时机至关重要：早期营养强化可减少孵化场饲养的银鲑鱼耳石的畸形现象

《Aquaculture》：Timing matters: Early enrichment reduces vateritic otolith deformities in hatchery-reared coho salmon

　　利·P·加夫尼（Leigh P. Gaffney）| 艾玛·B·波拉德（Emma B. Polard）| 克洛伊·克雷默（Chloe Kraemer）| 莉迪亚·N·沃尔顿（Lydia N. Walton）| 加思·A·科弗尼顿（Garth A. Covernton）| 威尔·杜吉德（Will Duguid）| 乔斯琳·朱普-克利夫（Joscilyn Jupp-Cliff）| 弗朗西斯·胡安内斯（Francis Juanes）
维多利亚大学生物系，芬纳蒂路3800号，维多利亚，BC V8P 5C2，加拿大

**摘要**
瓦特石耳石（vateritic otoliths）是一种异常的碳酸钙晶体，它们会替代鱼类内耳中的文石（aragonite）。这种晶体在人工养殖的鲑鱼中出现的频率远高于野生鲑鱼，并且与听力受损、逃避捕食者的能力下降以及释放后存活率降低有关。由于人工养殖和水产养殖项目对食品供应和种群增强越来越重要，因此寻找能够减少瓦特石耳石形成的实际干预措施成为当务之急。我们通过两年的生产规模实验，研究了物理环境丰富化（physical enrichment）和养殖密度（stocking density）是否会影响人工养殖的银鲑（Oncorhynchus kisutch）中瓦特石耳石的普遍性和覆盖率。在第一年，无论是孵化期间还是孵化后的养殖阶段，环境丰富化都显著降低了瓦特石耳石的发病率（第400天时，富集处理组的发病率仅为1%至2%，而对照组为45%至67%；p < 0.001）。在出现瓦特石耳石的鱼中，其覆盖率随时间显著增加，对照组达到66%至70%，富集处理组为59%至63%，但两组之间的差异不显著。第二年的交叉设计进一步证实，孵化期间的环境丰富化具有最强且最持久的效果。初次放入池塘时，对照组鱼的发病率最高（65%），其次是对照组与富集处理组混合饲养的鱼（33%），而富集处理组内部或富集处理组与对照组混合饲养的鱼发病率最低（8%至11%；p < 0.001）。养殖密度的影响较弱且呈非线性关系，中等密度下的发病率最高（38%至75%），显著高于低密度或高密度组（p < 0.01）。耳石的不对称性与水箱水流方向相关，这种相关性通过平衡各水箱的水流方向来控制单向游泳的影响。总体而言，早期环境丰富化是减少瓦特石耳石普遍性和覆盖率的最有效方法，这为改善鲑鱼的感官健康和福利提供了可扩展的人工养殖干预措施。

**1. 引言**
人工养殖和水产养殖在全球食品系统中发挥着越来越重要的作用，它们支持海产品生产和种群增强计划，被广泛认为是满足日益增长的需求同时减轻对野生鱼类种群压力的关键策略（Troell等人，2014；Verdegem等人，2023）。除了对食品安全的贡献外，这些方法对于受栖息地丧失、过度捕捞和气候变化影响的鱼类种群的恢复也至关重要（Bradford和Irvine，2000；Naish等人，2007；Lorenzen等人，2012）。因此，基于人工养殖的项目的长期可持续性不仅取决于生产产出，还取决于人工养殖鱼类的健康、福利和功能表现，尤其是那些计划释放到自然生态系统中的鱼类（例如，Brown和Laland，2001；Brown和Day，2002；Braithwaite和Salvanes，2005；Braithwaite和Salvanes，2010）。因此，人们越来越关注人工养殖环境如何影响鱼类释放后的生存和表现相关特征的发展（例如，Huntingford等人，2006；Johnsson等人，2014；Zhang等人，2023）。

与人工养殖环境相关的一个新兴挑战是耳石畸形的发生。耳石是位于硬骨鱼类内耳中的成对碳酸钙结构，在听觉、平衡和加速度检测中起着关键作用（Popper和Lu，2000；Popper等人，2005）。在三种耳石类型——矢状耳石（sagittae）、拉皮利耳石（lapilli）和星状耳石（asterisci）中，矢状耳石通常最大，主要负责鲑鱼的听觉功能（Carlstr?m，1963；Fay和Popper，1999；Popper和Lu，2000）。这些结构通过每日积累碳酸钙而持续生长（Campana和Thorrold，2001），主要以文石的形式存在（Degens等人，1969）。然而，在某些个体中，文石部分或完全被瓦特石耳石替代，后者是一种密度更低、更脆弱、更透明的碳酸钙多形体，会改变耳石的结构和功能（Tomás和Geffen，2003；Oxman等人，2007；Reimer等人，2017）。

人工养殖的鲑鱼中瓦特石耳石的发病率远高于野生种群，据报道在养殖鱼类中高达50%至80%，而在野生种群中低于10%（Sweeting等人，2004；Reimer等人，2016；Reimer等人，2017；Austad等人，2021；Delaval等人，2021；Quindazzi等人，2023；Gaffney等人，2025a）。这些畸形与听力受损（Oxman等人，2007；Reimer等人，2016）、逃避捕食者的能力下降（Vignon和Aymes，2020）以及释放后存活率降低（Austad等人，2021；Lewis等人，2022；Gaffney等人，2025b）有关，这对鱼类福利和依赖人工养殖补充的鲑鱼渔业来说是一个问题。尽管导致瓦特石耳石形成的确切机制尚不清楚，但人工养殖环境中常见的慢性压力因素——如高养殖密度（Austad等人，2021）、处理操作（Bowen等人，1999）、机械性创伤（Strong等人，1986）以及结构复杂性的缺乏（Gaffney等人，2025b）——越来越被认为是可能的促成因素。因此，了解瓦特石耳石的普遍性和受影响耳石的覆盖率对于评估其影响至关重要。

矢状耳石的发育始于胚胎早期，并持续整个鱼类生命周期（Morales-Nin，1992；Vignon，2018）。虽然瓦特石耳石形成的确切时间尚不确定，但早在幼体阶段就已观察到（Vignon，2018），并且可能在生命周期的任何阶段发生（Vignon，2018）。由于一旦开始形成，瓦特石耳石的变化是不可逆的（Tomás和Geffen，2003），因此识别触发或防止其形成的环境条件对于改善人工养殖鲑鱼的长期感官健康、福利和生态适应性至关重要。

