《Applied and Environmental Microbiology》：A novel and evolutionarily distinct flavoprotein monooxygenase drives skatole degradation in Rhodococcus
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为解决持久性恶臭污染物粪臭素的生物降解机制不明问题，研究人员通过系统研究，在革兰氏阳性菌红球菌中鉴定出一种新型黄素蛋白单加氧酶FPMO SkaA，并解析了其催化粪臭素转化的新型环氧化代谢途径。该研究阐明了红球菌属内广泛的粪臭素降解能力，将SkaA确定为E组FPMOs中一个全新的亚类，为环境生物修复和酶学分类提供了新的见解。
在畜牧业、水产养殖、垃圾填埋和废水处理等多个领域，恶臭气体排放一直是困扰环境质量和公共卫生的难题。在这些复杂的恶臭混合物中，有一种名为粪臭素的化合物格外引人注目，它不仅因其极低的气味阈值而恶名昭彰，还以其在环境中的顽固性和已知的细胞毒性而闻名。粪臭素主要由色氨酸经微生物厌氧降解产生，能在特定环境中积累到令人担忧的浓度。尽管其合成途径已被逐步揭示，但其在环境中的最终归趋和转化机制却知之甚少，这严重阻碍了有效控制策略的开发。微生物降解被认为是解决这一问题的潜在途径，但此前的研究主要集中在革兰氏阴性菌，而对同样具有强大降解潜力的革兰氏阳性菌，特别是红球菌属，其降解机制仍存在巨大的知识空白。这项发表在《Applied and Environmental Microbiology》上的研究，就是为了系统揭示红球菌降解粪臭素的秘密。
为了回答这些问题，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，利用来自活性污泥和海洋沉积物的八株红球菌菌株，在两种培养基中评估了它们降解粪臭素的能力。其次，对包括新测序菌株在内的八株菌进行了全基因组测序和比较基因组学分析。再者，通过定量实时PCR、基因克隆和在大肠杆菌中异源表达，对候选关键基因skaA的功能进行了验证。此外，利用高分辨率液质联用技术鉴定了代谢产物。最后，通过大规模数据库比对和系统发育学分析，研究了SkaA同源酶的分布及其在E组黄素蛋白单加氧酶中的进化地位。
Skatole degradation is prevalent in Rhodococcusstrains
研究人员评估了八株红球菌菌株降解粪臭素的能力，发现所有菌株均具备该能力，但效率和表现具有菌株和培养基依赖性。在MS培养基中，菌株DMU1、DMU2和SJ-2在48小时内能完全去除粪臭素，而DMU114和DMU2021则需要96小时。在添加了酵母提取物的MSY培养基中，五株菌能在96小时内实现超过99%的降解。值得注意的是，菌株SJ-1和SJ-3在MS培养基中表现不佳，但在MSY培养基中48小时内就能完全去除。结果表明，粪臭素降解是红球菌属内一个普遍存在的特性，其中菌株DMU1在两种条件下均表现最佳。
Genome feature of the Rhodococcusstrains
通过对八株菌进行基因组测序和比较分析，研究人员确定了它们的物种分类：DMU1为R. aetherivorans；DMU2和E7为R. qingshengii；DMU114和DMU2021为R. pyridinivorans；SJ-1为R. ruber；SJ-2和SJ-3为未知物种。基因组分析不仅确认了已报道的粪臭素降解菌种，还将已知降解菌的范围扩展到了R. qingshengii和一个潜在的新物种，为生物修复提供了新的微生物资源。
Functional verification of the skatole oxygenase gene in strain DMU1
先前通过转录组学分析，在R. aetherivorans DMU1中鉴定出一个黄素蛋白单加氧酶基因skaA。定量PCR证实，该基因在粪臭素和吲哚的诱导下均被显著上调。研究人员将skaA基因克隆并在大肠杆菌中异源表达，结果发现重组菌株能够转化粪臭素，并能将吲哚转化为靛蓝色素，从而证实了SkaA的功能。
Skatole transformation product identification
研究人员利用高分辨率液质联用技术分析了代谢产物。在反应混合物中检测到了三个主要产物，均为粪臭素的单加氧异构体。其中，产物I被鉴定为3-甲基羟吲哚，产物II被证实为3-羟基-3-甲基羟吲哚。基于此，研究人员提出了一条新的粪臭素转化途径：SkaA首先催化粪臭素环氧化，形成不稳定的2,3-环氧-3-甲基吲哚中间体，随后该中间体进一步转化为3-甲基羟吲哚，并可能继续转化为3-羟基-3-甲基羟吲哚。
Distribution and genomic architecture of skatole degradation genes
基因组分析发现，skaA基因存在于本研究中使用的多个红球菌物种中。在典型的降解菌株如DMU1、R1和BCP1中，一个包含14个基因的ska基因簇是保守的。其中，skaAB编码的单加氧酶-还原酶复合物可能催化初始的环氧化反应，而一个三组分的芳环羟基化加氧酶系统可能负责后续的开环反应。
Taxonomic distribution of SkaA in the RefSeq and NR databases
通过同源性搜索发现，SkaA的同源酶主要分布在放线菌门中，其中诺卡氏菌属和红球菌属是主要的两个属。在非冗余数据库中，同源酶还分布在粘球菌门、酸杆菌门和假单胞菌门中。这表明，SkaA所代表的代谢能力在特定细菌类群中普遍存在。
SkaA belongs to Group E FPMOs
系统发育和结构域分析将SkaA明确归为E组黄素蛋白单加氧酶。这类酶通常以双组分系统运作，由一个专门的黄素还原酶为单加氧酶亚基提供还原型FAD。
SkaMOs form a new branch of Group E FPMOs
综合系统发育分析表明，已鉴定的SkaMOs形成了一个独立于已知吲哚单加氧酶和苯乙烯单加氧酶之外的、单系发生的进化分支，即SkaMO亚类。这个分支包含了来自革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的酶。研究人员还通过异源表达来自菌株SJ-1和R1的skaA基因，进一步验证了它们转化粪臭素的功能。
这项研究系统性地阐明，在环境适应性强的红球菌属中，粪臭素降解是一个普遍存在的性状。研究鉴定出新型单加氧酶SkaA，它催化了粪臭素代谢的起始氧化步骤，并解析了一条新的粪臭素环氧化途径。系统发育学分析揭示，SkaMOs构成了E组FPMOs中一个独特的亚类，与已报道的苯乙烯/吲哚单加氧酶序列相似性低于40%，从而重新定义了E组FPMOs的分类框架。研究人员还发现了不依赖skaA的降解途径，进一步凸显了该属代谢途径的冗余性和适应性。这些发现不仅为理解革兰氏阳性菌中粪臭素的分子代谢机制提供了新见解，也确定了红球菌作为一种有前景的、可用于粪臭素污染环境生物修复的强效生物催化剂。研究建立的系统发育分离框架，为未来预测和注释相关微生物中E组FPMOs的功能提供了有价值的工具。
