（Sigma-Aldrich）以溶解NBT还原形成的甲酚蓝晶体。将管子在3000×g下离心5分钟，并在540 nm处测量上清液的光密度。使用含有PBS（而不是NBT）的空白溶液来校正背景吸光度。NBT还原表示为校正后的OD540值。

**3.6. 抗氧化能力**

- **抗氧化水平** 使用南京建城研究所试剂盒（Bioengineering，中国）进行测量。蛋白质浓度使用Bradford方法进行评估，酶活性相对于蛋白质含量计算并表达（单位/mg蛋白质）。超氧化物歧化酶（SOD）功能在450 nm处使用WST-1试剂测量，过氧化氢酶（CAT）效力在405 nm处使用钼酸盐测定，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平在412 nm处分析。脂质过氧化通过使用TBA试剂（目录号A001-3-2、A007-1-1、A005-1-1和A003-1-1）在532 nm处通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法测量丙二醛（MDA）水平。

**3.7. 统计分析**

- **数据分析** 在分析之前，使用Shapiro-Wilk检验（α = 0.05）和Levene检验（中位数中心）分别测试数据的正态分布和方差同质性。结果以三次重复的平均值±标准误差（SE）表示。通过单因素方差分析（ANOVA）评估添加甘草和生姜的饮食效果，然后使用Duncan的多范围检验来识别显著差异（P < 0.05）。对于微生物数据，使用回归分析来评估补充水平与细菌计数之间的关系，R2值表示模型拟合度。进行Pearson相关性分析以检查微生物群落与饮食处理之间的关联，无论是单独补充还是联合补充。数据可视化包括带有回归线的散点图和热图，显示微生物种群与饮食组之间的相关矩阵。所有统计分析和图形表示都是使用Python（版本3.9）及其库（Pandas、Seaborn、Matplotlib、Scipy）进行的，额外的验证在R软件（版本4.3.1）中进行。

**3. 结果**

**3.1. 生长表现、饲料利用和生物测量指标**

表2列出了喂食添加甘草或/和生姜60天的L. ramada的生长状态、饲料利用效率、存活率和生物测量指标。接受联合补充（D4）的鱼类表现出最高的生长指标（W60天、WG%和SGR）和最有效的FCR，与其他所有组相比。单独补充甘草（D2）或生姜（D3）也改善了生长，但效果不如联合处理。所有组的存活率都很高（97.78%–100%），没有差异（P > 0.05）。同样，包括HSI、ISI、VSI和K因子在内的身体生物测量指标在各处理组之间没有差异（P > 0.05）。

**表2. 60天饮食试验后灰鲻鱼的关键性能指标**

| 参数 | D1 | D2 | D3 | D4 | P值 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 初始体重，g | 35.23 ± 0.26 | 35.10 ± 0.12 | 35.21 ± 0.29 | 35.07 ± 0.38 | 0.966 |
| 最终体重，g | 101.85 ± 1.95 | c | 127.82 ± 1.82 | b | 129.38 ± 1.51 | b | 147.91 ± 2.62 | a | 0.001 |
| 体重增长% | 189.18 ± 7.65 | c | 246.16 ± 4.53 | b | 267.57 ± 7.25 | b | 321.91 ± 9.13 | a | 0.001 |
| 特定生长率（SGR, %/day） | 1.77 ± 0.5 | c | 2.16 ± 0.02 | b | 2.17 ± 0.03 | b | 2.40 ± 0.03 | a | 0.001 |
| 饲料转化率（FCR） | 1.76 ± 0.05 | a | 1.44 ± 0.06 | b | 1.43 ± 0.05 | b | 1.35 ± 0.02 | b | 0.001 |
| 存活率（SR, %） | 97.78 ± 1.11 | 100.00 ± 0.00 | 98.89 ± 1.11 | 100.00 ± 0.00 | 0.219 |
| 肝体指数（HSI, %） | 1.90 ± 0.03 | 1.94 ± 0.06 | 2.00 ± 0.09 | 2.06 ± 0.09 | 0.471 |
| 肠道体指数（ISI, %） | 2.91 ± 0.12 | 3.18 ± 0.01 | 3.07 ± 0.11 | 3.14 ± 0.08 | 0.261 |
| 内脏体指数（VSI, %） | 6.08 ± 0.33 | 6.21 ± 0.19 | 6.31 ± 0.11 | 6.32 ± 0.04 | 0.812 |
| Fulton条件因子（K factor） | 2.12 ± 0.10 | 2.33 ± 0.10 | 2.17 ± 0.05 | 2.11 ± 0.05 | 0.258 |