最近的研究，包括我们自己的研究，表明即使是对人工养殖环境的微小改变也能影响瓦特石耳石的发病率。例如，我们发现改变水箱水流方向（一种可以改变鱼类游泳行为并可能减少环境单调性的丰富化策略）显著降低了幼年银鲑（Oncorhynchus kisutch）中瓦特石耳石的发生率（Gaffney等人，2025b）。这一发现支持越来越多的证据，表明环境压力促进了瓦特石耳石的发展（例如，Oxman等人，2007；Reimer等人，2017；Austad等人，2021；Delaval等人，2021），并且相对简单的养殖条件修改可能有助于减轻其发生。

另外两个人工养殖变量——物理环境丰富化和养殖密度也可能起到重要作用。与生活在结构复杂环境中且密度较低的野生幼鱼相比（Brockmark等人，2007），人工养殖的鱼类通常在较为简单的环境中以更高的密度饲养（Brockmark等人，2007）。已知这些条件会影响行为、应激生理和表现（例如，Brown和Laland，2001；Ellis等人，2002；Huntingford等人，2006；Turnbull等人，2008；Brockmark等人，2010；N?slund和Johnsson，2016；Arechavala-Lopez等人，2022），但它们在促进耳石畸形方面的作用仍需进一步研究。

物理环境丰富化，包括添加隧道、基质和人工植物，已被证明可以减少鲑鱼的攻击性，支持认知发展，并提高释放后的存活率（参见N?slund和Johnsson，2016以及Arechavala-Lopez等人，2022的综述）。这些干预措施也越来越被认为是提高人工养殖鲑鱼福利和适应性的工具，尤其是在将其释放到野外进行保护或种群增强时（例如，Berejikian等人，2000；Braithwaite和Salvanes，2005；Braithwaite和Salvanes，2010；Lorenzen等人，2012；Hyv?rinen和Rodewald，2013；Johnsson等人，2014；Mes等人，2019）。然而，大多数关于丰富化的研究以及关于瓦特石耳石形成的研究都集中在鱼类从孵化系统转移到养殖水箱之后的阶段。这是一个关键限制，因为矢状耳石的形成实际上早在胚胎阶段就开始了（Geffen，1983；Vignon，2018；Morales-Nin，2000）。这引发了一个关键问题：在放入池塘之前的发育阶段丰富化环境是否可以减少瓦特石耳石的发病率和覆盖率？

标准的孵化系统，如Heath托盘，环境单调且水流均匀（Leitritz和Lewis，1980；Reiser等人，2019）。这些托盘中的鱼苗依赖卵黄囊获取营养，但由于卵黄囊较大且呈圆形，缺乏结构支撑，它们常常平躺在托盘网上（Reiser等人，2019）。由于鲑鱼幼苗有强烈的保持直立姿势的倾向，这种不稳定性会引发反复的运动以“纠正”自己的位置（Marr，1963；Reiser等人，2019）。这些努力可能耗费大量能量（Marr，1963；Reiser等人，2019），尤其是在这个脆弱的发育阶段（Vignon，2018）。相比之下，自然砾石产卵场提供了裂缝和表面，可以物理支撑鱼苗，使它们无需费力就能保持直立，同时允许水流通过（Reiser等人，2019）。这种结构稳定了它们的位置，减少了维持姿势所需的能量和压力（Marr，1963；Reiser等人，2019）。这些早期生活压力因素可能会干扰耳石的发育，然而在孵化期间通过结构丰富化来减轻瓦特石耳石等畸形的可能性却鲜有关注。

养殖密度，即单位体积内的鱼类数量，是人工养殖中的另一个关键因素。高密度已知会增加皮质醇水平，降低鳍部状况，抑制免疫反应，并损害抗捕食行为（例如，Ellis等人，2002；Huntingford等人，2006；North等人，2006；Adams等人，2007；Turnbull等人，2008；Liu等人，2015；Sveen等人，2018）。尽管这些对福利的影响已有充分记录，但养殖密度与瓦特石耳石形成之间的关系仍大多未被探索。

在这项研究中，我们调查了物理环境丰富化和养殖密度如何影响人工养殖银鲑中瓦特石耳石的发育。为了研究物理环境丰富化的作用，我们将鱼卵和鱼苗在富集的人工砾石产卵场或标准的贫瘠Heath托盘（对照组）中孵化。首次放入池塘后，幼鱼在富集水箱（含有隧道、人工植物和基质）或贫瘠水箱（对照组）中饲养。在第一年，处理条件在各个阶段保持一致（富集组之间或对照组之间）。在第二年，我们采用了交叉设计来测试孵化前、孵化后或综合丰富化处理对瓦特石耳石发病率的影响。

为了独立研究养殖密度的作用，我们还进行了另一项平行实验，其中鱼类在贫瘠的Heath托盘和不同密度的水箱中饲养。通过整合两项实验的结果，本研究在现有证据的基础上进一步证明了物理环境丰富化和养殖密度管理对福利的益处，同时解决了一个关键知识空白：早期养殖条件如何影响瓦特石耳石的普遍性和覆盖率。重要的是，所有试验都在一个完全运营的鲑鱼养殖场进行，使用生产规模的设施，确保我们的发现直接适用于实际的人工养殖实践。了解瓦特石耳石形成的时间和方式对于改善人工养殖鲑鱼的福利、感官功能和生态表现至关重要。

**2. 方法**
2.1. 伦理声明
所有实验程序均获得了维多利亚大学动物护理委员会的批准（协议编号：2021–009），并遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）关于研究中鱼类护理和使用的指南。
2.2. 研究地点和一般养殖程序
所有实验都在加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华岛南部的Goldstream养殖场进行（48.463318°N，123.578790°W），连续两年：第一年（2022年11月至2023年4月）和第二年（2023年11月至2024年4月）。环境丰富化和养殖密度实验在这两年内同时进行，遵循相同的时间表。

在每年的实验中，我们在11月初从回游的银鲑中收集配子，在现场进行受精，并在自然温度条件下使用来自邻近水库的河水进行孵化。孵化期间的平均水温为4.5 ± 1.8°C。

