PrPC糖蛋白调节大气相关人工颗粒物诱发的小鼠肺癌发展

《Environmental Science & Technology》：PrPC Glycoprotein Modulates Atmospherically Relevant Artificial Particulate Matter-Induced Development of Lung Cancer in Mice

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直径小于2.5微米（PM2.5）的细颗粒物是肺癌的环境风险因素。然而，将PM2.5暴露与肿瘤发生联系起来的分子机制仍不清楚。我们发现细胞朊病毒蛋白（PrPC）是调节对PM2.5诱导的肺部病理反应的关键因素。与年轻C57BL/6小鼠相比，老年C57BL/6小鼠的PrPC和Sirt1表达水平较低，而HIF-1α表达水平较高，这与PM2.5暴露后死亡率增加和肺癌易感性增加相关。Prnp小鼠（PrPC野生型（WT）和敲除（KO）小鼠每天暴露于50 μg/m3的PM2.5环境中，持续5天。使用了两种PM2.5来源：一种合成离子-有机酸混合物和一种城市标准样品（NIST 1648a），这两种来源富含重金属和多环芳烃。通过成像、组织学、免疫组织化学和Western blotting技术评估肺部病理变化。PrPC缺乏会复制并加剧与年龄相关的病理变化，通过破坏Sirt1-p53-HIF1α轴促进肺气肿、缺氧和肿瘤发生。NIST引起的肿瘤发生比合成混合物更为严重，这突显了颗粒组成的重要性。PM2.5对环境和公共健康有显著影响，尤其是在老年人中，而PrPC是污染相关肺癌的机制调节因子和潜在生物标志物。

**引言**
细胞朊病毒PrPC由人类20号染色体和小鼠2号染色体上的Prnp基因编码，在各种器官和组织中广泛表达。(1) PrPC的最高表达水平出现在中枢神经系统，(1) 在那里它对神经元功能起关键作用并防止神经退行性疾病。(2) 研究表明，PrPC通过防止神经元凋亡、(3) 抵抗氧化应激、(4,5) 以及促进突触功能发挥神经保护作用。(6) PrPC转化为其错误折叠的致病性异构体PrPSc是朊病毒疾病的典型特征。(7) 大量研究探讨了PrPC除了与这些疾病相关之外的生理作用。(8) 尽管神经系统一直是PrPC研究的主要焦点，但最近的研究发现PrPC也存在于心脏、肝脏、肾脏和肺部等器官中。(9) 在肺部，PrPC存在于肺泡壁中，并存在于肺上皮细胞中，包括I型和II型肺泡细胞以及Clara细胞。(10) 这表明它们可能在呼吸健康中发挥作用。研究表明PrPC可以保护小鼠免受甲型流感病毒的致命感染(10) 并保护人类支气管上皮屏障免受氧化应激。(11) 然而，PrPC在肺部，特别是在肺癌中的功能作用仍大部分未阐明，需要进一步研究以全面了解其在肺生理中的作用。鉴于肺部直接暴露于环境污染物，探索PrPC在此背景下的功能特别有趣。

大气中细颗粒物（PM）浓度的上升正在多个方面造成有害影响，包括心脏、肺部、大脑、免疫系统和代谢。(12,13) 直径为2.5微米或更小的PM2.5的存在与哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）和成人肺癌等呼吸系统疾病的发病率增加有关，导致肺功能下降。(14,15) 在这些不良健康结果中，肺癌是与PM2.5暴露最相关的疾病。(16) 许多研究建立了PM2.5与肺癌风险增加和随后死亡率升高之间的明确联系。美国癌症协会确认了PM2.5暴露与肺癌死亡风险增加之间的因果关系。(17) 然而，PM2.5对肺癌发展的确切机制基础仍不清楚。

在我们最近的研究中，我们发现怀孕期间暴露于PM2.5会对胎儿肺部产生有害影响，诱导氧化应激。这些有害影响会持续到成年期，并导致造血干细胞的衰老，最终引发骨髓增生性疾病。(18) 我们证明新生儿小鼠暴露于PM2.5会导致终生持续的肺部损伤。(19) 具体来说，PM2.5暴露会在婴儿小鼠中引发早期和广泛的肺部炎症，这种炎症在暴露后6个月和12个月仍然存在，表明PM2.5的影响并未随时间减弱。(19) 这促使我们研究PM2.5在其他小鼠模型中的影响，包括老年小鼠和转基因小鼠。在这项研究中，我们发现PM2.5暴露会导致老年小鼠发生肺癌，并伴有Prnp基因表达和PrPC蛋白水平的下降。这些发现使我们关注PrPC缺乏小鼠中PM2.5的影响。

最近的研究强调了PM2.5对肺组织的破坏性影响，包括其诱导氧化应激和炎症的能力，这两者都是致癌的关键驱动因素。(20) 我们还考虑了肺气肿的作用，这是一种以肺泡破坏为特征的慢性肺部疾病(21)，最终导致呼吸功能下降和慢性缺氧。慢性炎症、氧化应激以及与肺气肿相关的组织重塑为肿瘤生长创造了有利环境。多项研究表明，肺气肿患者患肺癌的风险增加(22)，其中慢性炎症状态是这一关联的关键因素。(23) 为了进一步探讨这一点，我们使用了缺乏PrPC的Prnp KO小鼠，以研究PrPC的缺失是否会加剧PM2.5暴露的有害影响，从而导致肺癌发病率增加。我们的发现表明，暴露于实际大气中PM2.5的Prnp KO小鼠表现出比野生型小鼠更高的肺部损伤、肺气肿和肺癌发生率。这表明PrPC通过调节氧化应激和炎症途径在减轻PM2.5对肺组织的不良影响中起着关键作用。Prnp KO小鼠中观察到的加剧的肺部病理变化强调了PrPC在肺防御机制中的关键作用。

