可生物降解的土壤塑料球层：推动微生物变化和抗生素耐药性传播的热点区域

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：The soil biodegradable plastisphere: A hotspot driving microbial shift and antibiotic resistance dissemination

　　普宇浩|小花佳|环环石|双志|桂英江|英腾|石亮刘|大昌王|北北王
河南农业大学资源与环境学院，郑州450046，中国

**摘要**
可生物降解塑料（BPs）作为传统塑料的替代品，可能会通过影响微生物群落和加速抗生素抗性基因（ARG）的传播而加剧土壤污染。然而，BP生物降解与ARG传播之间的内在关系仍不甚明了。我们使用可生物降解的聚丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸酯（PBAT）和聚乳酸（PLA）薄膜进行了土壤微宇宙实验。结果表明，这两种塑料都发生了显著的生物降解，其中PBAT的重量损失和二氧化碳排放量比PLA更为明显。宏基因组分析显示，塑料表面形成了独特的细菌群落和ARG谱型，尤其是PBAT表面，与周围土壤形成了明显的差异。在PBAT塑料生态圈中富集的关键属包括Variovorax、Pseudomonas和Rhodococcus，而在PLA中富集的属是Sphingomonas，这些菌株被认为是潜在的BP降解菌和ARG的主要宿主。宏基因组组装基因组分析进一步表明，PBAT塑料生态圈中的这些菌株携带了大量的ARG和移动遗传元件（MGEs），表明其水平基因转移（HGT）潜力高于PLA。我们的发现为BP生物降解驱动的微生物-ARG相互作用提供了新的见解，并为全面评估BP的环境风险提供了科学依据。这一认识对于在“同一健康”框架下制定综合环境和公共卫生策略至关重要。

**1. 引言**
农业塑料薄膜虽然提高了作物产量和农民收入，但也导致了各种环境污染，如微塑料（MPs）的积累[1]。可生物降解塑料（BPs）作为一种有前景的替代品，理论上可以完全降解为二氧化碳和水[2]。其中最常用的BPs包括聚丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸酯（PBAT）、聚乳酸（PLA）和聚羟基烷酸酯（PHAs），它们常被用作农业中的可生物降解地膜和播种盘[3]。然而，它们在土壤中的实际降解过程往往缓慢且不完全，其环境影响仍存在争议。据报道，BPs可能比传统塑料更快地分解，从而在较短的时间内产生更多的微塑料[4]。此外，“塑料生态圈”——即形成在BP表面的独特生物膜[5]——已被证明会影响土壤微生物组、生态系统功能（如碳循环、硝化过程）和基因交换[6][7]。同时，塑料生态圈内的微生物组合是驱动塑料基质降解的关键因素[8]。塑料生态圈是微生物活动的高热点，聚合物的分解促进了抗生素抗性基因（ARGs）的出现和传播，成为ARG的储存库[9]。塑料生态圈中密集的微生物定植进一步促进了水平基因转移（HGT），加速了ARG在不同菌株间的传播[10]。ARG的丰度和多样性在很大程度上取决于细菌群落，而细菌群落也是BP降解的主要贡献者[9]。因此，探索BP的降解动态和微生物组的组装对于评估ARG的生态风险至关重要。一些研究专门探讨了土壤生态系统中BP生物膜中ARG的分布[11][12]，甚至有研究警告称，可生物降解塑料生态圈可能比传统塑料具有更大的ARG放大风险[13]。尽管土壤中BP的降解是由选择性招募的微生物群落驱动的，但这一过程如何具体影响抗生素抗性的出现和传播仍不清楚。此外，BP生物降解与ARG谱型及其相关风险之间的潜在耦合需要更深入的表征。

为了解决这些空白，本研究提出了这样一个假设：形成在可生物降解塑料（BPs）上的塑料生态圈是一个独特的生态热点，它选择性地富集了微生物降解菌，这些降解菌同时也是抗生素抗性基因（ARGs）的关键宿主，从而促进了ARG的传播。我们通过将PBAT和PLA薄膜在土壤中培养120天来验证这一假设：（i）量化BP的降解情况；（ii）分析塑料生态圈的微生物组并识别潜在的降解菌；（iii）通过宏基因组组装基因组（MAGs）来表征ARG宿主及其迁移潜力。我们的发现揭示了BP塑料生态圈在放大环境抗性风险方面的作用被低估了，为在“同一健康”框架下进行生态风险评估和可持续管理BP提供了关键见解。