**3.2. 肠道和肝脏健康**

- **肠道组织形态学**
- **显微镜检查** 经过60天饮食补充后，对L. ramada的H&E染色肠道切片的显微镜检查显示，不同处理组在黏膜结构上存在明显差异（图1）。所有实验组，包括未补充的对照组，都表现出正常的肠道基本形态，特征是完整的绒毛、连续的上皮层和明确的肠道壁。然而，结构发育和细胞组织在不同处理组之间有显著差异。在对照组（D1）中，所有三个段的肠道绒毛长度和表面积相对适中，绒毛上皮上的杯状细胞分布相对稀疏。肠道壁清晰，未观察到病理病变。然而，与补充组相比，整体黏膜发育不那么明显。喂食甘草补充饮食（D2）和生姜补充饮食（D3）的鱼类在所有三个肠道段的肠道形态明显改善。D2和D3的绒毛明显更长更宽，导致吸收表面积增加，所有检查段的绒毛上皮上的杯状细胞分布更丰富。D2和D3的改善幅度相当，没有一个单独补充组在组织形态学上明显优于另一个组。在联合补充组（D4）中观察到最显著的结构改善，该组接受了2 g/kg甘草和5 g/kg生姜。D4的肠道绒毛在所有三个段（前段（A4）、中段（B4）和后段（C4）都是最长最宽的，导致所有实验组中最大的吸收表面积。D4鱼类的所有肠道段的绒毛上皮上的杯状细胞特别丰富，表明黏膜分泌能力增强。D4的所有段的肠道壁保持清晰且结构完整，没有炎症浸润、绒毛融合或上皮破坏的迹象。值得注意的是，在补充组中偶尔观察到一些切片伪影，包括折叠或未完全压平的绒毛尖端，这归因于切割结构更高、更密集的绒毛的机械挑战，而不是黏膜损伤的迹象，因为所有情况下都保持了固有层和上皮的连续性。

**图1. 60天饮食处理后灰鲻鱼（Liza ramada）肠道组织的显微镜结构，使用苏木精和伊红（H&E）染色，比例尺为100 μm。**饮食处理包括不含补充剂的基礎饮食（D1：A1、B1、C1）、添加了4克/千克甘草的基礎饮食（D2：A2、B2、C2）、添加了10克/千克生姜的基礎饮食（D3：A3、B3、C3），以及同时添加了2克/千克甘草和5克/千克生姜的基礎饮食（D4：A4、B4、C4）。所有组的肠道形态均正常，绒毛完整（黑色箭头所示），肠道壁清晰可见（白色箭头所示）。添加补充剂的组别显示出更强的肠道结构，尤其是在所有段中都存在大量的杯状细胞。

3.2.2 消化酶活性
表3列出了甘草和生姜添加对灰鲻鱼消化酶效力的影响。喂养60天后，各实验组之间的淀粉酶活性没有差异（P > 0.05）。然而，脂肪酶和蛋白酶的活性受到饮食处理的显著影响（P < 0.05）。脂肪酶活性最高的是喂食甘草和生姜组合的组（D4；20.28 ± 1.34 U/mg），高于其他所有处理组（P < 0.05）。单独喂食甘草（D2；15.61 ± 0.51 U/mg）或生姜（D3；15.97 ± 1.23 U/mg）的鱼组的脂肪酶活性也显著高于对照组（D1；11.60 ± 0.88 U/mg）。蛋白酶活性也呈现相同趋势，最高值出现在甘草和生姜组合组（D4；19.28 ± 0.89 U/mg），其次是单独添加组（D2：14.64 ± 0.49 U/mg；D3：14.82 ± 0.50 U/mg），而对照组活性最低（D1；12.31 ± 0.62 U/mg）。

表3. 喂养60天后灰鲻鱼的消化酶水平。
酶活性（U/mg）
D1 D2 D3 D4
P值
淀粉酶 16.01 ± 0.91 16.21 ± 0.91 16.43 ± 0.49 16.78 ± 1.15 0.936
脂肪酶 11.60 ± 0.88 c 15.61 ± 0.51 b 15.97 ± 1.23 b 20.28 ± 1.34 a 0.003
蛋白酶 12.31 ± 0.62 c 14.64 ± 0.49 b 14.82 ± 0.50 b 19.28 ± 0.89 a 0.001
同一行内的数值为平均值 ± 标准误差。上标a、b和c表示P < 0.05的显著性。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。

