一种用于高浓度放射性核素地质处置风险评估的多模型框架

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：A multi-model framework for risk assessment of high-level radionuclide geological disposal

　　陈俊涵|夏云辉|任凯|杨凤莲|林宗宇|甘卫东|王俊丽|李东梅
南京鼓楼医院泌尿科，南京大学医学院分析化学生命科学国家重点实验室，江苏南京210008

**摘要**
铝已被确认为一种生殖毒素，但胚胎暴露如何影响雄性后代发育的具体机制仍不清楚。目前尚未建立系统的不良后果途径（AOP）网络来将铝暴露与生殖障碍联系起来。本研究采用了一种综合方法——结合网络毒理学和非靶向代谢组学以及体内/体外实验——来阐明铝如何在小鼠中诱导精子发生受损的机制。通过使用小鼠TM3细胞和原代莱迪希细胞进行的体外研究表明，氯化铝（AlCl?）通过IRE1α/XBP1s途径触发氧化应激，进而导致内质网应激（ERS）。我们发现转录因子XBP1s直接结合并激活N-酰基磷脂乙醇胺特异性磷脂酶D（Nape-pld）的启动子。这一级联反应导致大麻素受体1（CB1）过度激活，并下调关键的类固醇生成蛋白，如黄体生成激素受体（LHR）和类固醇生成急性调节蛋白（StAR）。这些发现为我们的AOP模型提供了有力证据，即铝通过氧化应激诱导ERS，随后通过内源性大麻素系统（ECS）损害睾酮合成。我们的研究通过提供一种识别关键事件（KEs）和构建因果AOP网络的强大方法，推进了对重金属生殖风险的评估。

**1. 引言**
全球不孕率的上升已成为一个重大的公共卫生挑战。世界卫生组织（WHO）预测，不孕症将成为21世纪第三大疾病负担，仅次于癌症和心血管疾病（Petraglia等人，2013年；Esteves等人，2012年）。流行病学研究表明，全球约有15%的夫妇面临不孕问题，其中超过一半的病例由男性因素引起（Chambers等人，2021年）。弱精子症（表现为精子数量和活力低）是男性不孕的主要原因。越来越多的证据表明，环境污染是导致男性生殖健康下降的关键因素。双酚A、邻苯二甲酸盐、农药和重金属等污染物已被证实具有直接的生殖毒性作用，会干扰精子发生并最终导致不孕（Mima等人，2018年；Shahrokhi等人，2019年；Krausz和Riera-Escamilla，2018年）。这强烈表明，环境暴露的增加是男性因素不孕发病率上升的主要因素。联合国粮食及农业组织（FAO）警告称，全球90%的土壤资源受到污染，而有毒重金属往往被忽视（Hou等人，2025年）。与可生物降解的污染物不同，铝等重金属可以在生物体内积累，包括主要农作物中，并且不易被清除（Coban等人，2022年）。作为地壳中最丰富的金属，铝广泛应用于水净化、食品添加剂和制药领域，导致人类通过饮食、吸入和皮肤接触广泛暴露于铝（Goullé和Grangeot-Keros，2020年；Goullé等人，2021年）。由于铝是非必需元素，其在器官（包括生殖系统）中的慢性积累可能导致多种病理变化，如神经毒性、乳腺癌和生殖毒性（Exley，2013年；Yokel，2020年）。大量来自流行病学和动物研究的证据表明，铝暴露与生育能力下降有关。铝暴露会导致血清中FSH、LH和睾酮水平急剧下降，伴随精子数量减少、精子活力受损和精子异常增加（Ali等人，2024年；Al-Nefeiy，2025年）。铝引起的生殖毒性涉及多个相互关联的途径。氧化应激是一个核心的初始事件，通过核因子红系2相关因子2（Nrf2）信号通路的下调和活性氧（ROS）产量的增加来介导（Ali等人，2024年）。此外，铝还能激活NOD样受体家族的pyrin结构域包含3（NLRP3）炎性体介导的焦亡反应（Nong等人，2026年）。人类主要通过饮食、饮用水和药品接触到氯化铝（AlCl?）。检测到的饮用水和含铝产品中的铝摄入量分别为0.043 mg/L（Yokel，2025年）和每天4–12 mg（Fermo等人，2020年）。欧洲国家成年人的平均每日摄入量为3.9 mg，而远东国家为5.1 mg，加拿大和美国为7.7 mg（Yokel，2025年）。发育起源健康与疾病（DOHaD）假说认为，在关键的胚胎和胎儿时期受到环境侵害会永久性地编程生理功能，增加成年后的疾病易感性（Gluckman等人，2016年）。流行病学研究在孕妇的胎盘和血清样本中检测到了铝（Pi等人，2019年），但这种产前暴露对后代生殖健康的长期影响仍缺乏研究。虽然我们之前的研究表明AlCl?通过破坏塞托利希细胞（Sertoli cells）损害血睾屏障（BTB）（Chen等人，2024年），但其对莱迪希细胞（睾酮的主要来源）的直接影响仍是一个关键的缺失环节。