孵化后和卵黄囊吸收完成后，两组实验的鱼苗都被转移到圆形的户外流水式水箱中进行后续养殖。首次放入池塘的时间分别为2022年4月1日（第一年）和2023年5月15日（第二年），这标志着实验的第0天。所有水箱都通过连续流水接收来自Goldstream河的水，并暴露在自然光和光照周期下。在放流后的时期，两年内的水温平均为10.6 ± 3.4°C。每个水箱（无论实验组别如何）在整个试验期间都被指定一个一致的水流方向，要么仅顺时针流动，要么仅逆时针流动。水流方向不是实验处理的一部分，而是为了控制在水箱中持续单向游动所带来的已知影响而故意平衡的。先前的研究表明，顺时针与逆时针水流可能会影响文石（vaterite）形成的位置，并增加暴露在水箱外侧的耳石（otoliths）上文石的形成（Gaffney等人，2025b）。水流速度被标准化为每秒一到两个鱼体长度，并使用手持式流量计每周进行测量。水质参数，包括温度、溶解氧、pH值和氨氮（ammonia-N），由孵化场工作人员每天监测。水箱每周通过虹吸和刷洗来清除未吃掉的饲料和废物。所有实验的喂食方案都是相同的。鱼在放流后的第二天开始进食。在第一个月里，它们通过自动喂食器连续喂食商业颗粒饲料（Bio-Oregon，美国华盛顿州朗维尤；www.bio-oregon.com）。之后，每天手动喂食一次，直到鱼吃饱，随着鱼的成长逐渐调整颗粒的大小。每个月从每个水箱中随机抽取100条鱼进行整体称重，以监测其生长情况。在整个孵化和放流后的饲养期间，所有水箱的死亡率都进行了每日监测。总体存活率很高，从首次放流到释放的累积死亡率低于2%，孵化期间的死亡率也类似且相当。在不同富集处理、放养密度处理或水流方向之间没有观察到一致的差异。

2.3 实验设计
2.3.1 富集实验
富集实验测试了在孵化和放流后饲养期间物理富集对文石状矢状耳石（vateritic sagittal otoliths）发育的影响。这两个生命阶段的富集是独立操作的，从而产生了四种可能的富集处理组合：两个阶段都不进行富集（对照-对照）、仅在放流后进行富集（对照-富集）、仅在孵化期间进行富集（富集-对照）以及在两个阶段都进行富集（富集-富集）。
在孵化期间，所有鱼卵最初都在标准的Heath托盘中在典型的孵化场条件下饲养。在眼点阶段（eyed stage），鱼卵要么留在托盘中（对照；图1a），要么转移到定制的人工产卵床（enriched；图1b）中。Heath托盘（长88.9厘米×宽45厘米×深13厘米；MariSource，Legend Grands Inc.，美国华盛顿州伯林汉姆；www.marisource.com）是垂直堆叠的孵化器，提供层流但没有任何基质。相比之下，人工产卵床是约1500升的金属流式孵化器（长215.9厘米×宽88.9厘米×深88.9厘米），里面装有约50厘米高的干净、圆形的河石（直径2-20厘米），这些河石来自Goldstream河，旨在模拟自然产卵环境的物理和水力条件。鱼卵从眼点阶段一直保持在各自的孵化系统中，直到孵化完成和卵黄囊吸收完毕，之后幼鱼被转移到饲养水箱中。这一时期（从眼点出现到首次放流）在两年中都持续了大约四个月（第一年为2021年12月至2022年4月，第二年为2023年1月至5月）。

2.3.2 放养密度实验
放养密度实验测试了放流后饲养密度对文石状矢状耳石发育的影响。该实验在两年中都以相同的方法进行。每年的鱼都来自与环境富集实验相同的受精卵批次。具体来说，它们在相同的对照Heath托盘中孵化，然后在首次放流时被分配到不同的密度处理水箱中。
在首次放流时，幼鱼被转移到要么是空无一物的（图1c）要么是经过富集的（图1d）饲养水箱中。所有的饲养都在四个相同的圆形水箱中进行（容量10,000升，直径366厘米，颜色为浅灰色；Pacific Rim Aqua Supplies）。富集水箱配备了两个水平放置的200升（220厘米×125厘米）塑料桶，作为隧道，提供庇护所并鼓励游泳和隐藏行为（图1d）。此外，每个富集水箱中还放置了四个150厘米长的人工植被结构。这些结构由绿色防水布切割成阔叶形状，用海洋级绳索固定在水箱底部的混凝土块上（图1d）。这些结构在水中自由漂浮和摇摆，同时保持固定（图1d），模拟水生植被，促进探索、避难和使用环境的行为。空无一物的对照水箱没有任何结构元素，符合标准的孵化场饲养实践（图1c）。如2.2节所述，水流方向在水箱之间是平衡的，以控制单向游动的影响，并不作为实验处理的一部分。
在第一年，实施了两种富集处理组合。在Heath托盘中孵化的幼鱼被转移到两个空无一物的饲养水箱中（图1c；对照-对照），而在人工产卵床中孵化的幼鱼被转移到两个富集水箱中（图1d；富集-富集）。每种富集处理组合都在两个仅在水流方向上不同的水箱中实施，以控制单向游动的影响。每个水箱在首次放流时接受了2000条幼鱼。
在第二年，所有四种富集处理组合都采用了交叉设计。在Heath托盘中孵化的幼鱼在一个空无一物的水箱（图1c；对照-对照）和一个富集水箱（图1d；对照-富集）中饲养，而在人工产卵床中孵化的幼鱼在一个空无一物的水箱（图1c；富集-对照）和一个富集水箱（图1d；富集-富集）中饲养。与第一年一样，水流方向在水箱之间是平衡的，并不作为实验处理的一部分。每个水箱在首次放流时接受了2000条幼鱼。

