地中海地区百里香精油多样性的生态和遗传决定因素

《Biochemical Systematics and Ecology》：Ecological and genetic determinants of essential oil diversity in Mediterranean Thymus

　　约瑟夫·C·德尔·瓦列（José C. del Valle）、埃斯特·玛丽亚·马丁-卡雷蒂埃（Esther María Martín-Carretié）、弗朗西斯科·何塞·加西亚-卡德纳斯（Francisco José García-Cárdenas）、大卫·多布拉斯（David Doblas）、玛丽亚·安赫莱斯·奥尔蒂斯（María ángeles Ortiz）、约翰·汤普森（John Thompson）、佩琳·高蒂埃（Perrine Gauthier）、博迪尔·K·埃勒斯（Bodil K. Ehlers）、迭戈·尼埃托-卢希尔德（Diego Nieto-Lugilde）、雷吉娜·贝尔哈诺（Regina Berjano）
西班牙塞维利亚大学植物生物学与生态学系

**摘要**
地中海盆地是植物多样性的热点地区，许多物种能产生具有芳香性的精油，这些精油在调节生态相互作用和应激反应中起着重要作用。在唇形科（Lamiaceae）中，百里香属（Thymus）表现出显著的化学多样性，但种内精油的巨大差异往往限制了其分类学上的精确度。我们研究了伊比利亚半岛上39个百里香属Mastichina组的种群中的精油组成、遗传结构以及环境影响，利用气相色谱-质谱（GC-MS）技术结合土壤和气候数据来分析化学变异的驱动因素，并进一步完善分类特征。我们鉴定出14种主要化合物，其中以氧化单萜类为主。大多数种群表现出富含1,8-桉叶油醇（1,8-cineole）的化学类型，但有7个种群的芳樟醇（linalool）含量相对较高，且同一种群内常常存在多种化学类型，这表明种内化学多样性很高。包括樟脑（camphor）、莰烯（borneol）和莰（camphene）在内的次要化合物在不同遗传群之间存在差异，并与温度和降水量梯度显著相关。尽管主要化合物的含量相对稳定，但不同倍性水平和遗传群之间的精油相对丰度也存在差异，这表明某些化学特征既具有保守性也具有局部适应性。这些发现表明，百里香属Mastichina组的精油多样性是由环境条件、遗传背景和倍性共同作用的结果。整合化学、遗传和生态数据为理解地中海芳香植物的精油变异提供了全面的框架，对分类学、保护工作以及适应性化学特征的研究具有重要意义。

**1. 引言**
地中海盆地拥有丰富的植物多样性，约占世界维管植物的10%（Greuter, 1991; Cowling et al., 1996; Myers et al., 2000; Thompson, 2005; Blondel et al., 2010; Nieto Feliner et al., 2023）。该地区还以其芳香植物的丰富性而闻名，几乎一半的记录在案的属都能产生芳香精油（Ross and Sombrero, 1991; Thompson et al., 2003）。这些芳香化合物可能具有多种有益功能，如吸引传粉者（Knudsen and Tollsten, 1993; Zhang et al., 2023）、防御食草动物和病原体（Valladares et al., 2002; Solórzano-Santos and Miranda-Novales, 2012）、缓解非生物胁迫（Mansinhos et al., 2024），或向邻近植物发出信号以激活防御机制（Heil and Karban, 2010）。这种生态多功能性，加上对胁迫的形态适应性，可能推动了地中海地区芳香植物谱系的多样化和成功。此外，精油的组成常因其潜在的分类学价值而被研究，但种内高变异性限制了其作为诊断特征的使用（Thompson et al., 2003; Keefover-Ring et al., 2009）。当与遗传分析结合时，精油谱型可以提高分类精度，有助于更准确地鉴定亲缘关系密切的物种（Salgueiro et al., 2000; Tzakou and Constantinidis, 2005; Silva et al., 2017; Gy?rgy et al., 2020; Etri and Pluhár, 2024）。

唇形科以其化学多样性为特征，不同物种间的精油成分差异显著（Thompson et al., 2007; Matesanz and Valladares, 2014; Aedo et al., 2017）。在该科中，百里香属（Thymus L.）是多样性最高且化学变化最丰富的属之一，是地中海灌木丛植被的重要组成部分（Morales, 1986, 1997; Melendo et al., 2003）。即使在同一物种内部，其精油组成也存在很大差异。例如，野生百里香（T. vulgaris）表现出七种不同的化学类型，每种类型由其主要单萜类成分定义（Keefover-Ring et al., 2009）。Kryvtsova等人（2022）的研究表明，不同微生境条件下的百里香属物种精油组成也会发生变化。Wester等人（2020）在一片石灰岩草原上发现了多达七种不同的百里香属T. pulegioides化学类型，进一步突显了该属的化学复杂性。

