鱼类物种对保加利亚黑海环境中多种压力源的适应潜力 阿尔贝娜·亚历山德罗娃（Albena Alexandrova）、 埃利娜·茨韦塔诺娃（Elina Tsvetanova）、 维奥琳·雷科夫（Violin Raykov）、 迪米塔尔·迪米特罗夫（Dimitar Dimitrov）以及 内肖·奇佩夫（Nesho Chipev）

《Fishes》：Adaptive Potential of Fish Species to Multiple Stressors in the Bulgarian Black Sea Environment Albena Alexandrova, Elina Tsvetanova, Violin Raykov, Dimitar Dimitrov and Nesho Chipev

　　摘要：黑海的水体和沉积物积累了多种污染物，这些污染物与自然因素共同作用，可能对海洋生物产生多样且复杂的影响。细胞氧化应激（OS）是生物对环境压力的一种常见反应，因此可以作为生物生理适应能力的指标。本研究分析了来自黑海保加利亚部分的鱼类物种的氧化应激情况。在2021年至2023年期间，研究人员在黑海北部和南部的监测拖网作业中收集了18种鱼类的样本进行了分析。通过分光光度法测量了肝脏和鳃中的氧化应激特异性生物标志物（脂质过氧化、谷胱甘肽和抗氧化酶）。研究结果表明，促氧化反应和抗氧化反应存在显著差异，这些差异受采样地点、物种种类和组织类型的影响。来自北部海域的鱼类样本中，肝脏表现出更强的抗氧化活性，而鳃中的脂质过氧化程度较高。底栖鱼类具有明显的肝脏抗氧化反应，而浮游鱼类则表现出较高的鳃脂质过氧化程度。杂食性鱼类由于饮食多样且含有多种污染物，其应激反应也表现出多样性。总体而言，黑海北部海域的底栖-浮游鱼类和浮游鱼类的氧化应激最为明显，而底栖或沿海鱼类在南部海域面临更大的环境压力。

1. 引言
黑海是一个半封闭的盆地，通过博斯普鲁斯海峡和达达尼尔海峡的水交换非常有限。由于其独特的地质、水文和生物特性，黑海的生态条件具有高度特异性和动态性[1]。黑海的水柱分层明显且持久存在，上层富含氧气，而下层则长期处于缺氧状态并含有大量硫化氢，使其成为世界上最大的永久性缺氧盆地。由于多瑙河等主要河流的注入，黑海的盐度相对较低，这进一步影响了其半咸水的特性，并限制了海洋生物多样性[2]。此外，黑海接收了来自广阔流域的人为污染物和营养物质，这些物质在水中和沉积物中持续存在，增加了生物体的环境脆弱性[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。黑海的保加利亚部分也不例外，受到气候变化、生态退化、人为污染和自然灾害等区域性和全局性压力的严重影响。从海洋生态条件来看，黑海可以大致分为北部和南部两个区域（分别位于马斯伦诺斯角以北和以南）。北部区域的气候条件不同，由于多瑙河、第聂伯河和德涅斯特河等欧洲主要河流的流入，受到的人为压力更大[3]。

黑海保加利亚区域的海洋生物，尤其是鱼类，已被发现积累了高水平的各种污染物[6,15,16,17,18,19,20]，其中最高浓度通常出现在肝脏、鳃和肌肉组织中[21]。捕食性鱼类往往承受着最大的污染物负担，对于具有商业价值的物种而言，这一现象对人类健康构成了特别关注[21,22,23]。近年来，黑海保加利亚部分也成为塑料污染的热点区域[24,25,26]，微塑料在鱼类体内广泛存在[27,28,29]。

传统上，评估海洋环境对水生生物（包括鱼类）的多重影响依赖于对海水和沉积物中选定物理和化学参数的标准化测量。然而，废物物质和污染物的种类日益增多，它们可以在生物体内积累并放大，以复杂的方式相互作用，并与自然环境因素共同对海洋生物产生显著的叠加、协同甚至拮抗效应。通过应激反应方法可以对这种多因素环境影响进行客观评估，该方法遵循谢利耶（Selye）的定义，即将应激视为机体任何需求的非特异性（共同）结果[30,31]。这一概念现已扩展，涵盖了网络化生物系统内的所有层次。过去十年中，应激概念得到了强调，以解释细胞和组织生理的短期变化、个体层面的主要行为综合征以及种群层面的生态扰动。这些组成部分共同构成了所谓的应激生态学[32,33,34,35,36]。该框架强调了生物体在面对压力时重新组织和适应的能力，从而支持其健康、生存、恢复、长期适应和恢复力。

近年来，由于促氧化剂/抗氧化剂细胞稳态、环境变化和生命史之间的关联，氧化应激（OS）受到了广泛关注。活性氧（ROS）的产生与细胞抗氧化防御之间的不平衡（前者占优势）会导致氧化应激[37]。氧化应激的指标越来越多地被用作生物标志物，以了解各种压力因素的机制，以及它们对动物健康和时空分布的生理后果，这些指标还受到不同生命阶段的影响。氧化应激的研究，即由于ROS与保护性抗氧化机制之间的不平衡导致的双分子氧化损伤，是医学、分子生物学、生理学以及最近生态学领域的“热点话题”。过去几十年中，由污染物或环境物理化学因素引起的海洋生物氧化应激已被广泛研究[35,38,39,40]。维持生化稳态，即细胞和代谢的恢复力，反映了生物体在面对多种环境压力时保持细胞完整性和能量平衡的能力。强大的抗氧化系统可以防止脂质、DNA和蛋白质的氧化损伤，支持细胞的存活和整体生物体的适应性，这被称为恢复力。生化恢复力是指生物体适应压力和逆境的能力，以及成功应对艰难生活经历的能力。因此，细胞和代谢恢复力指的是生物体在面对多种环境压力时维持细胞完整性、能量平衡和生化稳态的能力[35,38,39,40,41]。