经济合作与发展组织（OECD）认可的不良后果途径（AOP）框架提供了一个系统模型，将多维生物机制整合到因果链中，以支持化学风险评估（Saarimaki等人，2023年）。AOP包括分子初始事件（MIEs）、关键事件（KEs）和不良后果（AOs）（Wang等人，2024年）。MIEs代表化学物质发挥影响的初始点，触发一系列下游生物过程，最终导致AOs（Hu等人，2024年）。AOP在毒理学研究中越来越被用来阐明污染物与各种疾病之间的机制联系，允许与基于组学的分析结果相结合。然而，迄今为止，尚未开发出全面的AOP来系统总结铝的生殖毒性效应。

睾酮主要由睾丸莱迪希细胞合成，对男性生育能力至关重要（Awoniyi等人，1989年）。睾丸莱迪希细胞具有丰富的内质网（ER），对细胞应激非常敏感（Naamneh Elzenaty等人，2022年）。氧化应激和钙稳态紊乱等扰动可引发内质网应激（ERS）和未折叠蛋白反应（Chen等人，2023年）。同时，内源性大麻素系统（ECS）已被证明是调节男性生殖功能的关键因素，特别是通过其对睾丸莱迪希细胞上的大麻素受体1（CB1）的调节（du Plessis等人，2015年；Cobellis，2016年）。最新证据表明，ECS作为代谢传感器调节类固醇生成（Almeida等人，2022年）；然而，ECS是否作为环境诱导的ERS的下游效应器尚不清楚。通过结合网络毒理学和代谢组学，本研究旨在阐明ERS与ECS之间的潜在相互作用，构建一个全面的AOP，以评估环境铝的发育生殖风险。

**2. 材料与方法**
**2.1. 网络毒理学分析**
**2.1.1. CTD数据库基因和表型收集**
所有相关的基因和表型数据均来自比较毒理学数据库（CTD）（https://ctdbase.org/）。工作流程如下（图S1A）：
(1) 从CTD数据库中收集与铝和氯化铝（AlCl?）相关的基因和表型。
(2) 从CTD数据库中收集与男性不孕相关的基因和表型，整合了四种临床亚型（少精子症、弱精子症、畸形精子症和无精子症）的基因，并有文献支持（每个基因至少3篇参考文献）（Yuan等人，2025年）。然后，取(1)和(2)中获得的基因的交集，共得到579个共享基因。
(3) 使用STRING数据库（https://cn.string-db.org/）和Cytoscape（版本3.9.1，美国）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（Fan等人，2024年）。通过cytoHubba（Chin等人，2014年）和MCODE（Bader和Hogue，2003年）插件识别枢纽基因。
(4) 对识别的146个基因进行京都基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。然后过滤掉与男性不孕无关的通路（例如，女性生殖通路、癌症通路和细菌感染）。

**2.1.2. 使用表型数据构建AOP网络**
从AOP WIKI（https://aopwiki.org/）下载所有AOP和KE条目。通过识别GO标识符与KEs和关键表型的交集来构建将铝与男性不孕联系起来的AOP网络，随后筛选出专门与男性不孕相关的AOP（图S1B）。

**2.2. 主要试剂**
六水合氯化铝（AlCl?·6H?O）购自Sangon Biotech（A500025–0250，上海，中国）。AlCl?·6H?O的CAS号为7784–13–6，分子量为241.43 g/mol，纯度≥97.0%。胎牛血清（FBS）购自ExCell Bio（苏州，中国），DMEM/F12购自Wisent Corporation（南京，中国）。IRE1α抑制剂STF-083010购自MedChemExpress（上海，中国）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自Beyotime Biotechnology（上海，中国）。NAC的CAS号为616–91–1，分子式为C5H9NO3S。

**2.3. 动物和实验处理**
九周大的雄性（n=12）和雌性（n=24）BALB/c小鼠以1:2的比例饲养和配对。详细操作方法见之前的描述（Chen等人，2024年）。所有动物实验均获得南京大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准号为SYXK (Su) 2019–0056，并按照机构指南进行。在体内实验中，对照组作为对照组，而实验组暴露于不同浓度的AlCl?。

**2.4. 周期酸-希夫（PAS）染色**
小鼠睾丸组织先用4%甲醛固定，然后进行一系列乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理和石蜡包埋。从石蜡块中制备5 μm厚的切片。染色前先脱蜡并重新水化。使用Periodic Acid-Schiff Staining Kit（Beyotime，C0142S）按照制造商的协议进行染色。用苏木精对细胞核进行复染。最后，切片脱水、装片并在光学显微镜（Nikon，日本）下观察。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

**2.5. 免疫荧光染色**
睾丸组织切片的免疫荧光分析按照之前的方法进行。使用的初级抗体包括兔抗黄体生成激素受体（LHR）（Abclonal）、兔抗类固醇生成急性调节蛋白（StAR）（Abclonal）和兔抗3β-羟基类固醇脱氢酶（HSD-3β）（Abclonal）。组织切片在4°C下与初级抗体孵育过夜，然后用荧光标记的二级抗体进行检测。用DAPI进行核复染后，使用Olympus FV3000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）获取图像。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