伊比利亚半岛是百里香属多样化的中心，为研究该属的化学多样性提供了理想的环境。百里香属包含约250个物种，分布在地中海和欧亚大陆的八个组中（Jalas, 1971; Morales, 1986, Morales, 2002）。Mastichina组（Mill.）是伊比利亚半岛特有的，传统上包括两个雌雄异株物种：濒危的T. albicans Hoffmanns. & Link，主要分布于伊比利亚西南部；以及广泛分布的T. mastichina L.（Moreno, 2008; Morales, 2010; Buira et al., 2017）。后者进一步分为两个亚种：四倍体的T. mastichina subsp. mastichina L.和二倍体的T. mastichina subsp. donyanae R. Morales，前者分布于西班牙韦尔瓦（Huelva）和葡萄牙阿尔加维（Algarve）的沙质土壤中（Girón et al., 2012）。最近的系统基因组分析揭示了两个主要的进化谱系，这些谱系与当前的分类学分类并不完全一致。其中一个谱系主要对应于四倍体的T. mastichina subsp. mastichina，另一个谱系则包括传统上归类为T. mastichina subsp. donyanae和T. albicans的种群，以及一些被鉴定为T. mastichina subsp. mastichina的种群（Nieto-Lugilde et al., 2025; García-Cárdenas et al., 2026）。对二倍体谱系的进一步研究表明，存在多个地理上不同的遗传群，其中许多群之间存在基因渗入现象（García-Cárdenas et al., 2026）。

在百里香属中，化学类型往往无法与分类学或遗传学边界完全对应，因为精油组成在种内水平上高度变异，并受到环境因素的强烈影响。例如，法国南部百里香（T. vulgaris）的精油组成受气候和土壤条件的影响（Gouyon et al., 1986; Salgueiro et al., 1997; Thompson et al., 1998, 2003, 2007; Delgado et al., 2014）。在Mastichina组内，不同物种间的精油成分存在差异，主要体现在1,8-桉叶油醇和芳樟醇的含量上（Salgueiro et al., 1997; Miguel et al., 2004; Figueiredo et al., 2008），但大部分化学变异发生在种内水平。例如，靠近大西洋海岸的种群通常含有较高水平的芳樟醇，这一现象在相关的伊比利亚物种中也有报道（如T. carnosus和T. villosus）（Salgueiro et al., 1995, 1997, 2000）。这些模式表明，局部环境条件在塑造精油组成和萜类化合物比例中起着重要作用。Mastichina组内精油组成的这种空间和种内变异表明，局部环境因素可能在化学谱型的形成中起关键作用。同时，这些模式也引发了关于某些差异是否反映了种群间遗传分化的疑问（Bataillon et al., 2022）。在本研究中，我们整合了遗传、化学和生态数据以更精确地描述百里香属Mastichina组的特征。由于多倍体在形态、化学和生理特征上通常与二倍体不同，表现出更高的多变量生态位分化率（Otto and Whitton, 2000; Hull-Sanders et al., 2009; Baniaga et al., 2020），我们预计四倍体的T. mastichina占据更广泛的生态位，并表现出更大的精油变异。我们还假设不同的遗传群可能占据不同的生态位并具有不同的化学谱型。最后，我们评估观察到的化学谱型和生态位主要是由遗传差异还是环境条件塑造的。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料
样本来自伊比利亚半岛的39个种群，涵盖了百里香属Mastichina组的分布范围，特别关注拥有最高二倍体遗传群浓度的伊比利亚西南部（图1；表S1）。采样时间在2023年5月至6月之间，正值该物种的开花期。每个种群随机采集6株雌雄同株和6株雌株个体，选择相似的物候阶段以减少季节性变异，并保持至少5米的距离以避免采集近亲或重复采样同一基因型。从每株植物中采集4-5片未受食草动物损害的幼茎中部叶片。将所有叶片混合后用1毫升纯乙醇保存以提取精油。样本在5°C下保存，直至进行色谱分析。

**2.2. 化学分析**
从乙醇提取的叶片样本中分析精油。每个种群准备两份混合提取物：一份来自雌雄同株个体，另一份来自雌株个体。每份混合提取物包含来自5株同性个体的4微升提取物（总计20微升），用980微升纯甲醇稀释至最终体积1毫升，用于色谱分析。此外，还单独分析了每个种群的1株雌雄同株个体和1株雌株个体。因此，每个种群和性别的样本分别获得了基于5个个体的色谱谱型和一份混合谱型。