2.4 采样和耳石分析
在研究的两年中，对环境富集和放养密度实验都进行了采样。每年在四个时间点对鱼进行采样，这些时间点与季节相匹配：首次放流（第一年：2022年4月1日；第二年：2023年5月15日）、夏末（第一年：2022年9月12-14日；第二年：2023年8月28-29日）、初冬（第一年：2022年12月6-11日；第二年：2023年12月11日）和春季释放（第一年：2023年4月24日；第二年：2024年4月29日）。在首次放流时，从每个孵化器（Heath托盘或人工产卵床）中收集20条鱼，以捕捉水箱饲养前的初始条件。在每个后续时间点（夏末、初冬、春季释放），从两个实验的每个水箱中随机抽取10条鱼进行采样。所有采样的鱼都通过缓冲乙醇浸泡（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；www.fishersci.com）进行安乐死，然后进行颈部切割，随后在-20°C下冷冻，以便运输到维多利亚大学（UVic）进行处理。在春季释放时，所有剩余的鱼被释放到Goldstream河中，标志着实验的结束。
在UVic实验室，采样的鱼被解冻，测量其叉长（±1毫米）和湿重（±0.01克），然后提取矢状耳石，用去离子水冲洗并干燥。在两年中，耳石都按照标准化协议进行准备和成像（Gaffney等人，2025a，Gaffney等人，2025b）。具体来说，耳石首先被短暂浸入Super-Q去离子水中（MilliporeSigma，美国马萨诸塞州伯灵顿；www.emdmillipore.com），然后底面朝下放置在培养皿中，并在Olympus SZX16立体显微镜下观察（Olympus，东京新宿；www.olympus-global.com）。使用Olympus DP26相机和CellSens Standard软件（Olympus，东京新宿；www.olympus-global.com）以16倍放大率（3.6 × 3.6微米/像素分辨率）拍摄整个耳石的图像。损坏或破裂的耳石被排除在进一步分析之外。
对于每张耳石图像，使用Adobe Photoshop 2020（Adobe Inc.，美国加利福尼亚州圣何塞；www.adobe.com）对矿物成分进行分类。使用快速选择工具（Quick Selection Tool），根据外观手动勾画文石（不透明白色）和文石（透明无色）的区域，并分别用蓝色和橙色突出显示。然后使用一个自定义的Python脚本（Python Software Foundation，美国特拉华州威尔明顿；www.python.org）通过量化每张图像中橙色像素与蓝色像素的比例来计算文石的覆盖率。如果耳石中没有文石（覆盖率0%），则将其分类为文石质（A）；如果检测到任何文石（覆盖率>0%），则分类为文石质（V）。耳石对进一步根据左右矢状耳石的矿物成分进行分类：AA（两个耳石都是文石质）、VV（两个耳石都是文石质）、AV（左耳石是文石质，右耳石是文石质）或VA（左耳石是文石质，右耳石是文石质）。成分相同的耳石对被分类为对称的，而成分不同的耳石对被分类为不对称的。这种分类方法在四位对处理组不知情的技术人员之间进行了可靠性测试，结果显示观察者之间的偏差在±5%以内。计算了每个水箱、处理组和时间点的每种耳石对类型（AA、VV、AV、VA）的比例，并分别报告了左右耳石的文石覆盖率。
总共在第一年分析了249对来自富集实验的耳石对，在第二年分析了264对和265对。

2.5 统计分析
所有统计分析都是使用R版本4.2.3（R Core Team，2022）进行的。为了评估耳石文石覆盖率随时间的变化，我们使用“glmmTMB”包（Brooks等人，2017）拟合了零膨胀的贝塔广义线性混合效应模型（GLMMs）。这些模型的条件部分假设了一个贝塔分布，适用于介于0和1之间的连续比例（不包括0和1）。由于文石覆盖率数据包含大量零值（没有文石的鱼），我们加入了一个零膨胀组件，单独建模观察值为超额零的概率。这样，模型同时考虑了（1）没有文石的概率和（2）有文石的鱼中耳石表面被文石覆盖的比例。
个体鱼是观察单位，使用混合效应模型考虑了水箱级别的非独立性。将鱼ID嵌套在水箱-年份组合中作为随机效应，允许我们在考虑同一水箱中鱼的共享环境饲养条件的同时，对个体的左右耳石的重复测量进行建模。为了降低伪重复的风险，水箱-年份组合被明确作为随机效应结构中的一个分组因素。所有模型中都包括了经过自然对数转换的叉长（fork length）作为协变量。尽管鱼叉长度和实验日之间存在相关性，但它们代表的是生物学上不同的因素：实验日反映了自首次放入池塘以来的发育时间，而鱼叉长度则反映了在给定时间点内个体生长速率的差异。同时考虑这两个协变量使我们能够区分时间效应和与体型相关的对文石覆盖率的影响。模型选择，包括预测变量之间的交互项数量，是根据赤池信息量准则（AIC）以及使用“DHARMa”包（Hartig, 2022）进行的残差诊断来指导的。在某些情况下，DHARMa测试显示了与随机效应结构相关的残差模式；在这些情况下，重新运行了不包含随机效应的诊断测试，如果修订后的测试通过，则认为模型是可以接受的。边际均值预测是使用“ggeffects”包（Lüdecke et al., 2018）从模型中生成的，并用于可视化不同处理和时间条件下零膨胀和条件模型组分的预期值，同时将鱼叉长度固定在其平均值。为了清晰起见，预测结果以百分比（0–100%）的形式绘制，尽管模型输出是以比例单位（0–1）表示的。

2.5.1 随时间变化的文石覆盖率
2.5.1.1 浓缩实验
由于实验设计不同，浓缩处理按年份分别进行分析。对于第一年，最终模型包括了实验日（自然对数转换）和处理组（对照-对照或浓缩-浓缩）之间的交互作用，以及耳石侧面（左侧或右侧）和流动方向（顺时针或逆时针）之间的交互作用。还包含了鱼叉长度（自然对数转换），以及鱼叉长度和实验日之间的交互作用，以解释与体型相关的时间效应。在第一年中明确保留了流动方向，因为它在不同处理组之间存在差异，从而可以在不混淆浓缩效应的情况下解释侧向效应。先前的研究表明，单向流动既可能影响文石形成的侧面，也可能增加暴露在鱼缸外侧的耳石上形成文石的概率（Gaffney et al., 2025b）。因此，包含流动方向确保了这些机制在模型中得到考虑。零膨胀组分被指定为仅包含截距的项。

对于第二年，流动方向与处理完全混淆（每种处理组合——对照-对照、对照-浓缩、浓缩-对照、浓缩-浓缩——都在单一流动条件下发生）。由于这两种效应无法分离，为了避免多重共线性，因此排除了流动方向。最终模型包括了实验日（自然对数转换）、处理及其交互作用，以及耳石侧面和鱼叉长度（自然对数转换）作为加性项。还保留了实验日与鱼叉长度之间的交互作用，以捕捉与体型相关的时间效应。与第一年不同，第二年的零膨胀组分被建模为处理和实验日的函数。这种结构允许文石的流行率在不同处理组之间变化，并随时间变化，从而明确测试结构零（即未受影响的鱼）的概率在不同处理组之间的下降情况是否不同。

2.5.1.2 放养密度实验
对于密度实验，两年数据在单一模型中一起分析。最终模型包括了实验日（对数转换）、密度处理（低、中、高）、耳石侧面（左侧或右侧）和流动方向（顺时针或逆时针）之间的交互作用，以捕捉密度随时间的潜在侧向和流动特异性效应。饲养年份和鱼叉长度（对数转换）作为加性项包括在内，以解释年际差异和与体型相关的变异。鱼ID嵌套在组（鱼缸-年份组合）内，作为随机效应，以解释个体和鱼缸层面的依赖性。零膨胀被指定为仅包含截距的项，反映了各组之间结构零的恒定概率。