传统上，评估黑海海洋环境对生物（包括鱼类）的影响仅基于个别污染物和对海水及沉积物中若干毒理学和物理化学参数的标准测量，这种方法不够客观。一方面，由于引起压力的因素种类繁多；另一方面，生物体具有适应能力，因此在评估环境因素对生物健康状况的多重影响方面存在重大空白，进而影响生态系统的健康。此外，不同污染物对生物健康的特定影响取决于它们在体内和器官中的积累情况。为了确定多种环境压力及其相互作用对生物健康的影响，氧化应激似乎是一个客观的综合指标[39,40]。众所周知，生物系统中的氧化应激受到细胞抗氧化防御的抑制，这些防御机制在动物物种和不同组织类型中普遍存在。污染物可能具有多种毒性机制，对于单一污染物而言，可能存在多种机制，每种机制都会在不同程度上加剧最终的损害效应[33,42]。根据欧盟指令，评估自由生活海洋生物健康状况的传统方法不包括综合标志物，这些标志物也反映了鱼类的功能状态和适应能力。

鉴于上述情况，本研究首次旨在通过分析氧化应激这一综合指标，评估黑海保加利亚部分关键鱼类物种在不同环境条件下的健康状况、恢复能力和适应潜力。

2. 材料与方法
2.1. 采样与采样区域
2021年至2023年夏季（6月至7月）和秋季（9月至11月），在黑海保加利亚部分的不同拖网区域进行了常规监测拖网作业，收集了鱼类样本。监测拖网作业主要针对目标鱼类物种，但也捕获了一些副渔获物种。用于分析的鱼类样本来自位于黑海北部和南部的三个选定拖网区域（图1）的捕获物。图1显示了黑海北部和南部海域的选定拖网区域（NTR1—北部拖网区域1；NTR2—北部拖网区域2；NTR3—北部拖网区域3；STR1—南部拖网区域1；STR2—南部拖网区域2；STR3—南部拖网区域3）。为了满足一般的监测和研究需求，根据深度将区域划分为三个层次：第1层（15–30米）、第2层（35–50米）和第3层（50–100米）。黑海监测研究区域被划分为128个大小相等、不重叠的采样点，深度在16至92米之间。在37个随机选择的采样点进行了中层拖网作业，每次拖网持续30至40分钟，速度为2.7–2.9节。所使用的拖网具有以下技术参数：有效水平开口宽度为28米，垂直开口宽度为12–14米。拖网网眼的尺寸为6.5 × 6.5厘米，可以捕获较小的个体，降低渔具的选择性，从而更准确地反映拖网区域的鱼类多样性。

2.2. 鱼类物种
用于分析的鱼类样本是从选定区域的拖网捕获物中随机选取的。样本在船上立即进行急速冷冻，随后转移到实验室。样本在-80°C下储存，直至进行生化分析。共分析了18种鱼类。分析当天，将样本在室温下解冻，并测量了总长度（L）和重量（W），单位分别为厘米和克。使用以下公式计算了Fulton条件指数（K）：K = W/L3 × 100 [43]。表1列出了所研究鱼类物种的物种特异性生活方式和生物测量特征以及Fulton条件指数。所有样本都经过了相同的标准化采样和处理程序，因此，在采集、储存或处理过程中引入的任何潜在偏差都会对所有样本产生相同的影响，从而不太可能影响物种间的相对比较。

在北部海域的样本中，有两种鱼类在南部海域的样本中不存在；而在南部海域的样本中，有七种鱼类在北部海域的样本中不存在。表2列出了每个拖网区域分析的鱼类数量及其对应的拖网深度。表2显示了黑海北部和南部海域拖网区域采集和分析的鱼类物种数量（n）。

2.3. 组织制备
解冻并测量生物测量数据后，将每条鱼解剖，然后在冰上取出肝脏和鳃。使用Potter–Elvehjem均质器（Thomas Scientific LLC，美国新泽西州斯威兹伯勒）将每个器官均质化为0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中的10%（w/v）组织匀浆液。匀浆液在3000× g下离心10分钟，以获得核后组分，用于测定脂质过氧化（LPO）水平和总谷胱甘肽（GSH）浓度。核后组分的一部分进一步在20,000× g下离心20分钟，以获得线粒体后上清液，其中测量了抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性。所有操作均在4°C下进行。采样程序对所有个体进行了标准化，以确保观察到的不同鱼类及其组织之间的氧化应激生物标志物差异反映了生理变化而非采样不一致性。

2.4. 生化分析
使用Sigma-Aldrich Co. LLC（美国密苏里州圣路易斯）购买的商业试剂盒，通过分光光度法测量了肝脏和鳃上清液中的氧化应激生物标志物：脂质过氧化（MDA）测定试剂盒（产品编号MAK568）、谷胱甘肽测定试剂盒（产品编号...）。CS0260）、超氧化物歧化酶测定试剂盒（产品编号19160）、过氧化氢酶测定试剂盒（产品编号CAT100）和谷胱甘肽过氧化物酶细胞活性测定试剂盒（产品编号CGP1）。所有测量均严格遵循制造商的说明进行，包括使用每个试剂盒提供的标准溶液进行校准。生物标志物的活性和浓度均以总蛋白含量为基准进行标准化，并以每毫克蛋白表示。总蛋白含量根据Lowry [44]的方法测定，使用牛血清白蛋白的标准曲线。为了确保测量的准确性和可靠性，所有样本均重复三次分析，然后使用平均值进行后续的统计分析。