3.2.3 肝脏组织形态
H&E染色的肝脏切片显微检查显示，所有实验组的肝脏结构均正常，具有可识别的肝细胞、血窦、中央静脉、肝管和血管周围的黑素巨噬细胞中心（图2）。在任何处理组中均未观察到肝细胞坏死、炎症浸润或胆管增生等病理特征，证实了单独和组合植物源性补充剂的肝脏安全性。在对照组（D1）中，肝实质表现出标准的组织结构，肝细胞围绕中央静脉和血窦呈典型的索状排列。血管周围的黑素巨噬细胞聚集体作为特征性的色素团块可见。肝细胞内的细胞质空泡化处于基线水平，这与常规喂养条件下硬骨鱼的正常肝细胞糖原和脂质动态一致。喂食甘草的组（D2）的肝实质组织比D1有所改善，肝细胞排列更规则，细胞质空泡化明显增加，表明糖原沉积增强。肝管和中央静脉清晰可见且结构正常。同样，喂食生姜的组（D3）也显示出良好的肝实质组织，细胞质内空泡化增加，表明糖原积累增加。D2和D3组的肝脏改善情况相似，血管周围的黑素巨噬细胞中心仍然明显可见，同时血窦结构也得到良好保留。组合补充组（D4）在所有实验组中显示出最理想的肝脏组织形态。D4组的肝细胞排列成规则的金字塔状，细胞质空泡化最为显著，反映了最大的糖原沉积程度，表明碳水化合物储存和代谢效率提高。

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图2. 饲养60天后灰鲻鱼肝脏组织的显微结构（H&E染色，100 μm比例）。A = 不含补充剂的基礎饮食；B = 基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；C = 基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D = 基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。组织学分析显示肝脏呈海绵状，肝实质正常，包括肝细胞、血窦、中央静脉（黑色箭头）、肝管（绿色箭头）和血管周围的黑素巨噬细胞（白色箭头）。添加补充剂的组（D2、D3和D4）的肝实质得到改善，糖原沉积明显。

3.3 血清化学状态
表4展示了喂养60天后灰鲻鱼的血液生化参数。所有处理组的总蛋白水平均较高（P < 0.05）（D2：3.85 ± 0.19，D3：3.87 ± 0.16，D4：3.90 ± 0.10 g/dL），而未处理组为2.98 ± 0.09 g/dL）。所有处理组的白蛋白水平保持稳定，而球蛋白浓度显著增加（P < 0.05）（D2：2.59 ± 0.20，D3：2.61 ± 0.17，D4：2.64 ± 0.07 g/dL），相对于未处理组（1.76 ± 0.08 g/dL）。饮食处理对葡萄糖、皮质醇、总胆固醇或甘油三酯水平没有影响（P > 0.05）。同样，肝酶（ALT和AST）和肾功能指标（血尿素氮和肌酐）在实验组之间也没有显著变化。

表4. 喂养60天后灰鲻鱼的血清生化参数。
项目 D1 D2 D3 D4
P值
总蛋白（g/dL） 2.98 ± 0.09 b 3.85 ± 0.19 a 3.87 ± 0.16 a 3.90 ± 0.10 a 0.004
白蛋白（g/dL） 1.22 ± 0.02 1.26 ± 0.01 1.26 ± 0.04 1.27 ± 0.03 0.713
球蛋白（g/dL） 1.76 ± 0.08 b 2.59 ± 0.20 a 2.61 ± 0.17 a 2.64 ± 0.07 a 0.005
葡萄糖（mg/dL） 97.74 ± 2.41 96.96 ± 1.84 97.35 ± 2.52 97.54 ± 2.35 0.995
皮质醇（ng/ml） 36.12 ± 1.73 35.75 ± 2.14 35.63 ± 1.65 35.43 ± 1.42 0.993
总胆固醇（mg/dL） 141.36 ± 2.58 140.08 ± 2.73 142.36 ± 2.21 139.53 ± 4.03 0.904
甘油三酯（mg/dL） 116.67 ± 1.45 118.33 ± 1.76 120.33 ± 6.12 119.33 ± 4.26 0.920
ALT（IU/L） 4.67 ± 0.30 4.68 ± 0.58 4.50 ± 0.41 4.55 ± 0.45 0.988
AST（IU/L） 41.67 ± 0.88 42.33 ± 2.03 42.00 ± 1.73 42.67 ± 2.33 0.982
血尿素氮（mg/dL） 4.21 ± 0.18 4.22 ± 0.34 4.22 ± 0.35 4.24 ± 0.42 0.995
肌酐（mg/dL） 0.25 ± 0.02 0.25 ± 0.03 0.26 ± 0.06 0.27 ± 0.04 0.985
同一行内的数值为平均值 ± 标准误差。上标a、b和c表示P < 0.05的显著性。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。
ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶。

3.4 免疫功能
图3展示了饮食中的甘草和生姜对灰鲻鱼免疫功能标志物的影响。溶菌酶活性在所有添加补充剂的组（D2、D3和D4）中均有所增加（P < 0.05），与未处理组（D1）相比。尽管统计上不显著，但在组合补充组（D4）中观察到了轻微的数值增加。S. agalactiae抑制%在所有处理组中显示出明显的增强趋势。组合补充组（D4）显示出最高的抑制水平（P < 0.05），而单独添加的组（D2和D3）显示出类似的中间水平，这些水平高于基礎组（D1）但低于D4。NBT水平也显示出类似的趋势，组合补充组（D4）显示出最高水平（P < 0.05）。单独添加的组（D2和D3）的NBT活性显著高于未处理组（D1），但低于组合处理组（D4）。