2.5.2 耳石对类型比例
为了评估不同处理下耳石对类型的分布情况，每条鱼被分类为四种类型之一：AA（两者均为文石）、VV（两者均为文石）、AV（左侧为文石，右侧为文石）或VA（左侧为文石，右侧为文石）。比较了首次放入池塘时（第0天）采样的鱼与释放时（约第400天）采样的鱼的比例，分别代表基线条件和最终时间点。对于每种处理和年份，每种对类型的鱼的数量除以总采样鱼的数量来计算比例，并使用堆叠条形图进行可视化。没有应用正式的统计模型，因为处理组之间的差异很大且易于视觉解释，这与我们之前的研究结果一致（Gaffney et al., 2025b）。

3. 结果
3.1 浓缩实验
3.1.1 随时间变化的文石覆盖率
在第一年的首次放入池塘时（第0天），总体文石流行率较低，但孵化环境已经造成了明显的处理组差异。模型预测显示，对照-对照组的文石概率为40–67%，而浓缩-浓缩组的文石概率仅为5–11%，这一差异在零膨胀模型中非常显著（p < 0.001），强调了孵化环境对早期文石出现的强烈影响。到第400天，这种差异仍然存在：对照-对照组的文石概率保持在较高水平（45–67%），而浓缩-浓缩组的文石概率接近零（1–2%）。这一差异得到了总体处理效应（p < 0.001）和处理×时间交互作用（p = 0.019）的支持，表明随着实验的进行，这种差距进一步扩大。

3.1.2 放养密度实验
对于密度实验，两年数据在单一模型中一起分析。最终模型包括了实验日（对数转换）、密度处理（低、中、高）、耳石侧面（左侧或右侧）和流动方向（顺时针或逆时针）之间的交互作用，以捕捉密度随时间的潜在侧向和流动特异性效应。饲养年份和鱼叉长度（对数转换）作为加性项包括在内，以解释年际差异和与体型相关的变异。鱼ID嵌套在组（鱼缸-年份组合）内，作为随机效应，以解释个体和鱼缸层面的依赖性。零膨胀被指定为仅包含截距的项，反映了各组之间结构零的恒定概率。

3.2 耳石对类型比例
为了评估不同处理下耳石对类型的分布情况，每条鱼被分类为四种类型之一：AA（两者均为文石）、VV（两者均为文石）、AV（左侧为文石，右侧为文石）或VA（左侧为文石，右侧为文石）。比较了首次放入池塘时（第0天）采样的鱼与释放时（约第400天）采样的鱼的比例，分别代表基线条件和最终时间点。对于每种处理和年份，每种对类型的鱼的数量除以总采样鱼的数量来计算比例，并使用堆叠条形图进行可视化。由于处理组之间的差异较大且易于视觉解释，因此没有应用正式的统计模型，这与我们之前的研究结果一致（Gaffney et al., 2025b）。

3.1.1 浓缩实验
在第一次放入池塘时（第0天），第一年的总体文石流行率较低，但孵化环境已经造成了明显的处理组差异。模型预测显示，对照-对照组的文石概率为40–67%，而浓缩-浓缩组的文石概率仅为5–11%，这一差异在零膨胀模型中非常显著（p < 0.001），强调了孵化环境对早期文石出现的强烈影响。到第400天，这种差异仍然存在：对照-对照组的文石概率保持在较高水平（45–67%），而浓缩-浓缩组的文石概率接近零（1–2%）。这一差异得到了总体处理效应（p < 0.001）和处理×时间交互作用（p = 0.019）的支持，表明随着实验的进行，这种差距进一步扩大。

3.2 放养密度实验
在第二年，使用交叉浓缩设计时，第0天也观察到了类似的处理组差异（图3）。对照-对照组的文石流行率最高（65%，95%置信区间：53–74%），对照-浓缩组的文石流行率居中（33%，95%置信区间：23–44%），而浓缩-浓缩组和浓缩-对照组的文石流行率较低（分别为8%，95%置信区间：4–16%；11%，95%置信区间：6–20%）。成对比较确认对照-对照组和对照-浓缩组的文石流行率显著高于浓缩组（所有p < 0.001），而对照组内部和浓缩组内部之间没有差异。到第400天，这些模式仍然存在：对照-对照组的文石流行率最高（74%，95%置信区间：60–84%），对照-浓缩组的文石流行率居中（33%，95%置信区间：21–48%），而浓缩-浓缩组和浓缩-对照组的文石流行率最低（12–16%）。释放时的对比确认对照-对照组的文石流行率显著高于所有组（p < 0.001）。对照-浓缩组与浓缩-浓缩组之间没有显著差异（p = 0.10），也与浓缩-对照组之间没有显著差异（p = 0.25）。模型检测到对照-浓缩组处理×时间的交互作用（p = 0.0039），表明文石流行率随时间呈现中间趋势。总体而言，浓缩组的文石流行率保持较低，对照-对照组的文石流行率增加，而浓缩-对照组的文石流行率逐渐增加。

3.2.2 放养密度实验
在第二次浓缩实验中，两年数据在单一模型中一起分析。最终模型包括了实验日（对数转换）、密度处理（低、中、高）、耳石侧面（左侧或右侧）和流动方向（顺时针或逆时针）之间的交互作用，以捕捉密度随时间的潜在侧向和流动特异性效应。饲养年份和鱼叉长度（对数转换）作为加性项包括在内，以解释年际差异和与体型相关的变异。鱼ID嵌套在组（鱼缸-年份组合）内，作为随机效应，以解释个体和鱼缸层面的依赖性。零膨胀被指定为仅包含截距的项，反映了各组之间结构零的恒定概率。

3.1.2 耳石对类型比例
孵化环境从一开始就显著影响了耳石的组成（图4）。在第一次放入池塘时，培养在浓缩人工产卵池中的鱼表现出高比例的对称文石（AA）耳石对（第一年：0.947；第二年：0.918），没有VV对，不对称性也很小（AV和/或VA对）。相比之下，对照组的文石对比例仅为0.526，VV对的比例较高（第一年：0.368；第二年：0.263），不对称的VA/AV对的比例也较高（约0.10）。