2.5. 特异性氧化应激（SOS）指数
特异性氧化应激（SOS）指数被用作氧化应激的综合指标，其计算方法基于Yakimov等人[45]的方法，并进行了一些修改[29,46]。简而言之，SOS指数是通过以下公式计算得出的：SOS = PrO ? AntiO，其中PrO是促氧化剂评分的平均值，AntiO是抗氧化剂评分的平均值。SOS指数接近零表示平均状态，而负值或正值则表示相应部位的值低于或高于平均水平，反映了生物体的氧化应激状态。SOS指数也可以作为生物体适应环境条件的指标。

2.6. 统计分析
对于样本数量超过15个的，使用t检验进行均值比较；对于样本数量较少的情况，则应用非参数Mann–Whitney U检验。仅有一个个体的物种未被纳入统计分析。所使用的统计显著性标准为p < 0.05。主成分分析（PCA）用于降低大型复杂数据集的维度并识别数据中的主要因素。分析使用STATISTICA 10软件包（StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA）进行。

3. 结果
3.1. 黑海北部保加利亚海域鱼类物种的氧化应激指标
对黑海北部拖网区域鱼类OS指标的平均值进行分析（表3）显示，总体氧化应激水平处于中等范围，某些物种表现出明显的组织特异性OS生物标志物模式。在肝脏中观察到抗氧化防御系统显著激活（SOD、CAT和GPx活性升高），而鳃部则表现出较高的促氧化反应（LPO升高）。表3显示了从黑海北部拖网区域采集的鱼类肝脏和鳃部的应激指标值（平均值±标准差）（*—表示p < 0.05的统计显著性；n = 物种数量）。底栖鰕虎鱼（Neogobius, Mesogobius）表现出强烈反应，其肝脏LPO和抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）显著升高。浮游鱼类S. sprattus在两种组织中的LPO水平均较高。M. merlangus个体表现出升高的GSH和总体中等至高的抗氧化酶活性，表明其具有强大但有效的防御机制。同时，T. mediterraneus和P. saltatrix在鳃部表现出明显的特异性反应。
所有研究鱼类的初始OS模式数据见补充材料（表S1_1）。为了确保内部一致性并允许直接比较不同组织间的生物标志物反应，在所有情况下，均从同一条鱼身上采集肝脏和鳃部样本。该地区肝脏LPO最高的是N. melanostomus，其GPx也显著升高。同样，G. mediterraneus表现出升高的肝脏SOD和GPx，这与酶防御系统的激活一致。相比之下，浮游鱼类如P. maxima和A. immaculata的肝脏LPO较低，但GPx升高，表明其具有高效的过氧化物解毒能力。尽管促氧化信号相对较弱，但仍能有效解毒。总体而言，NTR1区域的鱼类物种表现出平衡的氧化应激状态，肝脏酶防御系统足以应对中等程度的促氧化暴露。
NTR2区域的鱼类表现出最大的变异性，某些值在所有区域中最为极端（表S1_1）。鰕虎鱼M. batrachocephalus的肝脏SOD、GPx和LPO水平异常高，使其成为数据集中反应最强的物种之一。SOD和GPx的同时升高表明初级和次级抗氧化防御系统均被激活，这可能是由于沉积物相关污染物对底栖物种的影响。S. sprattus在肝脏和鳃部均表现出升高的LPO，同时鳃部GPx也升高，表明其面临持续的氧化挑战，但酶活性不足以完全应对。相反，M. barbatus的肝脏LPO较低，但肝脏SOD显著升高，表明其能有效拦截超氧自由基，但其他抗氧化途径的参与有限。NTR2区域的鱼类鳃部生物标志物反应比NTR1区域更强。特别是M. merlangus表现出较高的鳃部LPO和SOD，而S. sprattus在所有区域中鳃部GPx最高。总体而言，NTR2区域的氧化压力最大，表现为肝脏和鳃部生物标志物值升高。
NTR3区域的鱼类表现出混合的氧化特征，不同物种的生物标志物值既有中等水平也有极端值（表S1_1）。浮游捕食者如S. sprattus和T. mediterraneus的肝脏LPO非常高。所有区域中肝脏GSH水平最高的是M. merlangus，这可能是由于在应激条件下谷胱甘肽合成或动员增加所致。底栖物种G. mediterraneus的鳃部GSH最高，可能反映了其与沉积物来源的污染物直接接触。与NTR1区域相比，NTR2区域的鱼类在鳃部表现出较高的LPO和较低的抗氧化活性。值得注意的是，M. merlangus的鳃部GSH较高，表明其具有活跃的非酶防御机制来补偿较低的SOD和CAT活性。总体而言，NTR1区域的鱼类物种表现出平衡的氧化应激状态，肝脏酶防御系统足以应对中等程度的促氧化暴露。
NTR2区域的鱼类表现出最大的变异性，某些值在所有区域中最为极端（表S1_1）。鰕虎鱼M. batrachocephalus的肝脏SOD、GPx和LPO水平异常高，使其成为数据集中反应最强的物种之一。SOD和GPx的同时升高表明初级和次级抗氧化防御系统均被激活。S. sprattus在肝脏和鳃部均表现出升高的LPO，表明其面临持续的氧化挑战，但酶活性不足以完全应对。相反，M. barbatus的肝脏LPO较低，但肝脏SOD显著升高，表明其能有效拦截超氧自由基。NTR2区域的鱼类鳃部生物标志物反应比NTR1区域更强。特别是M. merlangus表现出较高的鳃部LPO和SOD，而S. sprattus在所有区域中鳃部GPx最高。总体而言，NTR2区域的氧化压力最大，表现为肝脏和鳃部生物标志物值升高。
NTR3区域的鱼类表现出混合的氧化特征，不同物种的生物标志物值既有中等水平也有极端值（表S1_1）。浮游捕食者如S. sprattus和T. mediterraneus的肝脏LPO非常高。所有区域中肝脏GSH水平最高的是M. merlangus，这可能是由于在应激条件下谷胱甘肽合成或动员增加所致。底栖物种G. mediterraneus的鳃部GSH最高，可能反映了其与沉积物来源的污染物直接接触。与NTR1区域相比，NTR2区域的鱼类在鳃部表现出较高的LPO，尽管抗氧化酶活性保持中等水平。这种不平衡表明鳃上皮对氧化攻击的补偿能力不足。总体而言，NTR3区域代表了中等至高的氧化应激状态，其特征是组织特异性的氧化信号和显著的GSH激活。
对三个北部区域的OS指标进行比较，显示出明显的区域差异（表S1_1）。NTR1区域的鱼类物种总体表现出中等程度的氧化应激，主要表现为肝脏酶激活和相对平衡的肝脏-鳃部生物标志物模式。相比之下，NTR2区域的鱼类物种表现出最强的氧化负担，无论是底栖还是浮游物种，其肝脏和鳃部的应激反应均显著升高。SOD和GPx的显著诱导表明其面临特别重的促氧化负荷。NTR3区域的鱼类OS指标处于中等状态，但某些物种的两种组织中GSH浓度最高，尤其是浮游鱼类，这反映了强烈的抗氧化动员和显著的氧化压力。