色谱分析采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术进行。分析设备为TSQ8000 Evo Triple Quadrupole GC-MS/MS色谱仪，配备ZB-5ms毛细管柱（30米×0.25毫米×0.25微米，Phenomenex），喷射器采用分流模式（1:25）。注射体积为1微升，喷射器温度设定为250°C。采用通用采集方法，质谱转移线温度为280°C，离子源温度为250°C。离子化方式为电子撞击（EI）模式，极性为正极性。温度程序包括三个阶段：初始温度设为50°C，以每分钟5°C的速率升高至110°C（第一阶段）；第二阶段以每分钟10°C的速率升高至180°C；第三阶段以每分钟20°C的速率升高至280°C，并保持6分钟。色谱数据使用Thermo Scientific? Xcalibur? v.4.3.73.11软件进行分析。

化合物的鉴定主要基于质谱匹配，包括分子离子（m/z）值和碎片模式，与国家标准与技术研究院（NIST）提供的质谱库进行比对（使用Thermo Scientific? TraceFinder? v.5.1软件）。通过比较色谱参数（保留时间和洗脱顺序）与百里香属Mastichina组精油的文献报道（如Salgueiro et al., 1997; Faleiro et al., 2003; Figueiredo et al., 2008; Filipe et al., 2017）来进一步验证鉴定结果。对于主要化合物（1,8-桉叶油醇、芳樟醇、乙酸芳樟醇、樟脑、莰和莰烯），光谱匹配指数（SI）和反向光谱匹配指数（RSI）通常很高（>900），支持其鉴定准确性。对于樟脑、莰和莰烯，虽然峰强度较低，但当峰形清晰时，SI和RSI值仍超过900，验证了其鉴定结果。次要化合物的峰强度较低，但当峰形足够清晰时，SI/RSI值通常超过800，偶尔也能达到主要成分的>900阈值；而强度不足的峰则无法进行分析。来自同一前体的化合物（如α-蒎烯和β-蒎烯）因保留时间差异较大而分别进行分析。这种方法确保统计分析反映的是特定化合物之间的差异，而不是由于合并具有不同色谱行为的衍生物而掩盖差异。

通过Thermo Scientific? Xcalibur?软件从总离子色谱图（TIC）峰面积估算出化合物的相对丰度，并以归一化百分比表示。由于分析侧重于种群间的相对比较，因此未量化绝对精油产量。未应用校正因子或外部校准，假设所有化合物的检测器响应因子相同。因此，报告的百分比（每种化合物相对于样本总定量面积的比例）应视为半定量估计值，需谨慎解读，因为离子化效率的差异可能影响峰面积。这些数据仅用于比较不同样本、种群和属之间的差异。一些峰被排除，因为它们对应于被认为是其他化合物降解产物的碳氢化合物链。

芳香化合物分为两类功能类别：单萜类烃和氧化单萜类，并分别进行分析。对混合样本的化学分析揭示了不同的化学类型：虽然大多数种群表现出以1,8-桉叶油醇为主的化学特征，但有13个雌雄同体和/或雌性种群中的丁子香酚含量相对较高，超出了该化学类型的典型水平（即丁子香酚浓度>10%；见结果部分）。为了评估在混合样本中观察到的丁子香酚含量升高是由于单个个体积累异常高，还是由于混合样本中的多个个体都有中等程度的积累，我们进行了额外的气相色谱-质谱（GC–MS）分析，在可能的情况下分别分析了每个混合样本中的五个个体。

2.3. 环境数据
我们从每个种群中记录了纬度和经度坐标，然后使用这些坐标从Chelsa气候数据库v.2.1（Brun等人，2022年）中提取了扩展的生物气候变量（Bioclim+）。具体来说，我们获得了61个生物气候变量的数据。此外，我们还从每个种群中收集了三个土壤样本，每个样本采集了约1公斤深度为10-15厘米的土壤。对于每个土壤样本，我们按照Papuga等人（2018年）的方法进行了标准土壤相关变量的测量，并进行了修改。首先，将土壤在40°C下干燥48小时，然后存放在冷藏室中待分析。将10克干燥土壤与20毫升蒸馏水混合后，使用离心机分离各相（10分钟），并在室温（约20°C）下测量上清液中的数值。然后记录pH值和电导率（c），单位为毫西门子每厘米（mS/cm）。水分保持潜力（WRP）是通过在40°C下干燥湿润土壤48小时后失去的水分百分比来计算的。水分保持能力（WRC）则是通过在110°C下干燥样品5小时后，该土壤中剩余的水分百分比来计算的。最后，有机质（OM）是通过在500°C下燃烧干燥样品后失去的物质的百分比来估计的。