3.2.1 随时间变化的文石覆盖率
在第二次浓缩实验中，不同处理组之间的文石覆盖率差异明显（图3）。在第一次放入池塘时（第0天），对照-对照组的文石覆盖率最低（图2），但到第400天时，对照-对照组的文石覆盖率增加到66–70%，而浓缩-浓缩组的文石覆盖率仍然较低（59–63%）；这些差异不显著（所有p > 0.1）。然而，模型预测检测到侧向×流动方向的交互作用（p = 0.021），右侧耳石在顺时针流动下的覆盖率较高，而在逆时针流动下的覆盖率较低。预测结果是基于完整的零膨胀贝塔广义线性混合效应模型得出的，在所有预测中，鱼叉长度均保持在其平均值。关于该图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。在那些形成了文石的鱼类中，预测的文石覆盖百分比也随着密度的不同而变化（条件成分）。到第400天时，中等密度组的文石覆盖率为58-59%，低密度组为56-57%，而高密度组的覆盖率明显较低，为48-52%。成对比较确认了中等密度组与高密度组（差异=0.08，95%置信区间：0.04-0.13，p<0.001）以及低密度组与高密度组（差异=0.10，95%置信区间：0.06-0.14，p<0.001）之间存在显著差异，而中等密度组与低密度组之间没有差异（差异=-0.02，95%置信区间：-0.06-0.02，p=0.369）（图5）。通过观察图5和模型预测结果，还发现文石的不对称性取决于耳石的位置和水流方向。虽然位置和水流方向作为主要效应并不显著（所有p>0.1），但在零膨胀模型中，位置×水流方向的交互作用是显著的（估计值=0.66±0.32，95%置信区间：0.04-1.29，p=0.037），这表明随着时间的推移，方向性不对称性变得更加明显。具体来说，在顺时针水流下，右侧耳石的文石覆盖率更高，而在逆时针水流下则呈现相反的模式。这些密度效应在两年中都是一致的，因为饲养年份对文石形成的概率或严重程度没有显著影响（所有p>0.4）。完整模型公式、变量定义和统计摘要见附录S1（表S2）。

3.2.2 耳石对类型比例
所有参与饲养密度实验的鱼类都在无营养的托盘中孵化，因此孵化时的耳石组成是一致的（AA约0.50-0.54；VV约0.16-0.17；AV/VA约0.13-0.18）（图6）。这些基线值与富集实验中的对照鱼类相匹配。

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图6. 第一年和第二年饲养密度实验中首次放流（实验第0天）和释放（实验第约400天）时耳石对类型的比例。处理包括在顺时针（c）或逆时针（cc）水流条件下进行低密度、中等密度和高密度饲养。对称的文石-文石（AA）对用蓝色表示，对称的文石-文石（VV）对用深橙色表示，不对称的文石-文石（VA；左侧耳石为文石，右侧耳石为文石）对用中橙色表示，不对称的文石-文石（AV；左侧耳石为文石，右侧耳石为文石）对用浅橙色表示。关于该图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。

到第约400天时，不同密度处理之间的文石比例差异开始显现。高密度鱼类保持了最高的AA比例（第一年：0.500；第二年：0.630）和最低的VV比例（第一年：0.200；第二年：0.130）。中等密度鱼类的变化最为显著，AA比例最低（第一年：0.216；第二年：0.192），VV比例最高（第一年：0.568；第二年：0.538）。低密度鱼类再次显示出中间值（AA：0.311-0.356；VV：0.385-0.467）。这些模式支持基于模型的发现，并表明中等饲养密度促进了文石的普遍性和覆盖率。

在不对称耳石对类型中的水流方向模式（例如，顺时针水流下的AV更多，逆时针水流下的VA更多）反映了富集试验中观察到的微妙趋势，进一步证实了水流可能在实验条件下驱动的侧向化。

4. 讨论
本研究基于我们之前的工作（Gaffney等人，2025b），表明在早期发育过程中经历的环境饲养条件，特别是在孵化期间，对孵化场饲养的银鲑的矢状耳石组成起着关键作用。通过实验操纵孵化和放流后的水箱环境，我们测试了环境富集和饲养密度是否影响文石矢状耳石的普遍性和覆盖率。我们的结果表明，物理富集显著降低了文石的普遍性和覆盖率，而饲养密度的影响较弱且是非线性的，中等密度产生了最高的普遍性和覆盖率。这些发现填补了文石文献中的一个重要空白，该文献主要集中在放流后的干预措施上，并支持了文石是一种可改变的结果的观点，这一结果受到孵化场饲养条件和发育时间的影响。

4.1 富集实验：发育时间很重要
在富集的人工产卵床中孵化的鱼类比在标准无营养的Heath托盘中孵化的鱼类形成了显著更少的文石矢状耳石。在首次放流时，普遍性的差异就已经明显，并且在两年中的发育过程中都持续存在。富集鱼类的文石覆盖率始终较低，尽管处理对覆盖率的影响并不总是具有统计学意义。通过在胚胎和幼鱼阶段富集孵化环境（此时矢状耳石开始形成，Vignon，2018），本研究提供了首个实证证据，表明在放流前的结构富集可以有意义地影响耳石组成。这些发现填补了文石和富集文献中的一个关键空白，该文献主要集中在放流后的干预措施上，并加强了早期生命阶段耳石发育敏感性增强的早期研究（Geffen，1983；Vignon，2018；Morales-Nin，2000）。

从机制上讲，人工产卵床的好处可能源于它们能够物理支撑幼鱼并使其保持直立姿势。在自然或人工砾石产卵床中，幼鱼可以楔入石头之间并轻松保持直立，从而节省能量用于生长和发育（Marr，1963；Reiser等人，2019）。相比之下，无营养的Heath托盘无法提供这种支撑；较大的卵黄囊和平坦的网状表面导致幼鱼翻滚到侧面并不断尝试翻身。这种努力和疲劳的循环增加了能量需求，并在感觉发育的脆弱阶段导致了生物力学不稳定（Vignon，2018；Morales-Nin，2000）。这种姿势上的挣扎还可能降低卵黄转化效率，在某些情况下会导致卵黄囊磨损或畸形（Emadi，1973；Hansen和M?ller，1985；Murray和Beacham，1986）。这些压力因素改变了围绕生长中的耳石的内淋巴液组成，破坏了文石形成所需的化学条件，从而增加了文石沉积的可能性（Oxman等人，2007；Reimer等人，2017）。