3.2. 黑海南部保加利亚海域鱼类物种的氧化应激
南部区域鱼类的平均LPO（表4）总体上在鳃部高于肝脏，与北部区域鱼类相似。此外，肝脏中的抗氧化酶活性也普遍较高，这支持了肝脏在鱼类解毒和氧化还原稳态中的核心作用。表4显示了从黑海南部拖网区域采集的鱼类肝脏和鳃部的应激指标值（平均值±标准差）（*—表示p < 0.05的统计显著性；n = 物种数量）。南部拖网区域的研究鱼类数据见补充材料（表S1_2）。STR1区域的鱼类表现出最高的整体氧化应激，尤其是底栖和底栖物种，表现为肝脏LPO、SOD、CAT和GPx的广泛范围和峰值。STR2区域的鱼类表现出中等但异质的反应，总体氧化激活程度适中，但偶尔出现极端值，例如U. scaber的GPx活性显著升高。STR3区域的鱼类表现出最低的整体氧化负荷，尽管某些物种（尤其是S. sprattus）仍表现出强烈的生物标志物激活，表明存在局部和/或物种特异性的应激源。所有南部区域的鳃部LPO水平普遍高于肝脏，表明鳃部是污染物进入和即时氧化挑战的主要界面。相反，抗氧化酶活性通常在肝脏中较高，再次强调了其在解毒和维持氧化还原平衡中的关键作用。
从STR1区域采集的鱼类样本表现出最广泛的生物标志物范围，某些物种的数值特别高（表S1_2）。物种M. merlangus和U. scaber的肝脏SOD、GPx和LPO水平异常高，使其成为数据集中反应最强的物种之一。SOD和GPx的同时升高表明初级和次级抗氧化防御系统均被激活。S. sprattus在肝脏和鳃部均表现出升高的LPO，表明其面临持续的氧化挑战，但酶活性不足以完全应对。相反，M. barbatus的肝脏LPO较低，但肝脏SOD显著升高，表明其能有效拦截超氧自由基，但其他抗氧化途径的参与有限。NTR2区域的鱼类鳃部生物标志物反应比NTR1区域更强。特别是M. merlangus表现出较高的鳃部LPO和SOD，而S. sprattus在所有区域中鳃部GPx最高。总体而言，NTR2区域的氧化压力最大，表现为肝脏和鳃部生物标志物值升高。
NTR3区域的鱼类表现出混合的氧化特征，不同物种的生物标志物值既有中等水平也有极端值（表S1_1）。浮游捕食者如S. sprattus和T. mediterraneus的肝脏LPO非常高。所有区域中肝脏GSH水平最高的是M. merlangus，这可能是由于在应激条件下谷胱甘肽合成或动员增加所致。底栖物种G. mediterraneus的鳃部GSH最高，可能反映了其与沉积物来源的污染物直接接触。与NTR1区域相比，NTR2区域的鱼类在鳃部表现出较高的LPO，尽管抗氧化酶活性保持中等水平。这种不平衡表明鳃上皮对氧化攻击的补偿能力不足。总体而言，NTR3区域代表了中等至高的氧化应激状态，其特征是组织特异性的氧化信号和显著的GSH激活。
对三个北部区域的OS指标进行比较，显示出明显的区域差异（表S1_1）。NTR1区域的鱼类物种总体表现出中等程度的氧化应激，主要表现为肝脏酶激活和相对平衡的肝脏-鳃部生物标志物模式。相比之下，NTR2区域的鱼类物种表现出最强的氧化负担，无论是底栖还是浮游物种，其肝脏和鳃部的应激反应均显著升高。SOD和GPx的显著诱导表明其面临特别重的促氧化负荷。NTR3区域的鱼类OS指标处于中等状态，但该区域的鱼类在两种组织中GSH浓度最高，尤其是浮游鱼类，这反映了强烈的抗氧化动员和显著的氧化压力。