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图3. 60天饮食试验后灰鲻鱼的免疫功能标志物。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。

3.5 抗氧化反应
图4展示了饮食补充对60天后肝脏抗氧化酶和脂质过氧化标志物的影响。超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同处理组之间有所差异（P < 0.05），组合补充组（D4）显示出最高水平。单独添加的组（D2和D3）的SOD水平也高于对照组（D1），尽管仍低于D4。过氧化氢酶（CAT）活性也表现出类似的趋势，D4在所有组中记录的最高活性（P < 0.05）。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性在所有添加补充剂组中增加（P < 0.05），D2、D3和D4的水平相当。此外，丙二醛（MDA）浓度在所有添加补充剂组中降低（P < 0.05），相对于基礎组。

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图4. 60天饮食试验后灰鲻鱼的肝脏抗氧化防御系统和脂质过氧化标志物。SOD（超氧化物歧化酶），CAT（过氧化氢酶），GPx（谷胱甘肽过氧化物酶），MDA（丙二醛）。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。

3.6 肠道微生物群
表5总结了60天后甘草和生姜补充对肠道微生物群组成的影响。所有添加补充剂的饮食（D2、D3和D4）显著降低了总酵母和霉菌计数（TYMC）和总细菌计数（TBC）（P < 0.05），与对照饮食（D1）相比。组合补充剂（D4）的TYMC最低（1.33 ± 0.33 CFU/g × 10^6），而基礎组为4.33 ± 0.33 CFU/g × 10^6）。值得注意的是，所有添加补充剂的组中酸发酵细菌的数量显著增加（P < 0.05），其中组合补充组（D4）的数量最高（16.67 ± 0.88 CFU/g × 10^6），与未处理组（9.00 ± 0.58 CFU/g × 10^6）相比。所有添加补充剂的饮食都对潜在的致病细菌表现出显著的抗菌作用。特别是，Aeromonas sp.、Escherichia coli、Salmonella sp.、Shigella sp.、Staphylococcus sp.和Vibrio sp.的数量在所有处理组中显著减少（P < 0.05）。组合补充剂（D4）通常显示出最强的抗菌效果，尤其是对E. coli（1.00 ± 0.58 CFU/g × 10^6）和Salmonella sp.（1.67 ± 0.33 CFU/g × 10^6），相对于各自的对照值（5.00 ± 0.58和6.00 ± 0.58 CFU/g × 10^6）。所有实验组中未鉴定物种的数量有所增加。

表5. 60天测试饮食后灰鲻鱼肠道菌群的变化。
微生物计数 ?
D1 D2 D3 D4
P值
总酵母和霉菌计数（TYMC） 4.33 ± 0.33 a 2.00 ± 0.58 b 2.33 ± 0.33 b 1.33 ± 0.33 b 0.004
总细菌计数（TBC） 52.00 ± 2.31 a 39.33 ± 0.88 b 37.00 ± 2.89 b 37.33 ± 2.03 b 0.003
酸发酵细菌 9.00 ± 0.58 b 14.67 ± 0.88 a 14.33 ± 0.88 a 16.67 ± 0.88 a 0.001
Vibrio sp. 5.00 ± 0.58 a 2.67 ± 0.33 b 2.33 ± 0.33 b 2.33 ± 0.67 b 0.015
Escherichia coli 5.00 ± 0.58 a 1.33 ± 0.33 b 1.33 ± 0.88 b 1.00 ± 0.58 b 0.006
Aeromonas sp. 6.00 ± 0.58 a 2.67 ± 0.33 b 2.33 ± 0.88 b 2.67 ± 0.88 b 0.019
Salmonella sp. 6.00 ± 0.58 a 2.67 ± 0.67 b 2.00 ± 0.58 b 1.67 ± 0.33 b 0.002
Shigella sp. 4.33 ± 0.88 a 2.00 ± 0.58 b 1.33 ± 0.88 b 1.67 ± 0.67 b 0.045
Staphylococcus sp. 6.67 ± 0.88 a 3.67 ± 0.33 b 3.00 ± 0.58 b 2.33 ± 0.67 b 0.007
Streptococcus sp. 6.00 ± 0.58 a 3.00 ± 0.58 b 3.33 ± 1.20 b 2.00 ± 0.58 b 0.034
未鉴定物种 4.00 ± 1.00 6.67 ± 0.67 7.00 ± 0.58 7.00 ± 2.00 0.296
? 微生物计数以CFU/g × 10^6表示。同一行内的数值为平均值 ± 标准误差。上标表示P < 0.05的显著性。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。
热图分析显示Vibrio sp.、Escherichia coli和Salmonella sp.与TBC之间存在强正相关，表明TBC的增加与这些致病细菌水平的升高有关（图5）。相反，TYMC与有益微生物群体（如酸发酵细菌）之间存在负相关，表明肠道环境中的竞争关系。当微生物群体对饮食处理（D1、D2、D3和D4）进行回归分析时，发现添加补充剂的组中致病细菌显著减少，其中组合补充组（D4）的效果最为明显（图6）。例如，Escherichia coli的数量显著减少（R2 > 0.7，P < 0.01），D4的数量最低。同样，Salmonella sp.和Shigella sp.的数量也呈现类似趋势。有益细菌（如酸发酵细菌）与饮食补充剂有强正相关（R2 > 0.8，P < 0.001），D4中的数量最高。此外，TYMC在所有处理组中均显著下降（R2 > 0.6，P < 0.05），D4的抑制效果最强。