**2. 材料与方法**
2.1. 土壤和塑料薄膜
土壤样本取自河南省平顶山的一个农业田地。土壤样品经风干后通过10目（2毫米）筛子筛选，去除植物残渣和石块。土壤在25°C下预培养一周，并调整水分至最大持水能力的60%。PBAT和PLA颗粒购自东莞市成杰塑料化工有限公司（广东）。PLA的氮（N）、碳（C）和氢（H）含量分别为0.22%、49.76%和5.30%；PBAT的氮、碳和氢含量分别为0.31%、63.00%和6.42%。PBAT和PLA塑料薄膜的制备方法参照以往研究[8]，每片薄膜重量约为15毫克，尺寸为20毫米×20毫米。

2.2. 土壤微宇宙实验
将50克（干重）土壤放入150毫升的玻璃瓶中，并用透气盖密封。实验包括以下三种处理，每种处理重复三次：（1）对照组，即不放置塑料薄膜的土壤；（2）PLA组，土壤中埋有4片PLA薄膜；（3）PBAT组，土壤中埋有4片PBAT薄膜（见图S1）。每种处理还准备了五倍的重复样本用于二氧化碳（CO?）测量。所有微宇宙在25°C下黑暗条件下培养120天，土壤湿度保持在最大持水能力的60%。对照组、PLA组和PBAT组的土壤样本分别称为S-Control、S-PLA和S-PBAT。PLA和PBAT处理中的塑料薄膜分别称为F-PLA和F-PBAT。培养过程中塑料薄膜表面形态和官能团的变化详见支持信息文本S1和S2。

2.3. 重量损失和矿化率
小心收集塑料薄膜，用蒸馏水清洗以去除附着的土壤，然后风干并称重。重量损失（WL，%）的计算公式如下：
WL% = (W0 - W1) / W0 × 100%
其中W0和W1分别代表薄膜的初始重量和剩余重量。

对于CO?分析，使用气密注射器在预定时间间隔从每个瓶子的顶部空间抽取20毫升气体，并注入12毫升的圆柱瓶中。CO?浓度通过气相色谱仪（Agilent GC7890A，美国）进行测定，具体方法见补充信息文本S3。PLA/PBAT薄膜的矿化率（M，%）的计算公式如下：
M% = （样品产生的累计CO?量）/ （样品的理论CO?产量）× 100%
样品的理论CO?产量根据埋藏的PLA和PBAT薄膜的碳（C）含量计算。每种处理的累计CO?量通过减去对照组培养过程中的内源性CO?产量得出。需要注意的是，该计算未考虑塑料对土壤有机物的潜在启动效应。

2.4. 塑料薄膜的表征
使用扫描电子显微镜（SEM）观察BP薄膜的微观结构。使用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR；Thermo Scientific Nicolet iS20）分析聚合物表面的化学基团。光谱覆盖4000至650厘米?1的波长范围，分辨率为4厘米?1，每个样品采集32次扫描。

2.5. DNA提取和宏基因组测序
使用FastDNA? SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）从土壤中提取总DNA。纯化的DNA在Illumina NovaSeq平台上进行测序（Majorbio，中国），所有样本的原始数据量约为57.9 GB。为了进行分类和功能注释，代表性序列使用DIAMOND和BLASTP与NCBI NR数据库比对，严格标准为e值≤1×10??，相似度>70%。使用SOAPaligner（soap2.21release）量化宏基因组数据中的基因丰度，使用CoverM（版本0.6.1）量化MGEs的丰度。不同数据集的标准化程序（RPKM/RPM/百分比）在图例中说明。原始序列数据可在NCBI SRA中找到，访问号为PRJNA1192558。

2.6. 宏基因组分箱和基因鉴定
使用fastp（v0.23.0）对原始测序数据进行质量控制，生成干净的读段。长度≥1000 bp的contigs使用三种互补工具进行分箱：MetaBAT2（v2.12.1）、CONCOCT和Maxbin2。三种方法得到的分箱结果通过DAS工具（v1.1.0）整合和优化，生成一组高置信度的分箱。随后使用RefineM（v0.0.24）（https://github.com/wwood/RefineM）对分箱结果进行进一步优化，并将其指定为MAGs。使用CheckM（v2.0.1）[14]根据完整性和污染程度评估MAGs的质量。只有满足高质量阈值（完整性>50%且污染<10%）的MAGs被保留用于后续分析。