**2.6. 原代莱迪希细胞提取及细胞培养和处理**
选择六只3周大的BALB/c小鼠。通过颈椎脱位处死小鼠，并将其浸泡在75%酒精中10分钟。用剪刀切开小鼠腹腔，用镊子取出睾丸组织并放入含有DMEM-F12培养基的培养皿中。随后撕开睾丸包膜，分散睾丸内的生精小管。静置后，吸取上清液并以500 rpm离心两次，每次5分钟。离心后弃去上清液，加入完全培养基（90% DMEM-F12培养基，10% FBS，5%马血清）培养24小时。当原代莱迪希细胞附着在培养皿上后，更换培养基。

小鼠TM3莱迪希细胞系购自Procell（武汉，中国），并在添加了10% FBS和5%马血清的DMEM/F12培养基中，在含5% CO?的湿润环境中37°C培养。实验中，细胞接种在6孔板或96孔板中。当细胞密度达到一定水平（1×10^5）时，将其接种在培养皿中，并分别用AlCl?、STF083010或NAC处理24小时作为实验组，未处理的细胞作为对照组（n=3）。

**2.7. 定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting**
使用RNA-easy试剂盒（Vazyme，南京）从TM3细胞和原代莱迪希细胞中分离总RNA。逆转录使用HiScript II Q RT SuperMix（Vazyme，R222–01）。定量PCR扩增在ABI ViiA 7系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行，使用SYBR Green I混合液（Vazyme，Q411–02），mRNA水平用2^(-ΔΔ)Ct方法标准化。引物序列见补充表S1。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

总蛋白使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime，P0013E）从TM3细胞、原代莱迪希细胞和睾丸组织中提取。使用Enhanced BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime，P0009）测定蛋白浓度。WB的详细操作方法见之前的描述（Chen等人，2017年）。初级抗体的详细信息见补充表S2。第二天，膜用TBST洗涤后与HRP结合的AffiniPure山羊抗兔IgG（FDR007，FUDERIS BIOLOGICAL）孵育。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

2.8. 流式细胞术和细胞内钙检测
为了分析ROS，TM3细胞被接种在培养皿中，并用AlCl3处理24小时作为实验组，而未经处理的细胞作为对照组（n=3）。ROS的水平使用ROS Assay Kit（Beyotime，S0034S）根据制造商的说明进行测量，然后在流式细胞仪（BD Pharmingen，美国圣何塞）上进行分析。我们使用FlowJo软件处理流式细胞术数据。右侧的橙色区域代表阳性细胞。根据软件分配的阳性细胞比例，使用ImageJ软件进行统计分析。对于细胞内钙检测，TM3细胞被接种在玻璃底培养皿中，并用AlCl3处理24小时作为实验组，而未经处理的细胞作为对照组（n=3）。然后细胞被加载2.5 μM的钙敏感荧光探针Fluo-4 AM（Beyotime，S1060）并在37°C下孵育45分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜成像荧光强度，代表细胞内Ca2?水平。随后，使用ImageJ软件分析平均荧光强度。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

2.9. 非靶向代谢组学分析
非靶向代谢组学分析和统计分析由Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（中国上海）进行。代谢组学数据已提交给Metabolights（研究ID：MTBLS12693，URL：https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS12693）。
代谢物提取是通过将100 μL的Leydig细胞样本（AlCl?/对照）加入到含有四种内标（例如，0.02 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）的800 μL乙腈：甲醇（1:1，v/v）中，在1.5 mL离心管中开始的。经过涡旋（30秒）和5°C超声处理（40 kHz，30分钟）后，样品在?20°C下孵育30分钟以沉淀蛋白质。离心（13,000 g，4°C，15分钟）后，上清液用氮气吹干。样品通过5°C/40 kHz超声处理（5分钟）重新溶解在100 μL乙腈：水（1:1，v/v）中，然后离心（13,000 g，4°C，10分钟）后转移到LC-MS小瓶中。色谱使用ACQUITY HSS T3柱（100 × 2.1 mm，1.8 μm；Waters）在UHPLC-Q Exactive平台上进行。Progenesis QI（Waters，美国）预处理原始LC-MS数据，导出CSV格式的3D矩阵。代谢物鉴定与HMDB、Metlin和MJDB数据库（Majorbio Bio-Pharm）进行交叉参考。
多变量分析（PCA/OPLS-DA）使用R语言的'ropls'包（v1.6.2）进行，并使用7倍交叉验证进行模型验证。通过双重阈值选择差异代谢物：OPLS-DA的VIP分数>1和Student's t检验的p<0.05。基于KEGG的通路富集分析将这些代谢物映射到相关通路，从而根据生物学作用或通路参与进行功能分类。