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图5. 肠道微生物计数与饮食补充剂的热图相关性分析。
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图6. Liza ramada的饮食补充剂与肠道微生物计数之间的回归分析。D1：不含补充剂的基礎饮食；D2：基礎饮食 + 甘草（4克/千克）；D3：基礎饮食 + 生姜（10克/千克）；D4：基礎饮食 + 甘草（2克/千克）+ 生姜（5克/千克）。

4. 讨论
本研究的结果表明，饮食中添加甘草和/或生姜可以改善L. ramada的生长状况和饲料利用率。这些结果与之前对多种水产养殖物种的研究一致，包括尼罗罗非鱼（Mohammed等人，2020年）、虹鳟鱼（Bakhtiari Aqmasjed等人，2023年；Zahrei等人，2021年）和普通鲤鱼（Adineh等人，2021年；Fazelan等人，2020年；Meng等人，2022年），其中草药添加剂提高了生长性能。这种改善通常归因于这些添加剂中含有的生物活性化合物，如黄酮类、皂苷和酚类，以及必需营养素（Ahmadifar等人，2019年；Pastorino等人，2018年）。
在处理组中，接受组合补充剂（D4）的鱼显示出最高的体重和SGR，以及最高的FCR。这一结果与先前的研究一致，表明植物源性添加剂可以通过改善消化过程和代谢来增强营养利用和生长（Mohammed等人，2020年；Siregar等人，2024年；Yousaf等人，2024年）。这些改善可能归因于生姜和甘草中生物活性化合物的联合作用，它们可以增强食欲、刺激消化酶活性并改善营养吸收（Husain等人，2021年；Ma等人，2021年）。这一观察结果与尼罗罗非鱼的研究一致，其中生姜和甘草提高了饲料摄入量和生长性能（Mohammed等人，2020年）。此外，对Litopenaeus vannamei和Oreochromis mossambicus的研究也表明，生姜和甘草可以显著提高饲料效率和生长指标（Chen等人，2010年；Immanuel等人，2009年）。单独添加生姜（D3）或甘草（D2）也改善了生长性能，尽管效果不如组合处理。每种补充剂的具体影响可以归因于其独特的生物活性成分，例如生姜中的姜辣素和甘草中的甘草苷，这些成分能够独立促进营养物质的消化和代谢活动（Nya & Austin, 2009; Pastorino et al., 2018）。所有组别的存活率都很高（97.78%–100%），且不同处理组之间没有显著差异，这证实了甘草和生姜补充剂不会对鱼类的生存能力产生负面影响。同样，生物测量指标没有显著差异也进一步支持了这些饮食干预措施的安全性（Teubner et al., 2015）。先前的研究已经强调了植物提取物通过提高饲料适口性、促进营养吸收和刺激有益肠道微生物群等方式来增强生长性能的能力（Barad et al., 2024; Wang et al., 2024）。本研究的发现表明，在饮食中加入甘草和生姜显著提升了消化酶的活性，尤其是脂肪酶和蛋白酶的活性。组合处理组（D4）的酶活性在实验组中最高，表明联合补充具有增强效果，而单独补充（D2和D3）也与对照组（D1）相比有显著改善。这些结果表明，甘草和生姜作为功能性饲料添加剂具有潜力，可以增强脂质和蛋白质的消化，从而提高鱼类的营养利用和生长性能（Abdel-Tawwab & El-Araby, 2021; Bakhtiari Aqmasjed et al., 2023）。负责淀粉消化的淀粉酶活性在实验鱼群中没有变化（P > 0.05），表明甘草、生姜及其组合没有影响碳水化合物的消化。这与Gupta等人（2021）的观察结果一致，他们发现由于酶对饮食中碳水化合物水平的适应，鱼类的淀粉酶活性通常不受植物提取物的影响。同样，Ghosh等人（2024）也注意到草药补充剂对淀粉酶活性的影响很小，可能是由于饮食中的碳水化合物水平足够以及鱼类本身具有维持基线酶活性的能力。所有组别中稳定的淀粉酶水平表明，观察到的生长和营养利用的改善是由脂质和蛋白质消化的增强所驱动的，而不是碳水化合物代谢。

