基于星型聚阳离子(Star Polycation, SPc)负载噻呋酰胺(Thifluzamide)防治毁灭性土传病害——通过破坏柠檬酸循环与氨基酸代谢发挥高效直接杀菌活性

《Ecological Frontiers》：Efficient star polycation-based thifluzamide for destructive soil-borne disease: High direct fungicidal activity via impairing citrate cycle and amino acid metabolism

　　

马铃薯(Solanum tuberosum)是全球广泛种植的基础作物，但由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的马铃薯黑痣病(Black Scurf)对其生产构成严重威胁。本研究构建了一种基于星型聚阳离子(Star Polycation, SPc)的高效纳米递送系统，旨在提升噻呋酰胺(Thifluzamide，一种琥珀酸脱氢酶抑制剂 Succinate Dehydrogenase Inhibitor, SDHI)对R. solani的防治效果。SPc通过简单混合孵育对噻呋酰胺表现出约24%的中等载药量(Drug Loading Content, DLC)，噻呋酰胺/SPc复合物(Complex)通过氢键和范德华力(Van der Waals forces)自发自组装形成。同时，与SPc络合使噻呋酰胺粒径从778.92 nm降低至519.50 nm。值得注意的是，与单方噻呋酰胺相比，噻呋酰胺/SPc复合物使R. solani菌落直径显著减少44.12%。转录组分析(Transcriptomic Analysis)表明，纳米制剂(Nanoagent)处理可抑制氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation)、柠檬酸循环(Citrate Cycle, TCA Cycle)及氨基酸代谢(Amino Acid Metabolism)相关的大部分基因，表明纳米制剂对R. solani施加了更强的代谢胁迫从而抑制真菌增殖。重要的是，噻呋酰胺/SPc复合物在盆栽试验中防效提升63.26%，田间试验防效提升41.20%。本研究提出了一种高效的纳米递送系统用以改善噻呋酰胺生物活性，能有效抑制R. solani生长并保护马铃薯幼苗免受破坏性黑痣病侵害。

本研究针对马铃薯重要土传病害——由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的马铃薯黑痣病(Black Scurf)，以及常规琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂噻呋酰胺(Thifluzamide)存在的溶解性差、分散不均、植物吸收率低导致用量大且环境风险高等问题，构建了基于星型聚阳离子(Star Polycation, SPc)的噻呋酰胺纳米自组装递送系统(Thifluzamide/SPc Complex)，旨在通过纳米化改善其理化性质并增强对R. solani的抑制效果及植株内吸传导性。研究人员通过表征复合物组装机制与形貌，测定体外抑菌活性，利用转录组学(RNA-seq)解析增效机理，并结合LC-MS/MS检测植物吸收和盆栽及田间药效试验验证其应用价值。结果表明SPc可通过非共价作用负载噻呋酰胺形成纳米颗粒，显著降低粒径并提高分散性，增强对R. solani的直接杀菌活性及植株内吸传导量，通过干扰真菌能量代谢与氨基酸合成相关基因表达施加更强代谢胁迫，最终在盆栽和田间均显著提升对马铃薯黑痣病的防治效果。该研究为土传病害的可持续防控提供了高效的纳米农药(Nano-pesticide)设计思路，论文发表于《Ecological Frontiers》。

主要关键技术方法：

研究人员以立枯丝核菌(R. solani) AG-3菌株及马铃薯品种为材料，采用等温滴定量热法(ITC)解析噻呋酰胺与SPc间相互作用力及结合常数；利用动态光散射(DLS)与透射电子显微镜(TEM)表征复合物粒径与形貌；通过紫外分光光度法测定载药量(DLC)；采用含药平板法测定对R. solani菌丝生长的抑制率；利用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序(RNA-seq)及qRT-PCR验证差异表达基因(DEGs)；以LC-MS/MS定量马铃薯幼苗内噻呋酰胺含量评估植物吸收；在气候室开展盆栽接种R. solani防治试验计算病情指数(Disease Index, DI)与防治效果(Control Efficacy, CE)，并于新疆乌鲁木齐开展完全随机区组设计的田间试验验证防效。

3.1. Self-assembly of thifluzamide/SPc complex via hydrogen bond and Van der Waals force

通过UV-vis建立噻呋酰胺标准曲线测得SPc对噻呋酰胺的载药量(DLC)约为24.00%；ITC结果显示结合常数(Ka)为1.19×10⁵M^?1，吉布斯自由能变(ΔG)为?3.8 kcal/mol，焓变(ΔH)＝?71.78 kJ/mol、熵变(ΔS)＝?24.1 J/mol·K，表明二者通过氢键和范德华力发生强自发自组装。