通过将非冗余基因目录与综合抗生素抗性数据库（CARD）进行比对，鉴定ARGs和抗性机制。使用专用MGE数据库（https://github.com/KatariinaParnanen/MobileGeneticElementDatabase）和毒力因子数据库（VFDB）检测移动遗传元件（MGEs）和毒力因子（VFs）。通过识别在同一contig上与MGEs共定位的ARGs/VFs来评估水平基因转移（HGT）潜力。位于MGE 5 kb范围内的基因被认为是潜在的可移动基因[15]。这些易发生HGT区域的遗传背景被可视化，以展示其组织结构。

2.7. 统计分析
使用SPSS 21.0进行单因素方差分析，统计显著性定义为p<0.05。使用Major BioCloud Platform（www.majorbio.com）和R 3.3生成条形图、热图和基于Bray–Curtis相似性矩阵的主坐标分析（PCoA）。使用ccgraph R包构建圆形网络图[16]。使用Gephi交互平台分析ARGs与细菌属之间的相关性网络。为了识别显著富集的ARG亚型，应用了线性判别分析效应大小（LEfSe）以及非参数Kruskal–Wallis检验和sum-rank检验。随后使用线性判别分析（LDA）评估不同样本组间ARG亚型的差异显著性[17]。最终图形的优化和整合使用Adobe Illustrator和Origin 9.0完成。

**3. 结果与讨论**
3.1. PLA和PBAT薄膜在土壤中的降解
PBAT和PLA薄膜在土壤中的外观随着埋藏时间的延长而逐渐变化（见图1a）。PBAT表面在30天后首次出现小孔，随着时间的推移损伤变得更加明显。培养120天后，PBAT薄膜严重破碎。相比之下，PLA薄膜在60天内基本保持完整，之后变得较薄，出现裂纹和微孔，并变得脆弱。SEM进一步显示PLA表面有多个孔洞和裂纹，而PBAT表面则表现出广泛的粗糙度和大量不规则孔隙（见图S2），这与图1a中的宏观观察结果一致。

为了量化薄膜在土壤中的降解情况，测定了它们的重量损失（见图1b）和矿化率（见图1c）。PBAT的重量在最初30天内仅略有下降，随后急剧减少，120天时总重量损失为79.23%。相比之下，PLA在120天内的重量损失仅为4.64%。先前的研究已经明确表明，PBAT的碳可以被土壤微生物吸收并矿化为二氧化碳[18]。量化净CO?排放量（扣除背景土壤呼吸作用后）可以视为聚合物矿化的可靠指标[19]。与重量损失一致，PLA薄膜在120天后的矿化率很低（3.55%）（见图1c）。然而，PBAT的矿化率从60天的11.60%显著增加到90天的25.46%，远高于PLA。许多研究证实了PLA和PBAT在土壤中的微生物矿化[20]，它们的生物降解性差异源于其分子结构和降解途径。PBAT是一种脂肪族-芳香族聚酯，其芳香族部分提供了优异的物理性能，而脂肪族链在某些条件下促进了其降解[21]。PLA主要通过缓慢的水解作用在堆肥条件下降解，但在土壤中的这一过程明显较慢[22]。因此，我们研究中观察到的PLA降解速度比PBAT慢的现象与先前的研究结果一致[23]。ATR-FTIR分析进一步证实了PLA和PBAT薄膜在土壤中生物降解过程中发生的结构变化（图S3）。对于PLA，特征吸收峰在1744 cm?1（酯基CO伸缩）、1180 cm?1和1080 cm?1（CO伸缩）处的减弱，以及871 cm?1（O–CH–CH?）峰的宽化和增强，共同表明PLA发生了水解链断裂，从而证实了其在土壤中的生物降解[22]、[24]、[25]。在PBAT的情况下，CO（1710 cm?1）和CO（1250, 1101 cm?1）伸缩峰的减弱表明聚合物发生了分解，而-CH?-伸缩峰（2930, 2959 cm?1）的相对增加则表明聚合物链中的酯键优先发生断裂[26]、[27]。因此，ATR-FTIR的发现提供了分子层面的证据，明确证实了这两种聚合物在土壤中不同的生物降解过程。