2.10. 双荧光素酶报告基因检测
Nape-pld的启动子序列从国家生物技术信息中心（NCBI）获得。使用CE Design软件设计了包含NotI（Beyotime，D5817）和XbaI（Beyotime，5953FT）限制位点的引物。使用Phanta Max Master mix从TM3细胞cDNA扩增启动子区域，并使用Ligation Mix（Vazyme，C311–01）亚克隆到TK-PCHD-copGFP-T2A-Puro或pGL3-Basic质粒中。构建的质粒被引入大肠杆菌DH5α中，PCR和测序确认阳性克隆。使用无提取质粒提取试剂盒准备用于转染的质粒。
HEK-293T细胞与三个质粒共转染——Nape-pld启动子报告基因、XBP1s表达（或空载体对照）和pRL-TK Renilla荧光素酶（内部对照）——使用LipoFiter试剂（Hanheng，中国）。转染后24小时，给予AlCl?处理24小时，然后进行双荧光素酶定量（Vazyme，DL101–01）。相对启动子活性表示为萤火虫：Renilla荧光比率。这里，Nape-pld启动子组作为对照组，而同时表达Nape-pld和XBP1的组构成实验组。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

2.10.1. shRNA慢病毒构建和转导
针对Nape-pld（编码NAPE-PLD）和Cnr1（编码CB1）的shRNA序列由Merck的shRNA库（http://www.sigmaaldrich.cn）设计并获得。shRNA寡核苷酸通过Ligation Mix（Vazyme，C311–01-AA）和TK-PCHD-copGFP-T2A-Puro以及ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme，C112）亚克隆到pLV-shRNA慢病毒载体中。慢病毒颗粒在HEK-293T细胞中产生并用于转导TM3细胞。监测转导效率，并选择稳定的细胞系用于后续实验。质粒转染后，TM3细胞用AlCl?处理。共处理组作为实验组，并与单独暴露于AlCl?的组进行比较。每个实验组至少包含三个生物学重复样本。

2.11. 统计分析
本研究中的重复实验构成生物学重复样本。所有数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。使用Shapiro-Wilk和Brown-Forsythe检验分别评估数据的正态性和方差同质性。使用非配对双尾Student’s t检验比较两组。使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Duncan检验比较多个组。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果
3.1. 网络毒理学分析识别Al诱导的男性不育的关键基因
使用CTD和STRING数据库，我们系统地探索了与Al诱导的男性不育相关的关键基因网络（图1A）。通过CTD数据库收集与男性不育相关的基因（涵盖四种疾病亚型），共有4505个基因在所有亚型中都存在（图1B）。随后，从CTD数据库中收集与铝（包括AlCl?）暴露和男性不育相关的基因，发现579个基因的交集（图1C）。这些交集基因被导入STRING数据库以构建PPI网络。使用Cytoscape软件进行的度分析显示度数>60的基因（图1D）。
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图1. 基于CTD数据库构建的Al诱导的男性不育的交集基因网络。（A）过程示意图。（B）Venn图显示与四种男性不育亚型相关的基因的交集，从而识别出与男性不育相关的核心基因。（C）Venn图显示从Al相关基因和男性不育相关基因的交集中获得的候选基因。（D）由上述候选基因形成的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，节点大小代表中心性。
然后基于这个PPI网络筛选枢纽基因。cytoHubba中的最大簇中心性（MCC）算法识别出在最大簇中具有中心性的20个节点（图S1A）。此外，使用MOCDE识别出具有高连接性的密集模块，并将得分>4的基因指定为枢纽基因（图S1B）。这共产生了146个候选基因。对这些候选基因进行KEGG和GO富集分析。KEGG结果显示在许多共同信号通路以及与凋亡、激素信号传导和紧密连接相关的通路中富集（图S2A）。GO结果显示在与转录因子相关的生物过程和细胞组分中富集（图S2B）。

3.2. AOP网络揭示Al诱导的男性不育中的氧化应激作为关键事件
在CTD数据库中，我们筛选了四种男性不育亚型的表型，识别出2004个在所有条件下都存在的表型（图2A）。通过将这些表型与Al相关表型和已识别枢纽基因的GO富集结果进行交叉参考，我们共识别出35个关键表型（图2B）。我们从AOP Wiki下载了592个AOPs和2330个KE条目。通过将这35个与Al诱导的男性不育相关的关键表型（以GO ID表示）与KEs进行交叉参考，我们共识别出74个相关的AOPs。然后进一步筛选这些AOPs与男性不育的直接相关性，最终保留了四个AOPs和一个关键表型（GO:1903409代表“活性氧物种生物合成过程”）（图2C和表S4）。基于筛选出的AOPs中的KEs标识符（表S5），使用Cytoscape软件构建了Al诱导的男性不育的AOP网络（图2D）。最后，从这四个AOPs中构建了Al诱导的男性不育的核心AOP网络（图3）。
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图2. 基于表型数据和CTD数据库构建的Al诱导的男性不育的AOP网络。（A）通过与四种男性不育相关表型交叉参考获得的男性不育相关表型的Venn图。（B）Venn图显示Al相关表型、男性不育相关表型和候选基因富集表型的交集。（C）通过AOP WIKI识别与男性不育相关的AOP通路，并过滤相关性。（D）四个Al诱导的男性不育AOP网络及其关键事件（KEs）的分布。两个节点之间的边表示这两个AOP至少共享一个KE。
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图3. Al诱导的男性不育的定向AOP网络。该网络包括分子起始事件（MIEs，绿色）、关键事件（KEs，黄色）和不良结果（AOs，红色）组件，说明因果关系。
值得注意的是，氧化应激在这个网络图中是最关键的KE。因此，我们提出氧化应激是Al诱导的男性不育中的一个关键分子起始事件。此外，我们发现Leydig细胞主要参与这个AOP网络（KE：496），并且睾酮合成受损、BTB破坏和精子发生受损都是Al导致男性不育的关键KE。我们首次将氧化应激确定为Al诱导的男性不育中的MIE。然后我们建立了一个AOP框架，证明Al通过减少睾酮合成来损害精子发生。基于上述发现，我们随后研究了Al是否通过氧化应激影响Leydig细胞的睾酮合成能力，从而导致精子发生异常。