2.4. 统计分析
对于本研究中考虑的每种精油，我们使用了多元方差分析（MANOVA），并在适当的情况下进行了Tukey的事后检验，以评估倍性水平（二倍体与四倍体）之间以及Thymus sect. Mastichina内确定的五个遗传组之间的差异：“四倍体”组和“Algarve”、“Cadiz”、“Do?ana”和“Hercinian”二倍体组（García-Cárdenas等人，2026年）。此外，为了探索不同种群之间相对精油丰度的变化模式，我们使用了R语言中的函数进行了主成分分析（PCA）。保留了前两个主成分以进行解释和可视化。PCA结果使用factoextra包v.1.0.7（Kassambara和Mundt，2020年）在R中进行了可视化。
我们使用Spearman相关性（土壤和生物气候变量不满足正态性假设）和Bonferroni校正（Rice，1989年）来评估化合物特异性变化的潜在生态驱动因素，以评估芳香化合物特征与关键环境变量之间的关联。具体来说，我们包括了本研究中考虑的所有土壤相关变量（即pH值、电导率、WRP和OM）以及八个气候变量：bio1（年平均温度）、bio5（最热月份的最高温度）、bio10（最热季度的平均温度）、bio12（最干燥月份的降水量）、bio14（最干燥季度的降水量）、bio17（最干燥季度的降水量）、平均相对湿度（MRH）和干旱指数（AI）。这些变量的选择基于它们对Thymus sect. Mastichina成分化学组成的影响的先前证据（Salgueiro等人，1995年，1997年；Thompson等人，2013年；Llorens-Molina和Vacas，2017年）。相关性在种群和个体水平上进行了评估。种群水平的分析使用了混合数据，而个体水平的分析包括了单独分析的个体和组成混合样本的个体。当未检测到混合样本内的变异时，假设混合样本中的所有五个个体的生化组成是均匀的；否则，考虑了每个个体中每种化合物的相对丰度。

3. 结果
3.1. 精油组成和种群内变异性
在分析每个种群的所有混合样本时，我们在Thymus sect. Mastichina的叶片中识别出了14种化学化合物，大多数化合物的相对丰度与先前的研究报道的结果相当（例如，Salgueiro等人，1997年；Miguel等人，2004年；Figueiredo等人，2008年；Delgado等人，2014年；Filipe等人，2017年；Rodrigues等人，2020年）（图2A；表1）。根据它们的化学性质，这些化合物被分为两类功能组：单萜烃（化合物1-6）和氧化单萜（化合物7-14）。单萜烃的相对比例始终远低于氧化单萜，仅占总组成的10.60% ± 3.46（平均值 ± 标准差）。相反，氧化单萜在所有个体中占主导地位，平均占总组成的89.40% ± 3.46%（表1）。

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图2. (A) 来自雌雄同体个体混合样本的叶提取物色谱图示例，对应于富含1,8-桉叶油醇的化学类型。峰面积代表其相对丰度。保留时间（分钟）显示在x轴上。只有14个已识别的峰被编号（详细信息见表1）。雷达图显示了1,8-桉叶油醇丰富（B）和丁子香酚丰富（C）化学类型的14种已识别化合物的平均相对丰度（0-100刻度）。每个轴对应一种化合物。
表1. 在Thymus sect. Mastichina中鉴定出的精油。化合物通过将其特征质量碎片（m/z）与国家标准与技术研究院（NIST）的质量光谱库进行比较来鉴定，并根据它们的洗脱顺序和保留时间（分钟）进一步确认，同时参考了之前在Thymus sect. Mastichina中报道的精油文献数据。还提供了根据化学性质和相对丰度（平均百分比 ± 标准差）的分类。括号中的值表示从种群平均值计算出的范围（最小值–最大值）。化合物按洗脱顺序列出。用星号（?）标记的化合物具有高置信度鉴定（光谱匹配指数SI和反向光谱匹配指数RSI >900），而其余次要成分则基于质量光谱相似性和已发表的数据进行分配。