脂肪酶活性对于脂质消化至关重要，在添加了甘草和生姜的鱼群中更高，其中组合组（D4）的活性最高。甘草中的甘草苷和黄酮类化合物以及生姜中的姜辣素已知可以刺激消化酶的产生，从而增强脂肪酶活性（Mamedov & Egamberdieva, 2019; Mao et al., 2019）。D4中的组合效应可能是由于这些生物活性化合物的互补作用，正如Wei等人（2022）所展示的，他们在水产饲料中混合使用草药比单独使用补充剂更能有效提升消化酶活性。蛋白酶活性对于蛋白质消化同样重要，D4组的活性最高，并且与对照组相比单个补充组也有显著提升。甘草和生姜中的黄酮类化合物及姜辣素可能刺激消化器官分泌更多的蛋白酶（Ahmad et al., 2024; Yu et al., 2020）。D4中的组合补充可能放大了这种效果，促进了高效的蛋白质消化。

脂肪酶和蛋白酶活性的显著增强，尤其是在D4组中，突显了甘草和生姜在提高灰鲻鱼消化效率方面的潜力。增强的脂肪酶活性支持脂质代谢，这对于能量产生和脂肪酸吸收至关重要，而增加的蛋白酶活性则有助于更好的蛋白质水解和氨基酸的利用，从而促进生长。这些发现与先前关于植物提取物对鱼类消化酶活性积极影响的研究结果一致（Gupta et al., 2021; Mohammed et al., 2020; Yousaf et al., 2024）。这些发现也与Adineh等人（2021）的研究结果一致，他们报告称喂食5克/千克甘草的普通鲤鱼的蛋白酶和脂肪酶活性显著增加，以及Naliato等人（2021）的研究结果，他们观察到喂食10克/千克生姜的尼罗罗非鱼的脂肪酶活性增强。这些结果在不同分类群的鱼类中的一致性强化了这样一个观点：甘草和生姜的酶效应主要是通过其生物活性化合物介导的，而不是特定于物种的机制。

组织学评估显示，补充了甘草和生姜的鱼类的肠道结构得到了改善。在所有补充组中，绒毛更长，表面积更大，杯状细胞密度也比未处理组增加，其中组合补充组（D4）的改善最为明显。这些结果与早期研究一致，表明植物提取物通过促进细胞增殖和增强黏膜免疫反应来支持肠道健康（Caipang et al., 2021; Firmino et al., 2021; Torrecillas et al., 2019）。杯状细胞密度的增加尤为重要，因为杯状细胞分泌黏蛋白，可以保护肠道内壁并促进营养吸收（Hoseinifar et al., 2019）。绒毛的延长和吸收表面积的扩大增强了营养吸收，这可以直接转化为更好的生长性能和饲料效率。富含甘草苷和姜辣素等生物活性化合物的甘草和生姜可能通过其抗炎和抗氧化特性促进了这些结构上的改善，从而促进了组织修复和上皮完整性的增强（Tiwari et al., 2018）。

肝脏组织的组织学分析显示，补充组的肝实质组织有序，糖原沉积增加，尤其是在D4组中。糖原作为能量储备，其沉积的增加反映了碳水化合物代谢和储存的增强。虽然仅凭H&E染色无法明确区分富含糖原的液泡和脂质滴，但各组之间血清胆固醇、甘油三酯、ALT和AST没有显著差异，这排除了病理性的脂质积累，观察到的液泡化模式被解释为与糖原沉积一致。未来的研究建议通过Periodic Acid-Schiff (PAS) 或 Oil Red O染色来明确这一组织化学差异。观察到的改善表明，甘草和生姜的补充可能通过减少氧化应激和支持肝细胞再生来增强肝脏健康（Abdel-Tawwab & El-Araby, 2021; Bakhtiari Aqmasjed et al., 2023; Mohammed et al., 2020）。这些植物提取物的肝保护作用可以归因于它们的生物活性成分，这些成分调节氧化途径并保护肝组织免受损伤（Shehata et al., 2022）。