3.3. 孕期AlCl?暴露破坏小鼠睾丸的精子发生并降低类固醇生成蛋白的表达
为了评估孕期AlCl?暴露对后代睾丸功能的影响，我们检查了50天大的小鼠的睾丸。PAS染色显示，AlCl?处理剂量依赖性地破坏了精子发生上皮周期。具体来说，处于VII-VIII阶段的管状结构比例显著减少，这些阶段对精子发生至关重要，表明精子发生停滞（图4A）。与此一致，Western blotting和免疫荧光分析显示，AlCl?暴露小鼠的睾丸组织中StAR和HSD-3β这两种关键酶的蛋白水平显著下调（图1B和图S5A-B）。这些结果表明，孕期AlCl?暴露损害了睾丸的睾酮合成能力，导致精子发生紊乱。
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图4. 孕期AlCl?暴露在体内和体外破坏精子发生并降低类固醇生成蛋白。从妊娠第12.5天到出生，用0（对照）、10、40或100 mg/kg/天的AlCl?处理的母鼠所生的雄性后代在50天大时进行分析。
TM3细胞和原代Leydig细胞暴露于10 μM AlCl? 24小时。（A）Periodic Acid-Schiff（PAS）染色的代表性图像显示精子发生上皮周期，以及I-VI、VII-VIII或IX-XII阶段管状结构的比例的定量分析（n≥5只动物）。（B）睾丸组织中HSD-3β和StAR蛋白水平的Western blot分析。（C）使用Leydig细胞标记蛋白HSD3-β（红色）的免疫荧光确认提取的细胞确实是原代Leydig细胞。（D）通过ELISA测量原代Leydig细胞上清液中的睾酮水平。（E-H）通过Western blotting检测TM3细胞和原代Leydig细胞中的HSD-3β和StAR蛋白水平（n≥3只动物）。数据以平均值±SEM表示。****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05与对照组相比。
为了确认AlCl?对类固醇生成的直接影响，我们使用原代Leydig细胞和TM3 Leydig细胞系建立了体外模型。通过CCK8测定，我们观察到不同浓度和持续时间的AlCl?暴露导致TM3细胞活力变化（图S4）。这里，我们选择了较低浓度10 μM，该浓度没有诱导TM3细胞凋亡，用于后续研究。提取原代Leydig细胞后，我们用LC标记HSD-3β标记Leydig细胞，结果显示我们成功提取了原代Leydig细胞（图4C）。ELISA测定显示AlCl?处理显著降低了原代Leydig细胞的睾酮分泌（图4D）。此外，qRT-PCR结果显示AlCl?暴露显著降低了TM3细胞和原代Leydig细胞中的Star和Hsd3b的mRNA水平（图S5C-D）。这在蛋白质水平上也得到了证实，因为Western blotting确认AlCl?处理后两种细胞类型的StAR和HSD-3β蛋白表达显著减少（图4E-H）。

3.4.AlCl? 通过氧化应激激活 TM3 细胞中的内质网应激（ERS）
基于 AOP 网络的结果，我们研究了细胞应激途径以探索其潜在机制。流式细胞术分析显示，暴露于 AlCl? 后 TM3 细胞内的活性氧（ROS）显著增加（图 5A-B）。使用 Fluo-4 AM 荧光探针，我们还观察到 AlCl? 处理的细胞内钙离子（Ca2?）显著流入（图 5C-D）。鉴于 ROS 和 Ca2? 的失调是已知的 ERS 触发因素，我们假设 AlCl? 可能会激活莱迪希细胞（Leydig cells）中的 ERS。

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图 5. AlCl? 诱导 TM3 细胞产生 ROS、钙离子流入和内质网应激。细胞暴露于 10 μM AlCl? 中 24 小时。
(A, B) 流式细胞术分析及细胞内 ROS 水平的量化。
(C, D) 共聚焦显微镜图像及使用 Fluo-4 AM 探针对细胞内 Ca2? 水平的量化。
(E–H) 西部印迹（Western blot）分析及 ER 应激标志物 IRE1α、p-IRE1α、XBP1s 和 CHOP 的量化。
(I, J) IRE1α、p-IRE1α、XBP1s 和 HSD-3β 蛋白的西部印迹分析。
(K) 通过 ELISA 测量 TM3 细胞上清液中的睾酮水平。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示（n ≥ 3）。
***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 与对照组相比。