3.2. 塑料驱动的土壤与塑料圈微生物群落差异
α-多样性分析显示，土壤样本（S-Control、S-PBAT、S-PLA）和塑料圈样本（F-PBAT和F-PLA）之间的细菌群落存在显著差异（图2a）。与土壤样本相比，塑料圈中的Simpson指数显著增加，表明塑料薄膜上的细菌多样性更高。相反，ShannonEven指数在塑料圈中显著下降，特别是F-PBAT，这表明塑料表面促进了少数优势物种的富集，同时减少了其他物种的相对丰度。基于Bray-Curtis差异性的主坐标分析（PCoA）进一步展示了细菌群落之间的明显聚类模式（图2b）。土壤样本（S-Control、S-PLA）形成了一个紧密的簇，与塑料圈样本（F-PBAT、F-PLA）明显分开。值得注意的是，尽管S-PBAT和F-PBAT簇保持分离，但它们之间的距离比与其他土壤样本的距离更小，表明它们的群落组成趋于一致。这种分离通过ANOOSIM分析得到了统计支持（R2 = 0.573，p = 0.001）（表S1），证实了塑料圈中形成了独特的细菌组合，并且群落组成受到塑料类型的强烈影响。塑料的存在不仅选择性地富集了某些细菌，还引起了周围土壤群落的微妙但显著的变化[28]，这从S-PBAT样本的独特聚类中可以得到证明。细菌组成显示，Proteobacteria在F-PBAT塑料圈中占主导地位，同时Bacteroidetes也有轻微增加（图S4）。在F-PLA中，Proteobacteria和Actinobacteria都有中等程度的富集。相比之下，Acidobacteria、Chloroflexi和Gemmaimonadetes在两个塑料圈中的数量都显著减少，这与先前的研究结果一致[29]、[30]。这些发现表明，Bacteroidetes和Proteobacteria可能含有能够降解PBAT的微生物类群，这解释了它们在PBAT薄膜上的富集[31]。同样，Actinobacteria在PLA薄膜上的富集也与它们已知的聚酯降解能力相符[32]。

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图2. 土壤和塑料圈中细菌群落多样性和组成的评估。(a) α-多样性指数（Simpson和ShannonEven），(b) 基于Bray-Curtis差异性的主坐标分析（PCoA），(c) 孵育120天后优势细菌属的丰度热图（RPKM）。分类级别缩写如下：d，域；p，门；c，纲；o，目；f，科。

在属水平上，土壤和塑料圈样本之间的细菌组成存在显著差异（图2c和图S5）。为了识别潜在的PBAT和PLA降解菌，我们进一步分析了在塑料薄膜上富集的微生物类群。与对照土壤（S-control）相比，PBAT塑料圈中有11个属显著富集，包括Variovorax、Pseudomonas和Rhodococcus。先前的研究表明这些属参与了PBAT的生物降解。例如，某些Pseudomonas菌株通过分泌蛋白酶和脂肪酶来促进PBAT在土壤中的生物降解，这些酶通常与其他细菌协同作用[33]、[34]。同样，Rhodococcus、Variovorax、Bradyrhizobium和Hyphomicrobium也被报道为潜在的PBAT降解菌[31]、[35]。值得注意的是，Variovorax和Pseudomonas的富集——这两种菌都以代谢芳香化合物而闻名——表明它们可能直接适应了PBAT的芳香部分，从而有助于这种难以降解成分的分解[36]。在PLA塑料圈中显著富集的8个属中，Sphingomonas的突出地位特别值得关注。作为一种公认的脂肪族聚酯降解菌，它的富集与PLA的脂肪族结构相符[3]、[38]。这种与底物相关的富集模式表明，塑料化学性质可能选择性地塑造了塑料圈的微生物群落。这些专门的群落可能通过特定的酶途径参与聚合物的分解，暗示了群落变化与降解动态之间的联系。总体而言，在塑料圈中显著富集的微生物类群在生物降解过程中起着重要作用。土壤群落的变化可能是由于降解中间产物的渗出或来自塑料圈的更广泛生态效应造成的，这突显了塑料圈本身是这些潜在降解相关相互作用的主要场所。