3.3. 黑海南部保加利亚海域鱼类物种的氧化应激
南部区域鱼类的平均LPO（表4）总体上在鳃部高于肝脏。此外，肝脏中的抗氧化酶活性也普遍较高，这支持了肝脏在鱼类解毒和氧化还原稳态中的核心作用。表4显示了从黑海南部拖网区域采集的鱼类肝脏和鳃部的应激指标值（平均值±标准差）（*—表示p < 0.05的统计显著性；n = 物种数量）。STR1区域的研究鱼类数据见补充材料（表S1_2）。STR1区域的鱼类表现出最高的整体氧化应激，尤其是底栖和底栖物种，表现为肝脏LPO、SOD、CAT和GPx的广泛范围和峰值。STR2区域的鱼类表现出中等但异质的反应，总体氧化激活程度适中，但偶尔出现极端值，例如U. scaber的GPx活性显著升高。STR3区域的鱼类表现出最低的整体氧化负荷，尽管某些物种（尤其是S. sprattus）仍表现出强烈的生物标志物激活，表明存在局部和/或物种特异性的应激源。所有南部区域的鳃部LPO水平普遍高于肝脏，表明鳃部是污染物进入和即时氧化挑战的主要界面。相反，抗氧化酶活性通常在肝脏中较高，再次强调了其在解毒和维持氧化还原平衡中的关键作用。
从STR1区域采集的鱼类样本表现出最广泛的生物标志物范围，某些物种的数值特别高（表S1_2）。物种M. merlangus和U. scaber的肝脏LPO和抗氧化酶活性（SOD、CAT、GPx）显著升高，表明该区域面临显著的氧化挑战。U. scaber的肝脏GPX异常高，与其底栖生活方式和沉积物相关污染物的暴露相符。相反，浮游物种如T. mediterraneus和S. sprattus的LPO适中，但在鳃部表现出增强的抗氧化反应，表明其直接暴露于水生污染物。STR1区域鱼类的一个共同特点是肝脏和鳃部应激反应之间的差异。大多数物种在鳃部表现出较高的LPO，而抗氧化酶在肝脏中更高，这与肝脏的关键解毒作用一致。具有高摄食可塑性的物种（P. saltatrix）或底栖生活方式的物种（S. porcus、N. melanostomus）表现出更强的鳃部应激反应，可能反映了其与悬浮颗粒物和再悬浮沉积物的直接接触。STR2区域的鱼类生物标志物值总体上变化较大，但极端值略低于STR1区域（表S1_2）。底栖物种S. smaris、S. porcus和U. scaber的肝脏LPO和GPx升高，再次强调了底栖或近底栖鱼类对沉积物污染物的敏感性。值得注意的是，U. scaber的GPX值在所有区域中最高，表明其基于谷胱甘肽的防御机制强烈激活以应对过氧化物。STR2区域的鱼类鳃部生物标志物反应不那么明显，鳃部GSH相对稳定。与NTR1区域相比，鳃部LPO和CAT活性较低，可能表明STR2区域的氧化压力较低。然而，栖息在活跃营养生态位的物种（P. saltatrix、T. mediterraneus）表现出持续的鳃部LPO和中等程度的抗氧化激活，支持了移动性浮游捕食者面临更广泛环境压力的观点。
STR3区域的鱼类表现出与其他区域不同的氧化特征（表S1_2）。虽然较少物种表现出极端值，但出现了一些明显趋势。S. sprattus在数据集中表现出最高的肝脏LPO，伴随鳃部GSH的显著升高，表明其面临急性氧化挑战和补偿性抗氧化激活。底栖物种如N. melanostomus和M. barbatus表现出中等程度的肝脏SOD和GPx升高，反映了持续的适应反应。总体而言，STR3区域的鱼类在鳃部氧化生物标志物方面受到的影响较小，大多数物种的鳃部LPO和CAT值较低。这可能反映了其较低的悬浮污染物暴露或更有利的水动力条件，减少了污染物积累。尽管如此，浮游或滤食性物种中持续较高的LPO表明其偶尔暴露于氧化剂，可能与偶发的污染事件或饮食摄入有关。
在南部拖网区域的鱼类中，物种身份似乎更强烈地影响了其对环境压力的氧化应激反应：底栖鱼类如U. scaber、S. porcus和C. lucerna表现出最明显的肝脏抗氧化反应。相比之下，浮游物种如T. mediterraneus和S. sprattus的鳃部LPO较高。广食性物种如P. saltatrix和M. merlangus在其组织中表现出混合但一致的生物标志物反应。**黑海北部保加利亚海域鱼类氧化应激参数的季节性差异**

在北部地区，所有研究鱼类物种的肝脏和鳃组织中都观察到了氧化应激（OS）标志物的季节性差异，尽管变化的幅度和方向因物种和生物标志物而异（表5）。

**表5. 黑海北部保加利亚海域拖网捕捞区域采集的鱼类（A）肝脏和（B）鳃中氧化应激指标值的季节性（夏季与秋季）差异（平均值±标准差）（*—差异显著性p < 0.05）**。在肝脏组织中（表5A），大多数物种的LPO显示出轻微的季节性变化，M. barbatus、M. merlangus和P. flesus在夏季和秋季的值相当。相比之下，S. sprattus和T. mediterraneus在秋季表现出较高的LPO水平，表明这一季节的氧化损伤增加。所有物种的谷胱甘肽浓度在夏季和秋季之间没有显著差异。尽管M. barbatus、S. sprattus和T. mediterraneus在季节间的平均值变化较大，但这些变化并不具有统计学意义。超氧化物歧化酶（SOD）活性在秋季显著增加，尤其是在M. barbatus和P. flesus中。相反，S. sprattus和M. merlangus的SOD活性在秋季显著下降。过氧化氢酶（CAT）活性在几种物种中夏季较高（例如M. merlangus和T. mediterraneus），而S. sprattus在秋季的CAT活性高于夏季。尽管观察到某些物种特有的GPx活性季节性模式，但这些变化并不具有统计学意义。

在鳃组织中（表5B），虽然某些OS生物标志物的平均值在夏季和秋季有所波动，但没有检测到显著的季节性差异，除了S. sprattus在秋季样本中的GSH水平显著较高。

**黑海南部保加利亚海域鱼类氧化应激参数的季节性差异**

在南部地区的鱼类肝脏和鳃中也观察到了OS生物标志物的季节性差异，这些差异在不同物种、组织和生物标志物值之间存在差异。

在肝脏组织中（表6A），LPO显示出物种特异性的季节性变化。T. mediterraneus在秋季的LPO值显著高于夏季。S. sprattus的LPO水平也有所升高，但这种变化并不显著。M. barbatus、P. flesus和N. melanostomus的LPO水平在季节间相对稳定。谷胱甘肽浓度表现出中等程度的季节性变化，T. mediterraneus、P. flesus和N. melanostomus在夏季的值较高。抗氧化酶活性显示出更明显的季节性模式：SOD活性在秋季通常较高，除了S. sprattus。CAT活性在P. flesus中夏季较高，而在S. sprattus中秋季较高。尽管观察到某些物种特有的GPx活性季节性模式，但这些变化并不具有统计学意义。