尽管本研究没有直接测量皮质醇，但文石形成的中断被认为是由皮质醇升高介导的，皮质醇是应激反应中的关键激素，其与孵化场饲养鱼类中的文石形成有越来越多的关联（Sweeting等人，2004；Reimer等人，2016；Delaval等人，2021；Gaffney等人，2025b）。人工饲养环境引入了多种慢性压力因素，如水动力单调性、机械干扰和缺乏物理庇护所。这些因素会干扰正常的耳石发育。皮质醇影响离子运输、钙代谢和酸碱平衡，这些都是直接参与耳石矿化的过程（Reimer等人，2016，Reimer等人，2017）。在慢性压力下，能量可能会从精确的生物矿化过程中转移出来，用于基本生存，增加了矿化错误（如文石沉积）的风险（Reimer等人，2016，Reimer等人，2017；Austad等人，2021）。一旦开始，文石形成似乎是不可逆的（Tomás和Geffen，2003；Reimer等人，2016；Austad等人，2021），后续的发育阶段可能提供的纠正机会有限。这一限制可能解释了为什么早期的干扰会产生持久的影响，即使在转移到富集的放流后环境中，文石仍会继续发展。

我们注意到，本研究中的放流后富集包括垂直和三维结构（例如，人工植被），这些已被证明会影响幼鲑的行为、应激生理和福利（例如，N?slund等人，2013；Johnsson等人，2014；N?slund和Johnsson，2016；Rosengren等人，2017；Arechavala-Lopez等人，2022；Zhang等人，2023）。因此，这些元素可能有助于解释后期发育中观察到的耳石结果。然而，由于在首次放流时文石的普遍性差异已经明显，因此在孵化阶段进行富集似乎是这里记录的早期和持续效应的主要驱动因素。尽管如此，放流后的富集仍然为耳石结果提供了额外的、尽管较为温和的好处，特别是在第二年。

在第二年，富集-富集组鱼类的整体文石普遍性和覆盖率最低。对照-富集鱼类相对于对照-对照鱼类也显示出显著降低的普遍性，这表明放流后的富集可以提供部分保护。相比之下，富集-对照鱼类（在放流后失去了富集）的普遍性与富集-富集鱼类相似，但它们的覆盖率高于对照-富集鱼类。这种模式表明，虽然早期生活中的富集提供了最强的保护，但在放流后去除富集可能会部分削弱这些好处，而在放流后添加富集仍然可以减轻文石的形成。综合这些结果，支持了这样一个观点：塑造耳石组成的最敏感窗口发生在首次放流之前或附近，这与发育可塑性理论一致（West-Eberhard，2003；Bateson等人，2004），并且得到了鲑鱼研究的支持，这些研究表明早期环境强烈影响后续的发育轨迹（Metcalfe，1998；Thorpe等人，1998；Jonsson和Jonsson，2014）。

尽管如此，放流后的富集也不应被忽视。它为鲑鱼提供了公认的好处，包括减少压力和攻击性、改善认知功能、提高行为灵活性以及增强放流后的生存率（例如，N?slund等人，2013；Johnsson等人，2014；N?slund和Johnsson，2016；Rosengren等人，2017；Arechavala-Lopez等人，2023）。这些结果表明，即使放流后的富集对文石形成的影响不那么明显，它仍然具有价值。值得注意的是，在我们的研究中，富集-对照组（在放流后失去了富集）在第二年结束时显示出比对照-富集组更高的文石覆盖率，尽管它们的整体普遍性仍然较低。这种逆转可能反映了与富集丧失相关的压力，即在生命早期暴露于复杂结构的动物在转移到无营养条件下会表现出负面的生理和行为反应。在啮齿动物和斑马鱼中，富集丧失与焦虑增加、负面情绪状态和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能失调有关（例如，Smith等人，2017；Buenhombre等人，2023）。类似的机制可能也影响了富集-对照组中的鱼类，部分抵消了孵化富集的保护效果。总的来说，这些发现表明，虽然早期富集在减少文石普遍性和覆盖率方面特别有效，但在放流后保持结构复杂性可能对促进更广泛的福利和稳定发育结果同样重要。

4.2 饲养密度实验：非线性关系
饲养密度对文石形成的影响出乎意料地复杂。在中等密度下饲养的鱼类始终表现出最高的文石普遍性和覆盖率，其次是低密度鱼类，而高密度组形成的文石畸形最少且最不严重。这些结果表明饲养密度与耳石结果之间存在非线性关系。

这种模式的一个解释是高密度下的生长抑制。在试验结束时，高密度下饲养的鱼类始终是最小的（第一年和第二年合计平均重量=12.74±5.27克），而中等密度（15.32±5.36克）和低密度（17.16±5.53克）的鱼类则显著更大。在高密度、拥挤的条件下生长受到抑制在鲑鱼中已有充分记录（例如，Calabrese等人，2017；Wang等人，2019）。此外，生长较慢的鱼类在压力下可能不太容易出现耳石畸形，因为它们的身体对快速矿化的需求较少（Reimer等人，2017）。因此，我们研究中高密度鱼类的较小体型支持了这样的解释：生长减少以及相关的矿化压力降低有助于限制文石的形成。

社会动态也可能导致了观察到的模式。在高密度下，较大的群体规模可以通过社会缓冲来分散攻击性互动并降低慢性压力，这种现象是指同类的存在减少了个体的应激反应（Adams等人，2000；Culbert等人，2019）。这一发现与传统观点相反，传统观点认为高密度总是会损害福利（Ellis等人，2002；Ashley，2007；Turnbull等人，2008），而是表明密度的生理影响取决于拥挤压力和社会缓冲之间的平衡。相比之下，中等密度群体可能代表了“两害相权”的情况：拥挤足以破坏稳定的领地并触发频繁的攻击性，但群体规模又不足以使攻击性在个体之间充分分散。在这种情况下，加剧的攻击性可能会抵消社会缓冲的好处，解释了为什么中等密度鱼类表现出比低密度群体更多的文石。

低密度鱼类中较高的文石水平也与之前的研究一致，这些研究表明非常小的群体可以在没有庇护的情况下促进领地性和支配等级（Brockmark等人，2007）。因此，我们观察到的梯度很可能反映了生长抑制、社会压力和社会缓冲之间的权衡：低密度会加剧领地竞争压力，中等密度会最大化社会不稳定，而高密度则通过生长抑制和社会缓冲两种方式减少vaterite的形成。尽管这些机制仍处于推测阶段，但这一模式突显了需要更细致地理解放养密度如何与耳石发育、生长和应激生理学相互作用。进一步的研究需要在不同的环境条件下（包括不同的富集制度和喂养策略）来解开这些效应。