3.2. Nanoscale thifluzamide/SPc complex

TEM显示原药呈簇状树枝结晶，复合物呈球形纳米颗粒；DLS显示粒径由原药的778.92±31.85 nm降至复合物的519.50±2.26 nm，多分散指数(PDI)由0.336降至0.228，证明SPc可使噻呋酰胺纳米化并改善分散均一性。

3.3. Enhanced bioactivity of SPc-loaded thifluzamide

PDA平板培养5 d后，噻呋酰胺单方使R. solani菌落直径较对照减少24.44%，而噻呋酰胺/SPc复合物使其减少57.78%；复合物较单方进一步使菌落直径显著减小44.12%(P＜0.001)，证实SPc络合显著增强噻呋酰胺体外抑菌活性。

3.4. Enhanced effect of SPc-loaded thifluzamide via suppressing most genes related with oxidative phosphorylation, citrate cycle and amino acid metabolism

RNA-seq共鉴定4174个差异表达基因(DEGs)，GO富集涉及碳水化合物代谢、核糖体等。噻呋唑胺/SPc复合物处理上调氧化磷酸化(NDUFS8, UQCRC8)、柠檬酸循环(PDHB/SDH, PEPCK, ACL1)及氨基酸代谢(AGXT, GS)相关基因，表明纳米制剂进入真菌后造成更强代谢胁迫，迫使真菌启动代偿性能量代谢及抗氧化防御反应，但最终因SDH被更高效地抑制而导致代谢紊乱，qRT-PCR验证了转录组结果。

3.5. Enhanced plant uptake of SPc-loaded thifluzamide

LC-MS/MS检测表明，处理6 h和12 h后，噻呋酰胺单方处理的马铃薯幼苗中药剂含量为99.12和122.38 mg·kg^?1，而复合物处理分别提高28.89%和26.52%，证实SPc纳米化促进噻呋酰胺经叶片吸收并向植株内传导。

3.6. Enhanced control efficacy of SPc-loaded thifluzamide against black scurf

盆栽试验：噻呋酰胺单方防效为36.68%(病情指数DI=38.67)，噻呋酰胺/SPc复合物防效达63.26%(DI=16.67)，症状明显减轻；田间试验：噻呋酰胺单方防效为19.00%，复合物防效达41.20%，为单方的2.17倍，表明纳米制剂在实际生产中具更优控病能力。

讨论与结论翻译(Direct Translation of Discussion & Conclusion Section)：

噻呋酰胺在水相中溶解度和分散性差限制其植物吸收和田间防效，既往研究表明SPc载体可有效克服该局限，本研究测得SPc对噻呋酰胺载药量为24.00%，与已报道氟吡菌酰胺(Fluxapyroxad)、杀虫单(Monosultap)等相当。SPc具疏水内核与阳离子外壳，通过氢键和范德华力封装农药。本研究SPc将噻呋酰胺粒径从778.92 nm降至519.50 nm，较小粒径增强叶面附着与跨膜转运从而提升生物活性，且少量SPc即可实现纳米化具应用潜力。平皿中复合物抑菌活性为单方的1.79倍。转录组显示处理下R. solani氧化磷酸化和三羧酸循环(TCA)基因为代偿性上调——包括PDHB、PEPCK、ACL1(TCA)、NDUFS8(复合体I)和UQCRC8(复合体III)及氨基酸代谢/抗氧化相关AGXT、GS，反映真菌试图绕过被噻呋酰胺(SDHI)抑制的复合体II(琥珀酸脱氢酶 Succinate Dehydrogenase, SDH)以维持ATP合成及谷胱甘肽(GSH)抗氧化防御，但SPc增强了真菌对噻呋酰胺的摄取致使SDH受更强抑制、ROS过量积累超过代偿能力。植物吸收试验显示复合物处理使内吸量增加约26%，归因于纳米粒径与表面电荷促进气孔进入及内吞作用。盆栽与田间试验证实纳米复合物降低病情指数，可在同等剂量下减少施药量。SPc体系未见植物药害，具良好生物相容性。综上，本研究利用SPc构建纳米递送系统提升噻呋酰胺生物活性：SPc通过氢键和范德华力与噻呋酰胺自发组装使粒径纳米化(519.50 nm)，载药量约24%；噻呋酰胺/SPc复合物较单方显著增强对R. solani抑制(菌落直径再降44.12%)，抑制氧化磷酸化、柠檬酸循环及氨基酸代谢相关基因施加更强代谢胁迫；显著提升马铃薯幼苗内吸量(约26%)及盆栽(63.26%)与田间(41.20%)对马铃薯黑痣病的防治效果，为土传病害绿色防控提供高效环保策略。