《Frontiers in Microbiology》：Isolation, characterization and whole-genome analysis of a potentially novel strain of duck hepatitis A virus type 3 from a vaccinated duck flock in China
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本研究针对免疫鸭场仍暴发鸭病毒性肝炎（DVH）的问题，对分离到的一株新型鸭甲肝病毒3型（DHAV-3）HNAY2024进行了全基因组测序与系统发育分析。结果表明，该毒株在VP1关键抗原蛋白上存在突变，与近期国内外分离株（如埃及ZU-ARMY-DHA-36、河南HNXY23、山东WKX03）亲缘关系密切，具有潜在的疫苗逃逸能力，并可能改变了病毒对宿主的适应性与传播动力学，对鸭业疫病防控和生态安全具有重要警示意义。
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis, DVH）是严重威胁全球养鸭业的急性传染病，尤其在雏鸭中引起高死亡率。尽管疫苗接种和抗体被动免疫是主要的防控手段，但在中国等养鸭密集地区，疫情仍时有发生。近年来，研究人员观察到一种令人担忧的现象：一些已接种过疫苗或使用了高免抗体的鸭群，依然在日龄更大时（如20-26日龄）暴发肝炎，这与经典鸭甲肝病毒（Duck Hepatitis A Virus, DHAV）主要在1周龄内致病的认知相悖。这背后是否隐藏着病毒发生了关键变异，从而逃避了现有免疫保护？为了回答这一问题，一项针对中国河南某免疫鸭场分离到的疑似变异毒株的深入研究就此展开，相关成果发表在《Frontiers in Microbiology》期刊上。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，从出现临床症状的26日龄天府麻鸭肝脏样本中，利用鸭甲肝病毒3型特异性引物进行PCR检测，筛选出阳性样本。接着，将阳性样本处理后接种15日龄非SPF（无特定病原体）鹅胚进行病毒分离与纯化。然后，设计了9对覆盖病毒全基因组的引物，通过分段PCR扩增、克隆与测序，获得了毒株HNAY2024的完整基因组序列。最后，利用生物信息学软件（如DNASTAR Lasergene, MEGA 7）对全基因组及VP1基因进行序列比对、相似性分析和系统发育树构建，并利用AlphaFold3预测蛋白质三维结构以定位突变位点。
3.1 病毒的分离与鉴定
研究人员从临床样本中成功扩增出目标基因条带，并排除了鸭瘟、腺病毒、禽流感等其他常见病原感染。将阳性样本接种鹅胚后，观察到胚胎在接种5天后死亡，并呈现体型缩小、弥漫性充血等典型病理变化，肝脏出现明显充血和出血灶。从死亡胚胎的尿囊液及肝脾组织中均能再次PCR检测到病毒，证实成功分离到一株DHAV-3，命名为HNAY2024。
3.2 基因组的扩增
使用设计的9对特异性引物进行PCR，成功获得了覆盖病毒全基因组的9个预期大小的DNA片段，为后续基因组测序和组装奠定了基础。
3.3 全基因测序结果
3.3.1 分离株的全基因组遗传相似性分析
全基因组测序显示，HNAY2024毒株基因组全长为7,779 bp。相似性分析表明，该毒株与DHAV-3参考毒株的核苷酸相似性在91.9%至99.9%之间。其中，与2025年埃及分离株ZU-ARMY-DHA-36的相似性最高（99.9%），与2023年河南分离株HNXY23（98.5%）和2022年山东分离株WKX03（98.4%）也高度相似，而与2011年越南分离株DN2相似性最低（91.9%）。
3.3.2 分离株全基因组的遗传关系分析
基于全基因组序列构建的系统发育树显示，HNAY2024属于DHAV-3基因型，并与埃及株ZU-ARMY-DHA-36、河南株HNXY23和山东株WKX03形成一个紧密的进化支，表明它们之间存在较近的亲缘关系。
3.3.3 VP1蛋白的相似性与遗传关系分析
对关键抗原蛋白VP1基因的分析显示，HNAY2024的VP1核苷酸序列与DHAV-3参考毒株的相似性在88.0%至100%之间。基于VP1基因的系统发育分析将其归类为DHAV-3基因型I（GI）。其VP1序列与埃及株ZU-ARMY-DHA-36完全一致（100%），并与其他中国近期分离株（HNXY23, WKX03）亲缘关系密切。
3.3.4 全基因组突变位点分析
与亚洲参考毒株相比，HNAY2024在编码的多聚蛋白中发现了8个氨基酸替换位点：V413M（位于VP3蛋白第157位）、E683Q（位于VP1蛋白第190位）、V855I（位于2A蛋白第122位）、F892S（位于2A蛋白第159位）、S1149I（位于2B蛋白第111位）、T1151S（位于2B蛋白第113位）、E1519G（位于3A蛋白第29位）和K1956E（位于3D蛋白第158位）。值得注意的是，这些突变位点在埃及株ZU-ARMY-DHA-36中同样存在。
研究结论与讨论
本研究成功从中国河南一个实施过免疫的鸭场分离并鉴定出一株新型DHAV-3毒株HNAY2024。全基因组与VP1基因的系统发育分析表明，该毒株与近年来在中国河南、山东以及远在北非埃及分离的毒株亲缘关系非常接近，提示DHAV-3的进化可能突破了地理限制，与分离时间更具相关性，这可能与频繁的鸭及鸭产品贸易、家养与野生水禽之间的互动有关。
更为关键的是，该毒株在关键抗原蛋白VP1的C端高变区（HVR）存在E683Q突变，此区域是中和抗体的主要结合位点。这一突变，连同其他分布在结构蛋白（如VP3的V413M）和非结构蛋白（如2B、3A、3D）上的共7个突变，可能共同导致了病毒抗原性、复制适应性和宿主互作能力的适应性改变。临床数据显示，尽管鸭群接种了疫苗或使用了抗体，仍在20-26日龄发病，死亡率高，这打破了DHAV-3主要感染1周龄内雏鸭的经典模式。这强烈提示HNAY2024毒株可能具有疫苗逃逸潜力，其突变（尤其是VP1的突变）可能导致免疫失败，使得病毒在抗体水平下降后仍能感染并致病。
此外，非结构蛋白的突变也值得关注。2B蛋白中相邻的S1149I和T1151S突变可能增强其作为病毒孔蛋白（viroporin）破坏宿主细胞钙稳态的能力；3D蛋白（RNA依赖的RNA聚合酶）的K1956E突变则可能微妙地影响病毒复制酶的保真度或持续性。这些变化共同指向一个具有增强复制效能和潜在适应力的病毒谱系。
本研究的意义在于，首次详细报道了在中国免疫鸭场中出现的一株具有潜在疫苗逃逸能力的新型DHAV-3变异株。其基因特征和临床表现提示，现有的基于经典毒株的疫苗和抗体免疫策略可能面临挑战。该毒株的流行可能不仅对家鸭养殖业构成持续威胁，其增强的适应性也可能通过溢出效应影响共享栖息地的野生水禽种群，带来潜在的生态风险。因此，研究结果强调了持续进行田间病毒监测、及时更新疫苗毒株以及加强生物安全措施（包括限制家养与野生禽类接触）的紧迫性，为DHAV-3的防控和预警提供了重要的分子流行病学依据。