为了验证这一点，我们检查了未折叠蛋白反应（UPR）的关键标志物。西部印迹显示 AlCl? 激活了肌醇依赖性酶 1 α（IRE1α）通路，表现为 IRE1α 的磷酸化增加（p-IRE1α）及其下游效应物 XBP1（XBP1s）和 c/ebp 同源蛋白（CHOP）的表达升高（图 5E–H）。有趣的是，XBP1 正是我们之前鉴定出的枢纽基因之一（图 S2：Clueter2）。相比之下，qRT-PCR 分析显示 PERK 或 ATF6 通路没有显著激活，表现为 Atf4 和 Atf6 的 mRNA 水平未改变（图 S6A）。这些结果表明，IRE1α/XBP1s 通路是莱迪希细胞对 AlCl? 反应的主要 UPR 分支。

为了验证氧化应激在诱导 ERS 反应中的关键作用，TM3 细胞同时暴露于氧化应激清除剂 NAC 和 AlCl?。西部印迹分析显示 NAC 有效降低了 IRE1α 的磷酸化并下调了 XBP1s 蛋白表达（图 S6C-E）。这些发现证实了氧化应激作为介质的重要性。长期的内质网应激可导致细胞凋亡；然而，对凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的分析显示它们的比例没有显著变化，表明在这些条件下 AlCl? 未在 TM3 细胞中诱导凋亡（图 S6B）。这表明 AlCl? 诱导的睾酮合成减少不是细胞死亡的结果，而是 ERS 的直接结果。

为了确定 IRE1α/XBP1s 通路是否负责观察到的效应，我们将 TM3 细胞与 STF-083010（一种特异性抑制 IRE1α RNA 酶活性的抑制剂）共同处理。该抑制剂成功减弱了 AlCl? 诱导的 IRE1α 磷酸化和随后的 XBP1s 表达。重要的是，这种阻断恢复了 HSD-3β 的表达（图 5I-J）。与此一致的是，该抑制剂还逆转了 AlCl? 诱导的细胞上清液中睾酮水平的下降（图 5K）。此外，STF-083010 处理恢复了 StAR（图 S7A-B）和 LHR（图 S7C-D）的表达，这两种蛋白是睾酮合成的关键上游调节因子。这些结果证实 AlCl? 通过激活 IRE1α/XBP1s 内质网应激通路来抑制睾酮合成。

3.5. 非靶向代谢组学揭示 AlCl? 激活了内质网应激（ERS）
为了进一步阐明 AlCl? 诱导的内质网应激抑制睾酮合成的关键下游效应通路，我们对原代莱迪希细胞进行了非靶向代谢组学分析。PLS-DA 分数图中观察到 AlCl? 暴露组和对照组之间的明显分离，表明存在显著的代谢重编程（图 6A）。火山图突出了许多差异表达的代谢物，其中以关键的内源性大麻素 anandamide（AEA）的显著上调最为显著（图 6B）。KEGG 通路富集分析显示 ECS 是变化最显著的通路之一（图 6C）。通路活性得分进一步证实了 ECS 内代谢物的整体上调（图 S8A）。此外，网络毒理学研究和代谢组学 KEGG 通路之间的交集表明 ECS 可以受到 Al 的影响（图 6D），进一步证实了我们选择 ECS 作为研究对象的决定。AEA 由 NAPE-PLD 合成，并通过激活 CB1 发挥其作用。与代谢组学数据一致，西部印迹显示 AlCl? 暴露显著上调了 NAPE-PLD 和 CB1 的蛋白表达（图 6E）。AEA 的合成由 NAPE-PLD 催化，随后由脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）降解以供细胞利用。此外，RT-qPCR 结果表明 AlCl? 暴露不影响 Faah 的表达，强烈支持 AEA 的积累（图 S8B）。这些结果表明 AlCl? 暴露通过上调 NAPE-PLD 表达激活了莱迪希细胞中的 ECS，导致 AEA 积累和随后的 CB1 激活。

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图 6. 非靶向代谢组学确定内源性大麻素系统（ECS）是 AlCl? 在原代莱迪希细胞中激活的关键通路。原代莱迪希细胞暴露于 10 μM AlCl? 中 24 小时。
(A) PLS-DA 分数图显示对照组和 AlCl? 处理组之间的明显分离。
(B) 差异表达代谢物的火山图，突出显示 AEA。
(C) 通过气泡图可视化的 KEGG 丰富代谢物通路：大小表示代谢物数量，颜色强度表示 p 值大小。
(D) 候选基因富集结果和代谢组学富集结果的交集显示了一个共同的 KEGG 通路。
(E) NAPE-PLD 和 CB1 蛋白表达的西部印迹分析。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示（n ≥ 3）。
**P < 0.01, *P < 0.05 与对照组相比。