在鳃组织中（表6B），尽管某些OS生物标志物的平均值在夏季和秋季有所波动，但没有检测到显著的季节性差异，除了S. sprattus在秋季样本中的GSH水平显著较高。

**黑海保加利亚海域关键研究鱼类的综合抗氧化状态**

在大多数研究物种中，来自南部拖网捕捞区域的鱼类的LPO水平（作为促氧化过程的标志物）较高，表明氧化压力显著更强。一些物种（S. sprattus和T. mediterraneus）表现出相反的模式，来自北部拖网捕捞区域的个体的LPO显著较高，这表明那里的浮游鱼类处于更强的促氧化条件下。底栖鱼类表现出混合反应，即来自北部地区的M. barbatus和P. flesus的LPO显著较高，而来自南部地区的N. melanostomus的LPO仅略有升高。M. merlangus在两个区域的LPO水平均有所升高。

研究鱼类的抗氧化谱显示，来自北部拖网捕捞区域的个体的抗氧化防御能力通常更强，表明它们对氧化压力的补偿反应更强。大多数来自北部拖网捕捞区域的鱼类物种（即A. immaculata、M. barbatus、N. melanostomus、P. maxima、S. sprattus、T. mediterraneus）表现出较高的抗氧化值，表明酶促和非酶促抗氧化途径持续激活。M. merlangus在两个区域的抗氧化能力最强，反映了其发达的氧化应激管理系统。来自南部拖网捕捞区域的鱼类较低的抗氧化值可能与抗氧化激活减少或氧化负担超过其补偿能力有关。相比之下，来自北部拖网捕捞区域的鱼类表现出更有效的抗氧化防御机制的动员。

来自北部地区的几种浮游鱼类物种显示出明显的正OS值，其中S. sprattus和T. mediterraneus表现出最高的氧化失衡，表明促氧化压力超过了它们的抗氧化能力。相比之下，来自北部地区的底栖或底栖鱼类物种（M. barbatus、P. flesus和P. maxima）的OS值为负，表明它们的抗氧化防御足以抵消促氧化过程。

两种来自南部拖网捕捞区域的鱼类物种A. immaculata和N. melanostomus显示出较高的OS值，反映了相对较高的促氧化压力。浮游物种（S. sprattus和T. mediterraneus）的OS值较低，表明氧化影响较小或抗氧化调节更有效。几种鱼类物种，包括M. barbatus、P. flesus、P. saltatrix和P. maxima，具有负OS值，表明其抗氧化缓冲能力充足。

氧化失衡在底栖-浮游物种中最为明显，而底栖物种保持了更好的氧化控制。这些模式清楚地反映了栖息地污染、污染物生物可利用性和物种特异性代谢敏感性的差异。

为了更客观地评估压力水平，计算了一个特定的氧化应激指数（SOS），即促氧化和抗氧化指标标准化值之间的差异（表7）。比较分析仅针对同时存在于黑海北部和南部地区的关键鱼类物种进行。

**表7. 关键鱼类物种的标准化（z变换）促氧化、抗氧化和特定氧化应激（SOS）指数**。SOS值显示了生物体内促氧化（Pro）和抗氧化（AntiO）过程之间的平衡。SOS的正或负值反映了与概率分布平均值的差异，从而反映了鱼类的OS水平。

表中的显著负SOS值表明，来自北部和南部地区的研究鱼类的综合环境影响并未引发氧化应激。鱼类的正SOS值表明环境影响引发了氧化应激。接近零（平均值）的SOS值表明促氧化和抗氧化过程处于平衡状态，因此没有氧化应激。

M. merlangus在北部和南部拖网捕捞区域的SOS值均为平衡状态（表7）。当综合环境影响非常低时，不会增强促氧化过程（如NTR中的P. flesus所示的负Pro值），也不会触发抗氧化反应的激活（如NTR中的负AntiO值所示）。对于NTR和STR中的M. barbatus和N. melanostomus以及STR中的P. flesus，海洋环境可能施加了中等程度的压力，激活了抗氧化防御（如正AntiO值所示）。刺激的抗氧化过程抵消了促氧化活性，总体上没有氧化应激（如负Pro值所示）。

显著的正SOS值表明氧化应激强烈，这是由于环境中的促氧化影响超过了抗氧化细胞的防御能力。在研究的S. sprattus和T. mediterraneus中，抗氧化防御似乎被抑制或非酶促抗氧化剂耗尽（负AntiO值），可能是由于长期或急性环境影响。这种损害阻碍了促氧化过程的中和，表现为高正SOS值。

SOS指数的值清楚地表明了鱼类对压力因素的脆弱性及其适应潜力。图2总结了来自拖网捕捞区域和季节的关键鱼类的聚合SOS指数。

**图2. 根据标准化特定氧化应激指数（SOS）值定义的压力区域以及鱼类物种在各区域的分布**。箭头的颜色和粗细程度表示压力水平、恢复力和脆弱性。颜色更深、更粗的箭头对应更高的压力强度、更强的恢复力和脆弱性。根据SOS指数，黑海保加利亚海域的关键鱼类物种可以大致分为三个压力区域。该图还显示了恢复力和脆弱性趋势的方向，如SOS指数所示。那些促氧化/抗氧化差异值在平均值±1范围内的物种可以归类为“休息区”，其促氧化和抗氧化过程大致平衡。SOS值高于平均值+1的物种可以被认为是“风险压力区”，因为促氧化过程显著超过抗氧化过程。SOS值低于平均值-1的物种被认为处于“良好压力区”，因为压力水平较低，抗氧化防御未被激活，促氧化过程保持在受控和最低水平。