3.3. 塑料圈作为抗生素抗性基因（ARGs）的热点
宏基因组分析揭示了不同处理之间ARGs分布的显著差异，F-PBAT显示出的总ARG负荷（27,028.27 RPM）几乎是SCK对照（9823.30 RPM）的三倍。虽然S-PBAT也显示出ARG丰度的增加（10,508.27 RPM），但两种PLA处理的ARG水平与对照相似（F-PLA：10,162.27 RPM；S-PLA：9933.77 RPM），这进一步强调了基于PBAT的塑料圈在土壤环境中作为关键ARG储存库的特定作用[9]。所有样本中最普遍的ARG类型是多重耐药性、MLS和四环素抗性基因（图3b）。值得注意的是，包括macB（MLS）、tetA（四环素）、evgS、bcrA和oleC（多重耐药性）在内的主要亚型在所有样本中都普遍存在（图S6）。多重耐药性基因在两种类型的塑料薄膜中都显著富集，尽管它们的具体谱型有所不同。LEfSe分析表明，PLA塑料圈主要富集了多重耐药性和糖肽抗性基因，而PBAT塑料圈则富集了更广泛的抗性类型，包括多重耐药性、氟喹诺酮类和β-内酰胺类抗性（图S7）。这种塑料类型特异性的富集通过PCoA得到了进一步证实，PCoA显示塑料圈（F-PBAT、F-PLA）与大量土壤样本之间存在明显的分离，表明塑料圈中建立的独特ARG谱型受到聚合物类型的强烈影响（图3c）。

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图3. 土壤和塑料圈样本中ARGs的组成谱型和变化。(a) 样本中ARG丰度（RPM）的分布。(b) 主要ARG类的组成。(c) 基于Bray-Curtis距离的ARG谱型的PCoA。

我们进一步研究了相关的抗性机制，发现抗生素外排和靶标修饰是所有样本中的主要策略（图S8）。在PBAT薄膜中特别检测到抗生素外排的显著增加，这与可生物降解的微塑料可以在土壤中上调外排泵基因的报告一致[39]。这可能是由于独特的PBAT塑料圈微生物群落，其中不同的微生物组成和ARG谱型共同驱动了抗性机制的变化[11]。此外，抗生素外排会主动将抗生素从细菌细胞中排出，大大降低了其杀菌效果，从而赋予细菌生存优势，并促进了ARGs的传播，从而对环境健康构成重大风险[40]。因此，根据它们独特的ARG谱型和抗性机制对塑料进行分类和管理对于制定更安全、更可持续的塑料政策至关重要。

3.4. 降解塑料的细菌作为ARGs的主要宿主
为了识别ARGs的主要宿主，我们进行了全面的分类学分析。结果揭示了不同塑料类型之间ARG宿主分布的明显模式。在PBAT塑料圈中，ARG宿主主要由Proteobacteria主导（84.2%），而在PLA塑料圈中，Proteobacteria（41.4%）和Actinobacteria（26.0%）的群落更为混合——这一谱型与大量土壤样本相似（图S9）。鉴于塑料薄膜上ARGs的显著积累，而土壤背景相对均匀（图S10），我们将分析重点放在塑料圈中的属水平ARG宿主上（图4a）。值得注意的是，不同塑料类型选择了不同的ARG宿主组合（图4a, b）。Sphingomonas是PLA塑料圈中多种ARG的主要储存库，尤其是那些赋予β-内酰胺和多重耐药性的ARG。在PBAT塑料圈中，ARG宿主谱型主要由Variovorax和Pseudomonas主导，这些菌携带了对抗氟喹诺酮类、四环素类、MLS和糖肽类的抗性基因。

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图4. 细菌与ARGs的关系。(a) 塑料圈样本中ARG宿主的层次网络关联。内环：门或属水平的细菌宿主，外环：主要ARG类型。节点大小代表丰度。单个ARG的百分比是通过该ARG的覆盖度除以一个样本中所有ARG的覆盖度总和计算得出的。(b) 显示细菌属对所有样本中ARG丰度（RPKM）贡献的热图。

MAGs分析从九个细菌门中重建了83个高质量基因组（图5a）。基因组证据进一步将特定类群与塑料圈联系起来。重要的是，我们观察到塑料圈中特定MAGs的显著富集：F-PBAT中的Variovorax（MAG45、MAG62）、Rhodococcus（MAG43）和Pseudomonas（MAG19、MAG41），以及F-PLA中的Sphingomonas（MAG75）（图5b），提供了将这些类群与塑料栖息地联系起来的基因组证据。功能上，PBAT的生物降解是通过脂肪酶/蛋白酶的酶促水解启动的，生成单体如对苯二甲酸、己二酸和1,4-丁二醇。这些单体随后在细胞内转化为中间产物，如苯甲酸和2-乙酰-CoA，然后进入关键代谢途径——包括苯甲酸降解（ko00362）、丁酸代谢（ko00650）和丙酸代谢（ko00640）——最终进入三羧酸（TCA）循环（ko00020），完全矿化为CO?和H?O[32]。对组装基因组的分析显示，PBAT上富集的MAGs（MAG19、MAG41、MAG43、MAG45、MAG62）携带的与这些关键降解途径相关的基因数量显著高于其他MAGs（图S11；表S2）。这些发现共同表明，在PBAT塑料圈中显著富集的微生物类群在其生物降解过程中具有显著的基因组潜力。