生化分析是评估鱼类营养状况、整体健康状况及其对外部环境适应性的关键工具（Burgos-Aceves et al., 2019）。当前研究显示，所有补充组（D2、D3和D4）的总蛋白和球蛋白含量与基线组相比有显著提升（P < 0.05）。这种改善可能与肝脏功能的增强有关，鉴于肝脏在蛋白质合成中的核心作用，表明D2、D3和D4的饮食具有肝保护作用。此外，D2、D3和D4补充组中观察到的总蛋白和球蛋白水平的升高表明处理组的免疫功能有所改善（Nazeemashahul et al., 2024, pp. 119–135）。总蛋白是鱼类蛋白质代谢和整体健康状况的关键指标。总蛋白和球蛋白水平的升高表明蛋白质合成和免疫反应的增强，因为球蛋白是鱼类先天免疫的关键组成部分（Shehata et al., 2025）。组合补充组（D4）的球蛋白水平最高，表明甘草和生姜在调节免疫功能方面具有联合效应。这些草药的免疫增强作用已有充分记录，先前的研究报道甘草中的甘草苷和生姜中的姜辣素可能刺激免疫球蛋白和细胞因子的产生（Dabas et al., 2023; Nazeemashahul et al., 2024, pp. 119–135），尽管灰鲻鱼中的具体分子机制需要通过基因表达和蛋白质水平验证。所有处理组中葡萄糖、皮质醇、胆固醇、甘油三酯和肝/肾功能标志物的稳定性证实了甘草和生姜补充的非毒性。这一发现非常重要，因为它表明这些添加剂可以在不引起生理压力或代谢失衡的情况下改善鱼类健康（Mohammed et al., 2020）。

补充组中免疫功能的增强，尤其是在D4组中，突显了甘草和生姜的免疫调节潜力。溶菌酶活性的显著增加、S. agalactiae的抑制以及NBT活性的增强表明了强大的先天免疫反应。溶菌酶是先天免疫中的重要酶，其活性显著升高，反映了病原体抵抗力的提高（Gu et al., 2020; Magnadóttir, 2006）。D4组中S. agalactiae的抑制和NBT活性的增强进一步支持了组合补充的免疫刺激作用。这些发现与先前的研究一致，表明植物提取物可以刺激活性氧（ROS）和其他抗菌分子的生成，从而增强鱼类对感染的防御（Alam et al., 2024; Montero et al., 2024）。

本研究中观察到的抗氧化反应强调了甘草和生姜在减轻氧化应激中的作用。SOD、CAT和GPx活性的显著升高，以及MDA水平的下降表明抗氧化防御系统的改善（Elabd et al., 2016; Shehata, Shahin, Elmaghraby, Alhoshy, Soliman, et al., 2024）。这些酶对于清除ROS和保护细胞结构至关重要，而MDA水平的下降反映了脂质过氧化的减少和氧化损伤的减轻（Abo-Samaha et al., 2022; Xu et al., 2025）。D4组中更强的抗氧化反应表明甘草和生姜在对抗氧化应激方面具有联合效应，这是水产养殖系统中常见的挑战。这一发现与先前的研究一致，表明植物提取物通过其生物活性化合物增强抗氧化酶活性（Ahmadifar et al., 2019; Bakhtiari Aqmasjed et al., 2023; El Basuini, Zaki, et al., 2024; Fazelan et al., 2020）。

肠道微生物群的组成对于支持鱼类整体健康和优化营养吸收至关重要（Banerjee & Ray, 2017; Nayak, 2010）。所有补充组中TBC和TYMC的减少应谨慎解读，因为TBC包括有益细菌和潜在的病原菌。然而，特定病原菌（如Vibrio sp.、E. coli、Salmonella sp.、Staphylococcus sp.和Streptococcus sp.）的同时减少以及有益酸发酵细菌数量的增加表明，甘草和生姜具有选择性的抗菌作用，优先抑制病原微生物同时支持有益肠道微生物群（Kumar et al., 2022; Masoumian & Zandi, 2017）。这种选择性调节而不是广谱抗菌作用代表了植物补充剂在促进肠道健康方面的一个关键优势。补充组中，特别是D4组中酸发酵细菌数量的增加进一步强调了甘草和生姜的好处。这些有益细菌可能通过产生短链脂肪酸（SCFAs）来改善肠道健康，先前的研究已经证明SCFAs可以增强营养吸收和免疫反应（Kumar et al., 2022）。未来的研究需要采用代谢组学分析来确认这种模式下的SCFA产生。值得注意的是，包括大肠杆菌、Vibrio sp.和Salmonella sp.在内的病原菌的显著减少支持了生姜中的姜辣素、黄酮类化合物和甘草苷的抗菌效果（Ahmad et al., 2024; Hussein, Khattak, et al., 2023）。热图分析提供了额外的见解，显示病原菌（如Vibrio sp.、E. coli）与TBC之间存在强正相关，而与有益微生物种群呈负相关。这些发现表明甘草和生姜促进了有利于有益微生物的竞争性肠道环境（Mega et al., 2021）。我们研究中观察到的病原菌的选择性减少与最近关于相关硬骨鱼类的报告一致。El Basuini, Zaki等人（2024）报告称，添加纳米姜黄素的尼罗罗非鱼的病原菌数量减少，有益肠道微生物群增强，姜黄素的机制与姜辣素相似。同样，Hussein, El Basuini等人（2023）证明，膳食中的鼠尾草（Salvia officinalis）减少了Vibrio sp.和E. coli的数量，同时增强了欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）中的乳酸菌数量，这对适应海洋环境的灰鲻鱼具有生态相关性。本研究中使用的培养依赖方法提供了关于目标病原菌和有益细菌群体的可靠数据，尽管它只捕捉到了整个肠道微生物组的一小部分。未来的研究应采用下一代测序技术，以更全面地了解甘草和生姜如何调节L. ramada的整个微生物组。