化合物 | 保留时间（分钟） | m/z | 化学性质 | 相对丰度（%）
--- | --- | --- | --- | ---
15.37 | 136 | α-蒎烯 | 单萜烃 | 2.577 ± 0.956 (1.175 – 4.873) |
25.75 | 136 | 茴烯 | ? | 单萜烃 | 2.048 ± 2.518 (0 – 9.883) |
36.28 | 136 | 桉叶油醇 | 单萜烃 | 1.732 ± 0.703 (0.323 – 2.858) |
46.41 | 136 | β-蒎烯 | 单萜烃 | 2.542 ± 0.778 (1.315 – 3.732) |
56.67 | 136 | β-蒎烯 | 单萜烃 | 0.733 ± 0.436 (0 – 1.864) |
67.71 | 136 | 柠檬烯 | 单萜烃 | 0.969 ± 0.519 (0.397 – 2.691) |
77.79 | 154 | 1,8-桉叶油醇 | ? | 氧化单萜 | 71.13 ± 13.890 (35.594 – 89.487) |
88.81 | 154 | 桉叶油醇水合物 | 氧化单萜 | 1.150 ± 0.543 (0.651 – 3.505) |
99.61 | 154 | 丁子香酚 | ? | 氧化单萜 | 5.543 ± 10.40 (0 – 42.845) |
10 | 10.94 | 152 | 薄荷醇 | ? | 氧化单萜 | 2.819 ± 5.181 (0 – 20.287) |
11 | 11.59 | 154 | δ-萜品醇 | 氧化单萜 | 0.884 ± 0.333 (0 – 1.549) |
12 | 11.64 | 154 | 松油醇 | ? | 氧化单萜 | 3.868 ± 4.359 (0 – 13.261) |
13 | 12.29 | α-萜品醇 | 氧化单萜 | 3.456 ± 1.386 (1.086 – 5.849) |
14 | 13.62 | 196 | 丁子香酚醋酸酯 | ? | 氧化单萜 | 0.543 ± 3.092 (0 – 18.504) |
单萜烃 | 89.40% ± 3.458 (77.67% – 95.90%) |
氧化单萜 | 10.60% ± 3.458 (4.096% – 22.33%) |

最常见的化学类型以高比例的1,8-桉叶油醇（也称为桉叶油；化合物7）为特征，平均值为71.13% ± 13.09%（图2B；表1）。当1,8-桉叶油醇达到或超过这个平均水平时，其他化合物各自占到的总组成比例很少超过5%。虽然丁子香酚（化合物9）的平均相对比例为5.54% ± 10.40%（表1），但在七个种群（A01、A04、A09、A11、D02、M09和M13）中，它占总芳香成分的10%以上（表S2）。在其中两个种群A01和M09中，这两个都是位于伊比利亚半岛南部的二倍体种群，丁子香酚的平均相对比例达到了1,8-桉叶油醇的水平（分别为42.85%和29.46% vs 41.59%和35.55%）。此外，A01种群中的雌雄同体混合样本表现出以丁子香酚为主的化学类型（72.00%），而不是1,8-桉叶油醇（19.05%）（图2C；表S2）。丁子香酚醋酸酯（化合物14）通常是一个次要成分（0.54% ± 3.09；表1），但在M09种群中它占总组成的18.50%（表S2）。其他氧化单萜，如薄荷醇和松油醇（化合物10和12）也表现出显著的种群间差异。尽管它们的总体平均相对比例分别为2.82% ± 5.18%和3.87% ± 4.36%（表1），但来自伊比利亚半岛西南部的六个种群（A08、D05、D07、D08和M11，属于“Do?ana”二倍体组，以及来自“Algarve”遗传群的D04）一致显示出一种或两种化合物的比例超过10%（表S2）。最后，薄荷烯（化合物2），一种次要的单萜烃（2.05% ± 2.52；表1），在“Do?ana”组的三个种群中占总芳香成分的约10%（D05、D07和D08；表S2）。基于相对化合物丰度的PCA进一步说明了种群间的化学差异模式（图S1）。前两个主成分分别解释了总方差的37.59%和20.36%。PC1清楚地将六个主要属于“Do?ana”二倍体组的种群（除了来自“Algarve”群的D04）与其他种群区分开来，突出了它们化学特征的差异。此外，以相对较高丁子香酚水平为特征的种群（A09、M09和A01）也位于PC1的正值区域。PC2解释了额外的变异，但显示出较少的群体结构化，尽管它倾向于将大多数四倍体种群聚集在负值区域。
对13个表现出富集丁子香酚化学类型的混合样本的进一步定性分析显示，种群内的个体之间存在相当大的变异性。在一些种群中，只有一个个体产生了高浓度的丁子香酚，而在其他种群中，多达四个个体积累了大量的这种化合物（表S3）。此外，在某些混合样本中，我们观察到个体表现出不同的化学类型：一些以1,8-桉叶油醇为主，一些以丁子香酚为主，还有一些两种化合物的组成更为平衡。在某些情况下，同一个混合样本中同时存在两种或三种不同的化学类型（表S3）。