3.6. XBP1s 正向调节 NAPE-PLD，影响下游的 CB1/LHR/StAR 轴
使用 JASPAR 数据库（https://jaspar.elixir.no/analysis）进行的生物信息学分析预测 XBP1s 在 Nape-pld 启动子区域内有一个结合位点。为了验证这一点，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。结果表明，XBP1s 的过表达显著增强了 Nape-pld 启动子的转录活性（图 7A），证实 XBP1s 是 NAPE-PLD 表达的直接正向调节因子。为了模拟 ERS 的下游效应，我们在 TM3 细胞中过表达了 XBP1s。这导致 NAPE-PLD 及其下游受体 CB1 的蛋白水平增加，同时抑制了 LHR 和 StAR 的表达（图 7B 和图 S9A-E）。重要的是，单独过表达 XBP1s 就足以显著降低睾酮合成（图 7C）。这些结果建立了直接的机制联系：AlCl? 诱导的 ERS 激活 XBP1s，后者通过转录上调 NAPE-PLD，从而参与抑制类固醇生成。

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图 7. XBP1s 在转录上激活 Nape-pld，敲低 Nape-pld 或 Cnr1 可逆转 AlCl? 诱导的睾酮合成抑制。
(A) 双荧光素酶报告基因实验显示 XBP1s 过表达增加了 HEK-293T 细胞中 Nape-pld 启动子的转录活性。
(B) 在过表达 XBP1s 的 TM3 细胞中，对 XBP1s、NAPE-PLD、CB1、LHR 和 StAR 蛋白的西部印迹分析。
(C) 通过 ELISA 测量过表达 XBP1s 的 TM3 细胞上清液中的睾酮水平。
(D-E) 西部印迹分析显示 shNape-pld 恢复了 AlCl? 处理细胞中的 LHR 和 StAR 表达。
(F-G) 西部印迹分析显示 shCB1 恢复了 AlCl? 处理细胞中的 LHR 和 StAR 表达。
(H-I) ELISA 实验显示敲低 Nape-pld 或 Cnr1 可恢复 AlCl? 处理细胞中的睾酮水平。
数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示（n ≥ 3）。
***P < 0.001, *P < 0.05 与对照组相比。

为了确认 NAPE-PLD 和 CB1 在此通路中的关键作用，我们使用了 shRNA 介导的敲低。敲低 Nape-pld 不仅降低了其表达，还降低了 CB1 蛋白水平，同时恢复了 LHR 和 StAR 的表达（图 S9F-G）。同样，敲低 Cnr1（CB1）也导致 LHR 和 StAR 表达上调（图 S9H-I）。西部印迹结果证实，在 AlCl3 处理的细胞中，敲低 Nape-pld 减弱了 CB1 的上调并恢复了 LHR 和 StAR 的表达（图 7D-E）。同样，Cnr1 的敲低也在 AlCl3 存在的情况下恢复了 LHR 和 StAR 的蛋白水平（图 7F-G）。最重要的是，在 AlCl3 处理的细胞中，敲低 Nape-pld 或 Cnr1 足以恢复睾酮合成的抑制（图 7H-I）。这些数据明确表明，NAPE-PLD/CB1 轴是 AlCl3 诱导的内质网应激抑制睾酮合成的关键下游效应通路。

4. 讨论
早期胚胎发生的发育窗口对环境刺激异常敏感。虽然先前的研究集中在成年 AlCl? 暴露的生殖毒性上，但我们的工作强调了发育期暴露可能导致深刻且持久的缺陷（Chen 等，2024）。妊娠期 AlCl? 暴露会干扰母体-胎儿的营养转移，并直接影响后代的器官发生（Reinke 等，2003）。近年来，用于建立 AlCl? 暴露模型的剂量范围通常为 50–1000 mg/kg/天（Yokel，2020）。文献证实，超过 100 mg/kg/天的 Al 暴露浓度会导致胚胎的显著发育毒性（Pi 等，2019），而 40 mg/kg/天的 AlCl? 暴露不会引起母体毒性（Domingo，1995）。因此，我们选择了较低的暴露浓度 10 mg/kg/天，以及 40 mg/kg/天和 100 mg/kg/天，来研究低剂量 AlCl? 对后代小鼠睾丸发育的影响。我们的发现建立在之前的工作基础上，之前的研究表明胚胎期 AlCl? 暴露会延迟青春期并减少精子数量，部分原因是通过干扰塞尔托利细胞（Sertoli cells）调节的生精小管（BTB）（Chen 等，2024）。本研究提供了缺失的环节，证明 AlCl3 还直接针对莱迪希细胞，损害了睾酮的生成，而睾酮对塞尔托利细胞功能和整体精子发生至关重要（Smith 和 Walker，2014）。