主成分分析（PCA）用于减少大型复杂数据集的维度并识别数据中的主要驱动因素（图3A,B）。

**图3. 研究鱼类OS标志物的PCA结果（N—北部地区；S—南部地区）对应于（A）肝脏和（B）鳃**。PCA分析确定了反映鱼类肝脏指标主要组的两个主要因素（图3A）。第一个PCA轴解释了数据集中58.11%的变异，表明关键抗氧化酶GSH、SOD和CAT水平的相似性，这些物种大多位于轴的左侧（负端）。沿此轴，北部地区的M. merlangus和P. flesus与其他物种分离，因为它们对北部海洋环境的适应能力相似。第二个主要因素（垂直PC轴）解释了41.89%的变异，主要与鱼类中GPx和LPO指标的变化有关。M. barbatus和M. merlangus（北部地区）在该轴的较低端显示出一定的相关性，而S. sprattus（北部和南部地区）和P. flesus（北部地区）在轴的较高端大致分组。脊椎动物的肝脏具有高代谢率和氧气消耗率，是异生物质解毒的主要器官。

鱼类鳃的PCA分析（图3B）显示了鳃中OS指标关系与肝脏中的差异。首先，第一个主成分轴（59.62%）主要反映了北部和南部地区鱼类种类的差异，其中来自北部地区的S. sprattus和M. merlangus与其他物种区分开来。这些发现表明，当地环境条件对鱼类鳃中的氧化应激（OS）水平有显著影响，因为鳃直接暴露在水中污染物中，因此极易受到氧化应激的影响。第二个主成分轴（40.38%）反映了鳃中抗氧化剂的差异，这主要是由于鱼类种类的生物学特性造成的，例如来自南部地区的M. barbatus和M. merlangus与来自北部地区的P. flesus区分开来。总体而言，主成分分析（PCA）表明，不同物种之间的氧化应激水平和补偿能力差异主要与肝脏的生物学功能以及区域分布有关。具体来说，根据抗氧化剂数据，来自北部和南部地区的S. sprattus受到的氧化应激最大，因此与其他鱼类区分开来。

