一种新型嗜盐古菌Haloarcula argentinensis IARI-SOAB1将乙酸转化为高滴度聚羟基丁酸的过程

《Bioresource Technology Reports》：Valorization of acetate into high-titer polyhydroxybutyrate by a novel halophilic archaeon, Haloarcula argentinensis IARI-SOAB1

高效产PHB卤虫弧菌的筛选与培养优化及其生物降解特性验证

　　

戈文德·辛格·托马尔（Govind Singh Tomar）| 乌迪塔·普什帕德（Udita Pushpad）| 米娜·拉托尔（Meena Rathore）| 拉吉夫·考希克（Rajeev Kaushik）

印度新德里ICAR-印度农业研究所微生物学系

摘要

由石油基塑料引发的全球环境危机迫切需要可持续的替代品。聚羟基丁酸酯（PHB）是一种有前景的可生物降解聚合物；然而，其商业可行性受到高生产成本的限制。本研究探讨了来自库奇盐沼（Rann of Kutch）的高盐环境中的盐古菌（haloarchaea）在创建成本效益高的PHB生产平台方面的潜力。通过对28个分离株的筛选，发现Haloarcula argentinensis IARI-SOAB1是最佳的生产菌株。值得注意的是，该菌株更偏好乙酸钠而非传统糖类，这对于利用工业废物流非常有用。工艺优化表明，在氮限制条件下，碳氮比（C:N）为25:1时效果最佳。批次发酵产生的最终PHB浓度高达19.49 gL^?1，占细胞干重的57.9%。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和质子核磁共振（¹H NMR）分析证实提取的生物聚合物为纯PHB均聚物。这些结果证明了H. argentinensis IARI-SOAB1是用于可持续且经济可行的生物塑料生产的高效菌株。

引言

石油基塑料的广泛使用导致了全球环境危机。全球塑料产量迅速增加，从2000年的约2.34亿吨增加到2019年的近4.6亿吨，预计到2060年可能增加三倍（Ritchie和Roser，2018；OECD，2022；Baztan等人，2024）。到2020年，塑料总产量已超过100亿吨，凸显了塑料材料在环境中的大量存在。这种扩张提供了证据，表明塑料和微塑料对人类健康、生态系统和气候产生了有害影响，包括内分泌干扰、氧化应激、生物多样性丧失以及温室气体排放增加（Muncke等人，2023；Trasande等人，2024）。这些环境和经济挑战促使全球努力开发遵循循环生物经济原则的可持续替代品。生物塑料，特别是微生物生物聚合物，为塑料废物提供了一个有前景的可再生和可生物降解的解决方案（Akaraonye等人，2012）。其中，聚羟基烷酸酯（PHAs）作为传统聚合物的替代品脱颖而出，因其能在多种环境中完全生物降解、具有生物相容性，并且来源于可再生资源（Luengo等人，2003；Thompson等人，2009；Shrivastava等人，2021）。PHAs是由微生物产生的天然聚酯，作为应对营养不平衡的细胞内碳和能量储备（Khan等人，2021）。

聚（3-羟基丁酸酯）（PHB）是最受研究的聚羟基烷酸酯（PHA）之一，其热塑性特性类似于聚丙烯，包括高结晶度、抗紫外线性和低水及气体渗透性。这些特性使PHB适用于包装、农业以及组织工程和药物递送等高价值生物医学领域（Rehm，2010；Shaikh等人，2021）。商业上关注的是聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯）（PHBV），这是一种共聚物，具有更好的材料性能，包括更高的柔韧性、吸收能力、生物相容性和低细胞毒性以及有利的热塑性行为。这些特性使PHBV成为生物医学植入物、组织工程支架、一次性产品和高强度物品的有前景的生物材料（Wang等人，2013；Ngaopok等人，2025）。尽管具有潜力，但由于碳基底的成本以及大规模发酵过程中保持无菌状态所需的能源，PHB的商业化仍受到高生产成本的限制（Lee等人，2021）。降低成本的策略包括使用盐古菌（Borrel等人，2020；Longo等人，2024）。这些极端微生物在高盐环境中茁壮成长，使得工业生物加工更具成本效益（Koller，2019）。高盐浓度（15–30% NaCl）可以防止常见微生物的污染，从而消除了对生物反应器和原料进行昂贵灭菌的需要。此外，从盐古菌中回收聚合物非常简单；它们的细胞在低盐水中破裂，释放出PHB颗粒，无需使用苛刻的化学物质或机械破坏（Kourmentza等人，2017；Simó-Cabrera等人，2021）。