我们研究的一个关键机制见解是 ERS 作为 AlCl? 毒性的核心节点。内质网（ER）是类固醇生成的关键场所，包含 HSD-3β 等酶，并且对细胞稳态的干扰非常敏感，例如我们观察到的 ROS 产生和钙离子流入（Lim 等，2023a）。IRE1α-XBP1 通路是 UPR 最保守的分支，涉及 XBP1（XBP1U）mRNA 的剪接，产生强效的转录因子 XBP1s，后者调节下游靶基因的表达（Hetz 等，2020）。我们的结果显示 AlCl? 激活了 UPR 的 IRE1α-XBP1s 通路。XBP1s 可以作为转录因子调节 CHOP 的表达（Saraswat Ohri 等，2021）。CHOP 蛋白的持续表达会导致细胞凋亡，从而影响睾酮合成。也有报告表明 CHOP 可以直接结合 StAR 来调节睾酮合成（Mou 等，2024）。有趣的是，尽管促凋亡因子 CHOP 上调，但在测试浓度下我们没有在 TM3 细胞中观察到显著的凋亡。这表明主要毒性效应是类固醇生成的功能障碍，而不是明显的细胞毒性，这对于理解低剂量环境暴露至关重要。

本研究的一个关键发现是通过非靶向代谢组学发现的 ECS 通路的显著上调。ECS 是下丘脑-垂体-性腺轴、精子发生和睾丸激素分泌的公认调节因子（Maccarrone 等，2021；Lim 等，2023b；Bovolin 等，2014）。具体来说，我们确定了编码 AEA 合成酶 NAPE-PLD 的基因 Nape-pld（Okamoto 等，2004）是 XBP1s 的直接转录靶点。虽然已知 SP1 可以调节 Nape-pld 的转录（Zhu 等，2011），但我们确定 XBP1s 作为新的调节因子提供了环境毒素诱导的细胞应激与 ECS 激活之间的直接机制联系（Lewis 等，2012）。尽管由于技术限制无法直接量化细胞内的 AEA，但多方面的证据一致支持 NAPE-PLD/CB1 轴在此背景下的功能必要性。这些证据包括 XBP1s 介导的其合成酶 NAPE-PLD 的转录上调，其水解酶 Faah 的稳定水平，以及 shRNA 介导的 Nape-pld 或 Cnr1（CB1）敲低后睾酮生成的完全恢复。越来越多的证据表明 ECS 是环境污染物的共同靶点。例如，邻苯二甲酸酯增塑剂 DiNP 通过改变 NAPE-PLD 和 FAAH 的表达来破坏斑马鱼生殖腺中的 ECS，从而损害生殖功能（Forner-Piquer 等，2018）。此外，特定的大麻素已被证明可以诱导 ERS 并选择性地激活 IRE1α 分支，这与本研究中观察到的 IRE1α/XBP1s 通路激活一致（Alves 等，2024）。总之，这些发现表明 ERS-ECS 交互作用代表了环境毒理学中的一个新调节节点，可能作为重金属诱导的内分泌紊乱的保守机制。

为了系统评估本研究中提出的 AOP 的置信度，我们进行了证据权重（WoE）分析。根据经合组织（OECD）的指导原则，我们提出的因果关系路径（AOP）因坚实的实证支持而具有较高的可信度。具体而言，氧化应激作为关键诱导因素（MIE）的作用通过NAC救援实验得到了验证，这些实验有效中和了活性氧（ROS），并抑制了下游IRE1α/XBP1s的激活。最终，这项研究阐明了铝（Al）诱导的男性生殖毒性的分子机制，为评估环境铝暴露的健康风险提供了一个新的AOP框架。通过识别关键事件（KEs）及其因果关系，该AOP能够有效指导基于机制的体外筛选和预测性毒理学研究。未来的研究应进一步探讨这一AOP是否适用于其他重金属或环境污染物，并确定是否存在性别或发育阶段依赖性的脆弱性。

5. 结论
总之，本研究建立了一个针对铝诱导的男性不育的AOP框架，并通过风险评估（WoE）分析（表S6）验证了其高可行性。具体来说，我们证明了母体暴露于AlCl?会通过一种新的多步骤机制损害男性后代的睾酮合成。AlCl?在莱迪希细胞（Leydig cells）中诱导细胞应激反应（ERS），激活IRE1α/XBP1s通路。XBP1s随后转录上调NAPE-PLD，促进AEA的合成并激活CB1受体。这一级联反应最终抑制了LHR和StAR的表达，破坏了细胞的类固醇生成能力，导致精子发生异常（图8）。我们的发现弥合了重金属毒理学、细胞应激生物学和内源性大麻素信号传导之间的差距，为理解发育过程中的环境暴露如何导致成年生殖功能障碍提供了新的范式。

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图8. AOP网络展示了铝诱导的精子发生受损的过程。具体分子机制包括铝暴露通过氧化应激和钙离子内流诱导ERS，从而激活IRE1α/XBP1通路。这一过程导致NAPE-PLD转录上调和AEA积累增加。最终，它导致CB1受体过度激活以及LHR和StAR表达受到抑制，从而减少睾酮合成，最终导致精子发生异常。

作者贡献声明：
陈俊涵：撰写——原始草稿、研究、正式分析、概念化。
夏云辉：方法学。
林宗宇：研究。
甘卫东：监督、资金获取。
任凯：正式分析。
杨凤莲：资源、数据管理。
王俊丽：资源、资金获取。
李东梅：撰写——审阅与编辑、资源、项目管理。