3.2. 不同倍性和遗传组之间的精油组成差异
为了分析二倍体和四倍体个体之间的化学组成差异，我们首先使用了所有14种个体化合物的相对比例。这种初步方法揭示了倍性水平之间精油相对丰度的显著差异（MANOVA：Wilks' λ = 0.362；df = 1；P < 0.001）。在14种芳香化合物中有7种观察到了显著差异。二倍体个体的α-蒎烯、薄荷烯、桉叶油醇水合物和薄荷醇的相对丰度较高，而四倍体个体的丁子香酚醋酸酯和柠檬烯的水平较高。相比之下，丁子香酚在倍性水平之间没有显著差异，而1,8-桉叶油醇显示出显著趋势（P = 0.076），四倍体中的值略高（图3A）。当根据化学性质对精油进行分组时，也发现了倍性水平之间的显著差异（MANOVA：Wilks’ λ = 0.902；df = 1；P = 0.021）：单萜烃在二倍体中更为丰富，而氧化单萜在四倍体中的相对比例较高（图S2A）。

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图3. 水平条形图显示了14种已识别精油的相对丰度（平均值 ± 标准差），按平均丰度降序排列。括号中的数字表示图2A中显示的化合物标签。比较了（A）二倍体（橙色）和四倍体（蓝色）个体，以及（B）García-Cárdenas等人（2026年）描述的五个遗传组：“四倍体”（蓝色）、“Hercynian”（橙色）、“Algarve”（绿色）、“Do?ana”（黄色）和“Cadiz”（粉色）。? <0.05，*** <0.01，**** <0.001。（B）中的不同字母表示0.05水平上的显著差异。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）
我们还根据所有14种个体芳香化合物的比例发现了遗传组之间的化学组成差异（MANOVA：Wilks' λ = 0.121；df = 4；P < 0.001）。其中九个遗传组在遗传簇之间表现出显著变化。“Do?ana”种群表现出明显的蒎烯衍生物（α-和β-蒎烯）、薄荷烯和薄荷醇的相对丰度较高，尤其是薄荷醇达到了特别高的水平。相比之下，四倍体种群的特征是柠檬烯的值较高，而萜品醇衍生物（α-和δ-萜品醇）的相对比例在“Hercynian”和“Tetraploid”组中最高。松油醇在西南部种群中的比例相对较高，特别是在“Algarve”、“Cadiz”和“Do?ana”组中。此外，sabinene、β-蒎烯和α-萜品醇在“Algarve”种群中的比例较低，但在“Cadiz”和“Hercynian”组中相对较高。尽管存在这些化合物特定的差异，但在所有遗传簇中没有观察到明确或一致的化合物分布模式（图3B）。最后，当根据化学性质对化合物进行分组时，没有检测到遗传簇之间的显著差异（MANOVA：Wilks' λ = 0.830；df = 4；P = 0.089）（图S2B）。