综上所述，本研究的发现表明，甘草（2克/千克）和生姜（5克/千克）的组合在多个生理维度上比单独使用任一补充剂都能取得更理想的效果，并且所需的剂量仅为各自单独剂量的一半。这具有重要的实际意义：组合低剂量配方可能降低投入成本，同时提供与全剂量单独补充相当或更好的生物学效果。然而，必须承认几个关键的局限性。首先，这种依赖培养的微生物学方法限制了对肠道微生物群评估的全面性。其次，在D4组观察到的肝脏空泡现象需要通过差异染色（PAS或Oil Red O）来确认，以准确区分糖原和脂质积累。第三，由于缺乏病原体挑战实验，因此无法得出关于疾病抵抗力的结论。未来的研究应该解决这些局限性，并且需要在半集约化水产养殖条件下进行现场规模的验证研究，才能推荐这些添加剂用于商业用途。

5. 结论

本研究的结果表明，甘草和生姜的补充，特别是联合使用，能够改善灰鲻鱼的生长、消化酶活性、免疫反应、抗氧化活性、肠道和肝脏组织健康以及肠道微生物群的组成。值得注意的是，联合补充（D4组）显著减少了病原菌的数量，包括大肠杆菌、沙门氏菌属和弧菌属，同时促进了肠道中有益的酸发酵细菌的生长。与单独补充相比，联合补充（2克/千克甘草和5克/千克生姜；D4组）在多个参数上表现更优。肠道结构的改善、消化酶活性的提高以及生化和抗氧化特性的提升，突显了这些植物提取物在促进鱼类健康和生产力方面的价值。重要的是，甘草和生姜的补充对存活率或重要器官功能没有产生负面影响，这证明了它们作为饲料添加剂的安全性。这些发现共同支持将甘草（2克/千克）和生姜（5克/千克）纳入灰鲻鱼饲料中，作为一种实用、经济且生物安全的策略，以在标准集约化养殖条件下提高生产性能和整体健康状况。未来的研究应该探索几个方向，以进一步验证现有发现。需要进行病原体挑战实验，以确认观察到的免疫和微生物改善是否能在受控感染条件下转化为对常见水产养殖病原体的更强抵抗力。应用不依赖培养的方法，特别是16S rRNA扩增子测序或鸟枪法宏基因组学，将能够更全面地描述肠道微生物组，并能够确认观察到的微生物调节的选择性特征，这是依赖培养的方法所无法实现的。最后，通过分析L. ramada中免疫、抗氧化和代谢途径的基因表达，阐明甘草和生姜联合作用的分子机制，对于未来的研究具有特别重要的价值，因为它将提供对观察到的生理反应的机制性见解，并支持在水产养殖中合理设计植物提取物补充策略。

**作者贡献声明**

Mohammed F. El Basuini：概念化、方法学、软件、验证、正式分析、研究、资源管理、数据管理、可视化、监督、初稿撰写、审稿与编辑。

Akram Ismael Shehata：概念化、方法学、软件、验证、正式分析、研究、资源管理、数据管理、可视化、监督、初稿撰写、审稿与编辑。

Majeeda Rasheed：正式分析、数据管理、审稿与编辑。

Minerva Abdullah Galal：方法学、正式分析、研究、可视化。

Abdelaziz M. El-Hais：方法学、验证、正式分析、研究、资源管理、数据管理。

Ali A. Soliman：方法学、研究、资源管理、数据管理、可视化。

Islam I. Teiba：概念化、方法学、软件、验证、正式分析、研究、资源管理、数据管理、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。

Mayada Alhoshy：方法学、软件、验证、正式分析、研究、资源管理、数据管理、可视化。

Ahmed A. Gabr：方法学、软件、研究、资源管理、数据管理、可视化。

Mahmoud S. Gewaily：方法学、数据分析、审稿与编辑。

Eslam Tefal：方法学、软件、验证、正式分析、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑。

**数据可用性声明**

数据可应相应作者的要求提供。

**伦理声明**

鱼类的维护和处理遵循埃及国王萨尔曼国际大学沙漠农业学院伦理与动物福利委员会制定的伦理指南（批准编号KSIU/2025/DA-6），符合ARRIVE指南v2.0。

**关于科学写作中生成式AI的声明**

作者声明，在本手稿的撰写过程中没有使用任何生成式AI或AI辅助技术。