嗜盐古菌表现出显著的代谢多样性，能够利用多种碳源进行生长和能量代谢（Oren，2013）。虽然许多物种通过改良的半磷酸化Entner-Doudoroff（spED）途径分解氨基酸或复杂碳水化合物（如葡萄糖）（Johnsen等人，2020），但它们代谢其他底物（包括甘油（Litchfield等人，2009）、蔗糖和有机酸）的能力因物种而异（Sivakumar和Rajan，2013）。这种代谢灵活性对于工业应用至关重要，例如PHB生产，这些应用依赖于廉价且容易获得的碳源以保持经济可行性。然而，尽管有这些优势，关于盐古菌在工业中的应用仍存在大量知识空白。大多数研究集中在少数模式生物上，如Haloferax mediterranei，而许多盐古菌的多样性尚未被探索（Koller等人，2007）。包括库奇盐沼在内的极端高盐环境是尚未充分探索的新菌株来源，这些菌株可能具有更强的PHB生产能力或更高的工业适应性（Koller，2019；Hagagy等人，2022）。此外，对于这些新分离菌株进行最佳聚羟基丁酸酯（PHB）生产的具体营养需求了解不足。例如，简单的有机酸如乙酸钠是理想的底物，因为它们是经济高效的工业副产品，并且可以直接前体化为乙酰辅酶A（PHB的基本构建块）。然而，不同盐古菌对乙酸的利用效率各不相同，有些菌株（如Haloarcula sp. IRU1）在乙酸上的生长和聚合物积累有限（Taran，2011）。

为了克服底物限制并降低生产成本，人们投入了大量努力，将工业和农业废弃物作为盐古菌合成聚羟基烷酸酯（PHA）的替代碳源。值得注意的是，Haloferax mediterranei能够高效地将各种低成本底物（如乳清渗透液、橄榄榨汁厂废水、酒糟、粗甘油和食品加工残渣）转化为高产量的聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯）（PHBV），显著降低了总体生产成本（Bhattacharyya等人，2012；Hermann-Krauss等人，2013；Pais等人，2016；Alsafadi和Al-Mashaqbeh，2017）。这些研究强调了通过实证筛选新的盐古菌分离株以确定优选营养物质和培养策略的重要性，从而提高聚合物产量并促进经济可行的生物工艺开发。本研究旨在通过发现来自古吉拉特邦库奇盐沼这一相对未探索的高盐环境中的新盐古菌菌株来解决这些相互关联的难题。库奇盐沼是一个独特的生态系统，其特征是极端盐分和沼泽地区，当地微生物群已经进化以适应这些恶劣的环境条件（Yadav等人，2019）。此外，本研究还旨在确定最有效的碳源，以促进最佳菌株的生长，并优化碳氮比（C:N），利用选定的碳源来提高聚合物积累。虽然氮限制和C:N比被广泛认为是PHA生物合成的关键调节因素，但磷的可用性也显著影响细胞内碳向聚合物储存的转移。已知磷的限制会通过限制核酸和磷脂的生物合成来强烈刺激PHA的合成，从而将多余的碳重新导向细胞内聚合物积累（Rehm，2010；Wen等人，2010）。在本研究中，磷被维持在非限制水平以确保稳定的生物量形成，而氮限制被选为主要优化参数，以系统评估其对PHB积累的影响。最后，使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）分析了所生产PHB的物理化学性质，以确认其化学身份和质量。

部分摘录

筛选用于生产聚羟基丁酸酯（PHB）的嗜盐古菌

我们实验室之前的研究（Yadav等人，2019）中收集的28种嗜盐古菌被筛选用于生产聚羟基丁酸酯（PHB）。这些菌株最初是从印度古吉拉特邦库奇盐沼的高盐土壤中分离出来的，该盐沼是位于印度西北部的一个广阔的高盐盐沼生态系统。采样区域的地理范围介于北纬23°30′–24°45′和东经68°30′–70°15′之间。

筛选和鉴定高产PHB的盐古菌

通过对28种盐古菌分离株进行初步筛选，使用Sudan black B染色法鉴定潜在的PHB生产菌株，结果显示15种菌株含有细胞内的脂质颗粒，表现为细胞内的深色色素。这些阳性菌株属于多个属，包括Haladaptatus、Haloarcula、Halobacterium、Haloferax、Halogeometricum、Halolamina、Halopenitus、Halosarcina、Halostagnicola、Haloterrigena和Natrinema。

15种阳性分离株为

结论

本研究从库奇盐沼鉴定并表征了一种新的盐古菌分离株Haloarcula argentinensis IARI-SOAB1，证明其是高效的PHB生产菌株。通过优化培养条件，该菌株明显偏好乙酸钠而非糖类。在氮限制条件下进行的高产批次发酵中，当碳氮比为25:1时，PHB浓度达到19.49 gL^?1，占细胞干重的57.9%。值得注意的是，这一生产水平

CRediT作者贡献声明

戈文德·辛格·托马尔（Govind Singh Tomar）：研究、方法论。

乌迪塔·普什帕德（Udita Pushpad）：正式分析、研究、撰写——初稿。

米娜·拉托尔（Meena Rathore）：正式分析、撰写——审阅与编辑。

拉吉夫·考希克（Rajeev Kaushik）：监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念化。

人类和动物研究

本研究未涉及人类参与者、人类来源的材料、临床记录或动物实验。因此，不需要伦理批准和知情同意。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者声明本手稿的撰写过程中未使用任何生成式AI或AI辅助技术。所呈现的工作是原创的，所有作者已彻底审阅并对出版物的内容承担全部责任。

资助

本研究由印度农业研究委员会通过其“微生物在农业及相关领域的应用”网络项目资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢印度农业研究委员会农业研究与发展部“微生物在农业及相关领域的应用”网络项目的国家协调员以及ICAR-印度农业研究所提供的资金支持和设施。