3.3. 评估气候和土壤因素对化学特征的影响
芳香化合物与环境变量之间的相关性在种群水平上揭示了一些统计上显著的关联（图4A）。首先，bio1（年平均温度）与薄荷醇、松油醇、薄荷烯和α-蒎烯的相对丰度呈正相关（rS范围从0.359到0.522，P < 0.021；表S4），但与1,8-桉叶油醇呈负相关（rS = ?0.40，P < 0.001）。其次，对于bio14（最干燥月份的降水量）和bio17（最干燥季度的降水量）发现了最相关的结果。具体来说，我们观察到这些降水变量与莰烯、樟脑和莰酚的比例之间存在显著的负相关（rS范围从-0.37到-0.60，P < 0.010；表S4）。芳樟醇与MRH也存在显著的负相关（rS = -0.52，P < 0.001；图4A）。总体而言，这些模式表明这些化合物倾向于在较干燥的条件下积累。相比之下，1,8-桉叶油醇与bio14呈正相关（rS = 0.45，P < 0.001），这表明在降水量较高的地区，这些化合物的含量更高。在土壤变量中，虽然出现了一些一致的模式，但WRP（水分保持潜力）与莰烯和莰酚呈负相关（rS分别为-0.45和-0.44，P = 0.010），而芳樟醇与有机质（OM）呈正相关（rS = 0.41，P = 0.031；表S4）。下载：下载高分辨率图片（388KB）下载：下载全尺寸图片。图4. 显示了在种群（A）和个体（B）水平上选定的芳香化合物与环境变量之间显著相关性的相关图。数值表示经过Bonferroni校正后的Spearman's r值。颜色代表相关性的强度和方向，从-1（蓝色）到+1（红色）逐渐变化。分析包括了所有与土壤相关的变量（pH值、电导率、WRP、WRC和OM）以及八个气候变量：bio1（年平均温度）、bio5（最热月份的最高温度）、bio10（最热季度的平均温度）、bio12（年降水量）、bio14（最干燥月份的降水量）、bio17（最干燥季度的降水量）、MRH（平均相对湿度）和AI（干旱指数）。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）在个体水平上，这些总体模式基本保持不变。樟脑、莰烯和α-蒎烯的相对丰度与温度（bio1）呈正相关，但与降水变量（bio12 – 年降水量、bio14和bio17）呈负相关。相比之下，1,8-桉叶油醇显示出相反的趋势，而芳樟醇与bio14和bio17呈负相关。樟脑、莰烯和莰酚与几乎所有土壤变量（电导率、OM、WRP - 水分保持潜力以及WRC - 水分保持能力）呈负相关，而芳樟醇与OM、WRP和WRC呈正相关（图4B；表S5）。4. 讨论在这项研究中，我们提供了Thymus sect. Mastichina中精油成分的综合性概述，描述了化学变异的模式及其潜在的驱动因素。首先，我们在种群内部和种群之间都检测到了化学多样性：尽管许多种群以1,8-桉叶油醇为主，但其他种群则以芳樟醇为主，在某些情况下，同一种群中同时存在多种化学类型。其次，种群之间存在显著差异，二倍体和四倍体个体之间以及基因定义的群体之间存在显著差异，这表明倍性和遗传背景可能对精油成分有影响。虽然主要成分——1,8-桉叶油醇和芳樟醇在种群间相对一致，但其他化合物的相对丰度发生了明显变化。第三，环境因素也与精油成分的变化有关，表明当地的气候和土壤条件可能会影响精油成分。这些发现共同表明，在决定Thymus sect. Mastichina的化学类型多样性方面，遗传、倍性和环境因素之间存在复杂的相互作用，为理解这一组植物中精油变化的生态和进化驱动因素提供了框架。Thymus sect. Mastichina中的精油成分在其地理分布范围内既表现出保守性也表现出差异性。尽管MANOVA结果显示种群间的化学成分存在显著差异，但主要成分（1,8-桉叶油醇和芳樟醇）在所有种群中都一致存在，并且其丰度不受倍性水平或遗传群体的影响。这种成分存在的一致性并不排除它们在种群间甚至同一植株内的相对丰度变化。虽然大多数种群由具有单一化学类型的个体组成，但有些种群包含两种或更多化学类型，这突显了种内和种间的高化学变异性，这与其他Thymus物种中报道的化学类型异质性分布一致（例如，Adzet等人，1977年；Thompson等人，2003年；Keefover-Ring等人，2009年）。此外，在伊比利亚半岛西南部的七个种群中，芳樟醇的相对丰度显著增加，同时其他成分如莰烯和樟脑的贡献也增加。然而，一个显著的例外是‘Do?ana’遗传群体，其中莰烯的水平始终较高，如先前的研究所述（例如，Salgueiro等人，1997年；Figueiredo等人，2008年）。这表明该谱系具有相对一致的化学类型特征，可能反映了系统发育独特性和生态因素的结合（Baser和Buchbauer，2009年；Etri和Pluhár，2024年；Ouarghidi等人，2025年）。单个单萜类化合物的合成不太可能独立发生。在T. vulgaris中，Thompson等人（2003年）表明一种化合物的产生可能会影响其他化合物的水平，反映了相互依赖的代谢网络。这种权衡可能导致1,8-桉叶油醇和芳樟醇之间的负相关（Kampranis等人，2007年）。