4.3. 耳石不对称性与水箱水流方向
在富集和放养密度实验中，耳石的不对称性与水箱水流方向始终一致。正如我们之前的研究（Gaffney等人，2025b）所显示的，仅顺时针流动的水箱产生了更多的AV对（左侧为文石质，右侧为vateritic质），而仅逆时针流动的水箱产生了更多的VA对（左侧为vateritic质，右侧为文石质）。这些方向性模式在当前研究的所有处理组中都得到了明显体现，清楚地复制了之前观察到的侧向不对称性。这种一致性支持了这样的解释：持续朝一个方向游泳会在身体两侧产生不均匀的机械应力或感官刺激，这可能会影响矿物质在左右耳石上的沉积方式（Davidson等人，2009；Popper和Hawkins，2019）。虽然所有情况下两侧差异的幅度在统计上并不显著，但第一年的富集实验和密度实验都显示出了明显的侧向×流动交互作用，第二年也表现出类似的方向趋势。这些模式在多次实验中的重复出现表明了这种效应的稳健性，并暗示诸如富集或密度这样的饲养条件可能通过减少慢性压力或促进更稳定的游泳行为来调节其强度。

考虑到vateritic耳石的密度较低且形状不规则（Tomás和Geffen，2003），它们可能会损害平衡和听觉（Oxman等人，2007；Lychakov和Rebane，2005），尤其是在耳石对变得不对称时。先前的研究已将这种不对称性与鲑鱼类的听觉敏感度降低（Reimer等人，2016，Reimer等人，2017）和捕食者回避行为受损（Vignon和Aymes，2020）联系起来。这些影响最终可能会降低自然环境中的生存率（Gaffney等人，2025b），这表明从鱼类福利和生态适应性的角度来看，减少耳石不对称性是重要的。值得注意的是，本研究没有包括交替流动的处理方式，而我们之前发现这种处理方式可以显著降低vaterite的普遍性和覆盖率以及耳石的不对称性（Gaffney等人，2025b）。鉴于水流方向和富集方式都独立影响耳石的结果，下一个合乎逻辑的步骤是测试将它们结合使用是否比单独使用任何一种方法能带来更大的改善。例如，交替流动可以减少机械应力，而富集可能有助于缓冲应激反应，从而共同促进耳石的发育和感官功能。探索这些组合策略可能会揭示减少畸形和提高孵化场饲养鲑鱼适应性的新机会。

4.4. 管理意义
虽然富集和放养密度都影响了vaterite的形成，但富集被证明是更有效且生物学上更有根据的干预措施。不仅其效果更强且在时间点上更为一致，而且在孵化期间的富集与耳石发育的关键期假说相符，在这个关键期内，早期的环境输入具有不成比例且通常是不可逆的影响（Vignon，2018；Morales-Nin，2000）。相比之下，密度调整主要影响放流后的条件，并显示出非线性关系：中等密度产生了最高的普遍性和覆盖率，而高密度虽然降低了覆盖率但并未降低普遍性。如果孵化场只能选择一种策略，那么早期结构富集可能会带来更大的长期利益。

我们的发现为孵化场管理提供了几项可行的建议。孵化期间的结构富集显著降低了vateritic耳石的普遍性和覆盖率，应优先将其纳入标准饲养方案中。其对耳石完整性的强烈和持久影响使其成为提高鱼类福利和生态表现的有价值工具。放流后的富集虽然对耳石组成影响较小，但对于支持行为和认知发展仍然很重要，不应被忽视。事实上，从富集环境到贫瘠环境的转变可能会造成心理压力，从而破坏早期的发育成果，这突显了在整个饲养过程中保持环境复杂性的重要性。从操作角度来看，可以通过修改鲑鱼孵化场中广泛使用的孵化盘或卵篮来扩大孵化期间的富集效果，例如加入一层薄砾石、人工基质垫或可拆卸的模块化塑料插件，以模仿砾石结构。这些设计增加了表面积，为鱼苗提供了姿势支持，同时允许水流通过并便于孵化场工作人员操作。插件和垫子可以取出进行清洁，直接解决了真菌生长和水质问题，同时符合常规的孵化场工作流程。使用较小的砾石或轻质人工替代品可以避免处理大颗粒砾石的挑战。这些选项更容易管理，并且已经在一些设施中进行了试验，表明这样的系统是可行的，并且与现有的基础设施兼容，只要配合标准的清洁和消毒程序即可。

放养密度应谨慎管理。尽管在我们的研究中高密度降低了vaterite的覆盖率，但这些条件本身并不一定有益，可能会带来其他福利挑战，包括竞争加剧和攻击性增加（Ellis等人，2002；Turnbull等人，2008），以及水质参数（如溶解氧和氨积累）的恶化（Ashley，2007）。我们的结果表明，中等密度可能特别成问题，可能会创造一个充满压力的环境，在这种环境中，领地竞争和攻击性可能会抵消较大群体规模带来的任何潜在社会缓冲益处。最后，水箱水流方向会影响耳石的不对称性，在孵化场设计中值得更多关注。正如我们之前的研究（Gaffney等人，2025b）所显示的，交替流动制度可以减轻畸形并促进更自然的游泳行为。由于本研究中的所有处理都是在实际操作规模的孵化场条件下实施的，这些策略既有效又可行，适合广泛采用。

综上所述，这些发现表明，在孵化场环境中vateritic耳石的畸形并非不可避免，可以通过对饲养环境的实际改变来减少。通过实施早期富集、交替流动制度和特定情境下的放养密度策略，孵化场可以降低耳石畸形的普遍性和覆盖率，提高鱼类福利，并可能增强放流后的适应性。这些干预措施既可扩展又可行，为提高鱼类福利和增强孵化场项目的生态表现提供了有意义的机会。

**作者贡献声明**
Leigh P. Gaffney：写作——审阅与编辑、撰写初稿、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法论、研究设计、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Emma B. Polard：写作——审阅与编辑、方法论、研究设计、正式分析、数据管理、概念化。
Chloe Kraemer：写作——审阅与编辑、方法论、研究设计、正式分析、数据管理、概念化。
Lydia N. Walton：写作——审阅与编辑、方法论、研究设计、正式分析、数据管理、概念化。
Garth A. Covernton：写作——审阅与编辑、可视化、验证、研究设计、正式分析。
Will Duguid：写作——审阅与编辑、方法论、概念化。
Joscilyn Jupp-Cliff：写作——审阅与编辑、资源管理、数据管理、概念化。
Francis Juanes：写作——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念化。

**资助**
本工作得到了加拿大渔业和海洋部的鲑鱼增强计划[资助编号：450296-HM-2024-001]、不列颠哥伦比亚省鲑鱼和恢复创新基金[资助编号：BCSRIF_2020_239]、加拿大自然科学与工程研究委员会[资助编号：PGSD3–546799-2020和RGPIN-2021-03288]、Mitacs加速实习计划、Liber Ero基金会以及维多利亚大学的支持。