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图5. (a) 从所有样本中恢复的MAGs的系统发育树。MAGs的丰度以RPKM表示。(b) 每个样本中MAGs的丰度。(c) ARGs与（d）前10个和（e）前100个最丰富的细菌属的相关网络。节点代表ARGs和属，颜色按细菌门分类，大小按丰度（RPKM）缩放。边缘代表显著相关性（Spearman ρ ≥0.5，p < 0.05），红色和绿色线条分别表示正相关和负相关。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

相关网络分析显示Proteobacteria与总ARG丰度之间存在强烈的正相关（图5c），突出了这一门作为关键降解菌和主要ARG携带者的双重作用。此外，ARGs丰度与富集的属Variovorax（R > 0.77，p < 0.01）、Pseudomonas（R > 0.68，p < 0.01）、Rhodococcus（R > 0.79，p < 0.01）和Sphingomonas（R > 0.60，p < 0.01）之间存在强烈的正相关（图5d；数据S1）。总体而言，这些结果表明，与PLA和PBAT降解相关的关键细菌属——Sphingomonas、Variovorax、Pseudomonas和Rhodococcus——同时是多种ARG类的主要宿主。这些细菌作为ARGs的重要宿主的作用得到了进一步的支持，因为有研究表明ARGs、塑料降解基因和VF在类似环境中频繁共存，强调了这种遗传协同作用[13]。因此，不同塑料形成的独特塑料圈似乎选择性地富集了专门的细菌类群，这些细菌类群同时积累了抗性基因，作为应对共浓缩污染物的适应策略[41]。这与我们的发现一致，即在PBAT中富集的MAGs不仅表现出增强的降解代谢潜力，还携带了更多的ARGs。因此，BP的降解不仅塑造了细菌群落，还影响了这些细菌群落的基因组成，使其具备了共传播抗性的能力。这表明BP并不是“白色污染”的万能解决方案，可能会对土壤生态系统健康构成持续和多方面的风险[2]。

3.5. 塑料圈中ARGs和毒力因子（VF）的共定位和转移
对83个MAGs的分析揭示了一个令人担忧的遗传谱型：所有MAGs都含有ARGs和MGEs，这些基因组中观察到了VF的显著共存（图6a；数据S2）。这些遗传元素的共存表明了一个可能有利于水平基因转移（HGT）的基因组环境，因为之前已有报道指出MGEs、VF注释基因和ARGs之间的空间接近性为潜在的转移效率提供了结构条件[42]。携带这种基因组合的细菌可以被视为潜在的“多重抗性细菌”（PARB），它们可能同时具备多重耐药性、增强的毒力和高传播性。特别值得注意的是，在PBAT塑料生态系统中，五种MAGs（MAG19（假单胞菌）、MAG41（假单胞菌）、MAG43（红球菌）、MAG45（变菌属）和MAG62（变菌属）显著富集，这些细菌不仅数量增加，还携带了所有三种遗传元件（抗性基因ARGs、移动遗传元件MGEs和病毒因子VF）（图6a）。这表明在PBAT塑料生态系统的生物降解过程中，携带更多ARG-MGE-VF共现模式的细菌属得到了选择性富集，这可能反映了与生态位适应相关的独特遗传特征。

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图6. MAGs的分类学分析以及ARGs、VF和MGEs的共定位。(a) 携带ARGs、MGEs和VF的83种MAGs的系统发育概览，气泡大小代表丰度（RPKM）。(b) ARGs、MGEs和VF的物理共定位，MGE/ARG或VF表示MGE与ARGs或VF之间的直接相邻关系。(c) 携带ARG的MAGs之间的水平基因转移（HGT）事件，匹配片段的身份和基因ID已标注。正向链和反向链上的基因分别用浅蓝色和浅绿色表示，预测为水平转移的基因用红色突出显示。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