这些竞争分支中的相对流量可以通过特定单萜类合成酶的活性来调节（Bataillon等人，2022年），而这又可能受到等位基因变异、基因表达或转录调控的影响（Thompson等人，2003年；Rabiei等人，2018年；Bao等人，2023年）。特别是，在T. vulgaris中观察到的少数萜类合成酶位点与主要化学类型差异之间的强烈关联（Bataillon等人，2022年）表明，有限的遗传结构可以解释多样的化学表型。这种酶和遗传调控可能是Thymus sect. Mastichina中观察到的种内化学变异性的基础，包括同一种群中多种化学类型的共存（Benabdelkader等人，2015年）。环境条件以及遗传因素已被证明可以调节Thymus物种中的单萜类生物合成（Salgueiro等人，1995年，1997年；Miguel等人，2004年；Amiot等人，2005年；Thompson等人，2007年）。在T. vulgaris中，化学类型表现出明确的空间分布，这可能是由局部生态压力（如食草动物、干旱和极端温度）维持的（Thompson等人，1998年，2003年，2007年）。同样，沿大西洋海岸的T. carnosus、T. mastichina和T. albicans种群由于暴露于海洋湿度，倾向于积累更高水平的芳樟醇或莰烯（Salgueiro等人，1995年，1997年）。在我们的研究中，芳香成分与气候变量之间的相关性表明，在较干燥地区的种群中，莰烯、莰醇和樟脑等化合物的相对含量较高，这与在水资源受限条件下次生代谢物分配的变化一致（Ramezani等人，2020年），而1,8-桉叶油醇在较湿润的环境中相对更丰富。虽然Salvia中的研究表明，在干旱胁迫下，负责1,8-桉叶油醇生物合成的酶cineole合成酶会被下调（Radwan等人，2017年），但其他报告则显示，在伊比利亚东部T. vulgaris种群中，1,8-桉叶油醇的浓度在干旱期间会增加（Llorens-Molina和Vacas，2017年），表明这种化合物对水分胁迫的反应可能因物种或环境而异。本研究观察到的模式表明，精油成分的变化可能不是随机的，可能与对当地环境条件的适应性反应有关，这种反应通过代谢调控和生态压力介导。个别化合物的功能作用支持这一假设。1,8-桉叶油醇主要具有抗菌、抗真菌、抗氧化或杀虫活性，而芳樟醇则具有更广泛的作用，通过花香吸引传粉者，同时还具有抗真菌和驱虫功能（Dorman等人，2000年；Faleiro等人，2003年；Pina-Vaz等人，2004年；Figueiredo等人，2008年；Azerad，2014年；Bajalan等人，2017年；Rodrigues等人，2020年；Cai等人，2021年）。莰烯和α-蒎烯因其抗菌特性而特别受到重视，而樟脑在氧化应激保护、抗病原体特性和驱虫方面发挥作用（Bajalan等人，2017年），可能有助于提高植物在自然系统中的生态表现。总体而言，我们的结果表明，Thymus sect. Mastichina中观察到的化学多样性可能是环境压力和内在代谢途径相互作用的结果，可能反映了在多变气候条件下优化生态相互作用和种群适应性的策略。尽管如此，不能排除表型可塑性在产生这种化学多样性方面的潜在作用，未来应对其进行明确测试。5. 结论我们的结果提供了Thymus sect. Mastichina中化学类型多样性和可能与生态分化相关的模式的全面视图，尽管它们对物种划分的价值仍然有限。尽管二倍体和四倍体个体之间的差异适中，但四倍体不断渗入二倍体种群（García-Cárdenas等人，2026年）可能会进一步模糊这些界限，加强了跨分类单元观察到的化学连续性。此外，主要单萜类化合物的广泛生态功能表明，本研究中记录的变异可能并非随意；相反，它可能与适应性反应一致，这些反应可能影响植物在对比环境条件下的表现和生态相互作用。种群内多种化学类型的共存，以及跨分类单元的化学特征重叠，突显了该组的进化复杂性，并强调了结合化学、遗传和生态证据以实现稳健的分类学解决方案的必要性。CRediT作者贡献声明José C. del Valle：写作 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、资源、调查、正式分析、数据管理。Esther María Martín-Carretié：资源、正式分析、数据管理。Francisco José García-Cárdenas：写作 - 审稿与编辑。David Doblas：写作 - 审稿与编辑、资源。María ángeles Ortiz：写作 - 审稿与编辑、资源、调查。John Thompson：写作 - 审稿与编辑、资源、概念化。Perrine Gauthier：写作 - 审稿与编辑、资源。Bodil K. Ehlers：写作 - 审稿与编辑、方法学。Diego Nieto-Lugilde：写作 - 审稿与编辑、资源、调查、资金获取、概念化。Regina Berjano：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原稿、资源、资金获取、正式分析、概念化。