4. 讨论
黑海被认为是世界上污染最严重、退化最严重且被过度开发的大型海洋生态系统之一[47]。由于过度捕捞、富营养化以及营养级死锁生物的出现，黑海生态系统经历了生态系统的转变[48,49]。这些变化也伴随着海洋生物显著的应激反应。
活性氧（ROS）在生物体内的生成早在60多年前就被描述过，几乎立即就有研究表明ROS参与了多种影响健康的病理过程[37]。海洋鱼类中的氧化应激，特别是氧化应激，是一种严重的、往往是致命的状况，由水质差、环境波动（温度、盐度）、过度拥挤和污染引起，导致免疫力下降和疾病易感性增加[50]。来自保加利亚黑海地区的先前研究表明，接触环境污染物（包括重金属和微塑料）会影响鱼类和双壳类动物，引发氧化应激和适应性抗氧化机制[29,40,46,51]。在自然海洋环境中，由于存在多种相互作用的环境压力因素，建立污染物与其特定生物学效应之间的因果关系仍然具有挑战性[52]。在这项研究中，首次在自然条件下分析了黑海保加利亚部分常见鱼类的氧化应激水平，这些鱼类在生态系统功能中起着关键作用，并且具有商业价值。
总体而言，本研究观察到的鱼类氧化应激反应表明，保加利亚黑海环境面临着显著的慢性促氧化压力，且具有异质性特征。所建立的模式表明，氧化应激压力因地区、栖息地和物种而异。
从保加利亚黑海北部海岸捕获的鱼类通常表现出较高的氧化应激水平，而来自南部地区的鱼类则较低。保加利亚黑海北部地区受到大型河流（尤其是多瑙河）的影响较大，这些河流带来了大量的营养物质、重金属、有机污染物和农业径流[53,54]。除了多瑙河，卡姆恰河（Kamchia River）和巴托瓦河（Batova River）等区域河流也向黑海保加利亚部分的沿海区域输送了陆地污染物和悬浮物质[3,55]。这些输入可能导致沿海生态系统的环境压力增加，从而引发水生生物的氧化应激反应，表现为抗氧化防御系统的改变和氧化损伤生物标志物水平的升高[56]。这突显了河流污染物和有机负荷对海洋生物健康的强烈影响。总体而言，由于黑海北部大陆架受到显著负荷的影响，NTR2地区受到的影响最为严重。高水平的脂质过氧化（LPO）与肝脏SOD、CAT和GPx的强烈激活相结合，表明长期暴露于不同的促氧化剂中，可能与不同的人为输入和沉积物携带的污染有关。
所研究的鱼类观察到的氧化应激反应表明，每种物种对其栖息地特有的复杂环境压力混合物有不同的反应。底栖物种如M. merlangus和N. melanostomus由于较少暴露于表面污染物、紫外线辐射和温度波动，通常表现出平衡的促氧化/抗氧化状态[57]。相比之下，浮游物种如S. sprattus和T. mediterraneus由于更多地暴露于环境压力和食物供应的波动，更容易出现氧化失衡[57]。此外，作为更活跃的鱼类，浮游鱼类通常具有更高的代谢率和氧气消耗量，这使它们更容易产生ROS[58,59,60]。
除了已知的区域和栖息地差异外，还观察到了显著的物种特异性反应，这很可能是由于它们的生理活动造成的。某些物种表现出平衡的氧化应激状态，而其他更活跃的浮游物种则由于物种特有的生理和生化特性而更脆弱。组织特异性因素，例如膜脂质组成，会影响过氧化的敏感性，并可能在氧化应激的脆弱性中起作用。研究表明，浮游鱼类的膜中多不饱和脂肪酸的比例通常高于许多底栖鱼类[61,62]，这是脂质过氧化发展的前提条件。
底栖-浮游物种和浮游物种表现出更高的促氧化/抗氧化失衡倾向，而底栖物种则表现出更有效的调节能力，这与之前的观察结果一致。研究表明，M. barbatus、T. mediterraneus和S. sprattus比底栖鰕虎鱼N. melanostomus经历更强的氧化应激，这突显了与其生活方式和栖息地条件相关的氧化还原调节的明显差异[39]。浮游鱼类在黑海北部的氧化应激水平较高，而几种研究的底栖或沿海鱼类在南部似乎经历了更高的氧化压力。底栖物种（M. batrachocephalus、N. melanostomus）在肝脏中表现出升高的LPO水平和抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）。同样，其他研究的底栖鱼类（U. scaber、S. porcus和C. lucerna）也表现出明显的肝脏抗氧化反应，似乎对慢性沉积物相关的异生物质压力有很强的抵抗力。相比之下，研究的浮游物种（T. mediterraneus、S. sprattus）表现出更高的鳃LPO水平，反映了它们与水中溶解或颗粒污染物的持续接触。同时，杂食性鱼类（P. saltatrix、M. merlangus）的混合组织特异性氧化应激反应似乎更可能是由多种压力因素的广泛饮食暴露驱动的。
物种身份强烈影响了观察到的氧化应激反应。在研究的来自黑海北部地区的鱼类中，观察到肝脏抗氧化系统的显著激活以及SOD、CAT和GPx活性的升高，突显了肝脏在解毒过程中的主要作用。相比之下，在鳃组织中存在较高的促氧化过程，表明直接受到污染暴露和氧化影响的敏感性。类似的效果之前也在不同暴露于各种环境氧化压力因素的海洋鱼类中有所报道，包括黑海物种[38,39,41]。一些研究的鱼类表现出不同的氧化应激谱型，这似乎反映了它们的生态位特征和暴露途径。
本研究揭示了黑海保加利亚海岸鱼类物种中氧化应激生物标志物的季节性变化，与之前的观察结果一致[63]。特别是在秋季，无论是北部还是南部地区的S. sprattus和T. mediterraneus，肝脏LPO水平都有所增加，表明这一季节氧化损伤加剧。环境因素的季节性变化，包括水温、溶解氧、盐度和营养物质可用性的变化，以及繁殖活动等生物过程，可以显著影响水生生物的代谢活动、ROS生成和抗氧化防御，从而导致氧化应激生物标志物的波动[64,65,66,67]。此外，夏季黑海沿海地区的旅游压力增加，特别是在季节末期，会导致沿海和近岸水域的额外污染，可能影响抗氧化防御系统和氧化损伤水平。值得注意的是，尽管抗氧化防御参数的反应受温度和繁殖周期的影响，但这些模式是物种特异性的，在许多情况下也是组织特异性的，抗氧化酶活性在器官之间存在季节性变化[68]。例如，移动性强的S. sprattus更喜欢冷水，在夏季会迁移到更深的水层。这些结果表明，季节性的环境变化，加上地区特定的人为压力和物种特定的生物学特性，可以在塑造黑海鱼类的氧化应激反应中发挥重要作用。
根据综合SOS分析，氧化应激与所研究的关键鱼类物种的恢复力差异的结合效应与三个一般的氧化应激特征区域相关：“良好应激”、“休息区”和“风险应激”（如图2所示）。大多数研究的鱼类物种属于“休息区”，其促氧化和抗氧化活性保持稳定平衡。然而，有两种鱼类（S. sprattus、T. mediterraneus）处于关键的“风险应激”区域，表明黑海保加利亚部分的生态状态正在恶化。
PCA分析确认了两个主要独立因素在塑造黑海鱼类种群氧化应激反应中的复杂而重要作用。首先，物种特有的生物学特性负责鱼类的适应能力和恢复力。其次，区域（栖息地）环境变异性是另一个重要因素，这通过氧化应激反映出来，它在鱼类的适应性和恢复力中起着关键作用。

5. 结论
鱼类提供了许多生态系统服务，并且种类极其多样。它们生活在从完全淡水到高盐度、从浅水到深渊、从过饱和（含氧）到缺氧的水域，以及从极地海洋到热带牛轭湖的各种环境中。它们在水生生态系统（以及对人类）中的重要作用，加上其巨大的多样性，使它们成为进一步探索生态学中氧化应激的理想模型。
根据我们的研究，鱼类氧化应激很可能受到特定局部环境因素与人类影响的显著影响。关于海洋环境对黑海鱼类健康的影响，以及它们进化过程中发展出的生理恢复力和适应环境压力的能力，还有很多未知之处。这突显了需要进行更多的野外研究，特别是对鱼类（和其他变温动物）的研究，以便更全面地了解氧化应激在野外的影响。此外，使用比较方法研究具有不同生命周期、摄食策略和不同栖息地的野生鱼类之间的氧化应激应对机制差异的研究几乎还缺乏。
黑海保加利亚部分鱼类物种中氧化应激生物标志物的变化可以作为海洋监测调查中多种压力因素影响的综合指标。强烈建议进行额外的研究，以阐明海洋环境对海洋鱼类的更广泛影响和后果。
本研究观察到的一致的物种和组织特异性反应表明，多生物标志物氧化应激方法在评估海洋生态系统的环境和生态质量方面的有效性。

补充材料
以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/fishes11040191/s1
表S1_1：黑海保加利亚部分三个北部拖网区域的鱼类样本的氧化应激指标值（平均值±标准差）；
表S1_2：黑海保加利亚部分三个南部拖网区域的鱼类样本的氧化应激指标值（平均值±标准差）。