进一步的基因组分析证实了ARGs、VF和MGEs的共定位，它们在共享的基因组片段上形成了一个遗传簇（图6b；数据S3、S4）。具体来说，在MAG41中，转座酶和VF与多重耐药基因soxR和肽类耐药基因armA共存；MAG19含有重组酶A以及多重耐药基因MexF和VF；MAG45和MAG62则携带四环素耐药基因（tetA、tetB）和多重耐药基因（MexT、optrA）以及Tn3型转座酶。毒力基因VF0082（增强摆动运动性和生物膜形成）和VF0091（作为抗吞噬粘附素）与多种耐药决定因子的持续共定位表明它们之间可能存在结构上的联系，这可能促进它们的共同转移。MetaCHIP分析进一步提供了活跃的HGT事件直接证据，确定了4次基因转移事件，其中MAG62（变菌属paradoxus）作为供体，将基因传递给四个受体MAGs，包括MAG64（JAKFDI01 sp.，adeL）、MAG65（根瘤菌属，kdpE）、MAG67（JAKFDI01 sp.，ligA）和MAG83（JAGOXX01 sp.，HSI-1）（图6c）。重要的是，MAG64和MAG67仅在S-PBAT样本中被检测到，证实了基因从塑料生态系统成功转移到了土壤中的细菌。相比之下，主导PLA塑料生态系统的Sphingomonas（MAG75）携带的ARGs、VF和MGEs最少，这突显了不同可降解塑料类型之间遗传风险特征的显著差异。

基于MAG的方法显著提高了ARG宿主识别的准确性，并为HGT提供了有力证据。塑料生态系统的独特生物膜环境似乎促进了ARG向潜在病原体的转移[43]，这一过程可能因BP降解产生的化学副产物而加剧。新兴证据表明，生物降解过程中产生的低分子量衍生物和活性氧（ROS）可以激活MGEs，从而显著提高水平基因转移率[13]。这种机制直接增加了对土壤生态系统功能和公共卫生的风险。此外，BP生物降解过程中产生的微塑料为ARGs的传播创造了额外的生态位，基于MAG的追踪证实了携带ARG的细菌从塑料生态系统转移到周围土壤中。这些发现表明，BP在土壤中的存在和生物降解会积极重塑ARG宿主群落，从而推动抗生素耐药性的富集和扩散。这一过程产生的环境健康风险远远超出了最初的塑料污染范围。

4. 结论

本研究证明，BP在土壤中会发生微生物降解，这一过程同时促进了ARGs的富集和扩散。通过为期120天的土壤埋藏实验，我们观察到PBAT的降解率显著高于PLA（分别为35.39%和3.55%）。此外，每种聚合物上富集的微生物类群不同，假单胞菌和变菌属主要定植于PBAT，而Sphingomonas主要定植于PLA——文献中报道这些属是相应聚合物的潜在降解者。值得注意的是，这些富集的微生物类群也是ARGs的关键储存库，与多重耐药性、β-内酰胺类和氟喹诺酮类耐药基因之间存在强正相关（p<0.01）。基于MAG的分析进一步表明，与PBAT相关的基因组携带的ARGs与MGEs和VF注释基因紧密共位，这种基因组结构为水平基因转移和潜在PARB的出现提供了可能性。甚至确认了活跃的HGT事件，其中MAG62（变菌属paradoxus）作为供体，将基因传递给四个受体MAGs，表明基因从塑料生态系统成功转移到了土壤中的细菌。总之，这些发现强调了一个被忽视的关联：BP生物降解过程中刺激的微生物群落可能会同时增加土壤抗性组的风险。因此，生物降解过程不仅仅是“塑料的消失”，而是ARGs和VF的主动富集以及MGE活性的增强，PBAT带来的风险比PLA更高。在“同一健康”框架下，对可降解塑料的全面评估不仅应考虑聚合物的消失，更重要的是它们对土壤抗性组的持久影响。未来的研究应制定BP管理策略，整合抗性组风险评估，并促进设计出耐药性选择潜力最小的聚合物。

作者贡献声明：
郝普宇：撰写——初稿、可视化、方法学、数据管理。
贾晓华：方法学、数据管理。
史欢欢：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。
志双：可视化、方法学。
姜桂英：监督、项目管理、方法学、资金获取。
滕颖：监督、方法学、概念化。
刘世良：监督、项目管理。
王大昌：撰写——审稿与编辑、监督。
王北北：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、资金获取、概念化。