**材料与方法**
**动物**
C57BL/6小鼠从Damul Science（韩国大田）购买，并饲养至18-24个月大。Prnp（编码PrPC）敲除小鼠来自The Jackson Laboratory（美国缅因州巴港）。关于这些小鼠的详细信息已先前发表；这些小鼠至少可以正常发育和行为7个月，没有明显的免疫缺陷。(24) 为了减少遗传变异，这些Prnp0/0小鼠与C57BL/6J小鼠回交，然后再与FVB/NCrl小鼠回交10代（JAX库存#018122）。

**细颗粒物（PM2.5）样本**
用于小鼠暴露研究的两种PM2.5样本：
1. **合成PM2.5混合物**：制备了一种合成颗粒物混合物，以模拟常见的大气成分。该混合物包含草酸、苹果酸、戊二酸、蔗糖、2,5-二羟基苯甲酸、甘氨酸、硫酸铵、硝酸铵、醋酸、甘油和水，按特定比例混合（见表S4）。这种合成混合物主要由无机离子和小有机酸组成，不含多环芳烃（PAHs）或重金属，代表一个受控的化学环境。
2. **城市颗粒物标准参考物质（PM2.5 NIST）**：作为阳性对照，从美国国家标准与技术研究院（NIST）获得的参考城市颗粒物SRM 1648a（Sigma-Aldrich），采集自密苏里州圣路易斯的城市环境。该参考物质包含复杂的无机元素混合物（包括Pb、Cd、Zn、Cu等重金属）、碳化合物以及有害有机污染物，包括PAHs、多氯联苯（PCBs）和氯化农药。(25) 由于其组成，NIST SRM 1648a被广泛用于环境毒理学研究，作为城市空气污染的模型。所选的PM2.5 NIST悬浮液通过在冷却水浴中用超声波处理颗粒15分钟来制备。大于PM2.5的颗粒通过商用聚丙烯熔融吹制过滤器过滤掉。

**实验设计**
实验中，将6周大的年轻C57BL/6小鼠、18-24个月大的老年C57BL/6小鼠、6周大的年轻Prnp小鼠和15-18个月大的老年Prnp小鼠随机分为两组：对照组（CTL）和PM2.5暴露组。随机化过程按年龄、性别和基因型分层，以确保实验组之间的平衡分布。在整个实验过程中，所有小鼠都在12小时光照/黑暗周期下饲养，温度为22 ± 2°C，可自由饮水并食用标准饮食。所有实验程序均获得全北国立大学动物福利委员会批准（JBNU 2021-0165）。

PM2.5组中的C57BL/6和Prnp小鼠每天暴露于雾化颗粒2小时，持续5天。对照组在相同条件下暴露于蒸馏水。每个笼子中有4-5只小鼠。暴露后每天评估小鼠的健康状况并观察其整体情况。每月使用DEXA X射线进行肺部成像。在暴露后1个月、6个月或9个月时对小鼠实施安乐死，或者如果它们表现出呼吸急促等健康不良迹象，或者通过DEXA X射线检测到肺部异常时也进行安乐死。收集肺部组织进行分析。

**验证结果**
另一组年轻的Prnp KO小鼠暴露于NIST 1648a PM2.5（Sigma-Aldrich），这是一种含有多环芳烃（PAHs）、重金属和城市颗粒物的参考物质。暴露条件与PM2.5合成混合物相同。PM2.5组中的Prnp小鼠每天暴露于雾化颗粒2小时，持续5天。对照组在相同条件下暴露于无菌PBS。在这个组中，当小鼠表现出呼吸困难、体重下降或整体身体状况恶化等临床症状时，进行微计算机断层扫描（micro-CT），以评估早期肺部结构和潜在的肿瘤形成。随后收集肺部组织进行比较病理学和分子分析。

**Prnp敲除小鼠的基因分型**
使用Qiagen（德国希伦）的QIAamp DNA Blood and Tissue Kit从每只小鼠的尾部提取基因组DNA，按照制造商的协议进行操作。聚合酶链反应（PCR）混合物包括2.5 μL的10× H-star Taq反应缓冲液、5 μL的5× band helper、1 μL的10 mM dNTP混合物、1 μL的每种引物（10 μM）、0.2 μL的H-star Taq DNA聚合酶（BIOFACT，韩国大田），总体积为25 μL。PCR条件如下：95°C变性15分钟；34个循环，每个循环包括95°C 20秒、56°C 40秒和72°C 1分钟的退火和延伸；最后在72°C下延伸5分钟。PCR使用C1000 Touch Thermal Cycler仪器（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）进行。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，然后用溴化乙锭染色，并进行基因分型（野生型等位基因：388 bp；突变型等位基因：341 bp）。PCR产物在ABI 3730测序仪（Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城）上测序，使用Finch TV软件（Geospiza Inc., 华盛顿州西雅图）确认扩增子的DNA序列。使用表S2中列出的特定引物组从基因组DNA中扩增Prnp基因的野生型和突变型等位基因。

**大气模拟室（ASC）和暴露设置**
ASC和暴露设置已先前报道。(18) 一种含有10种成分的化学溶液溶解在纯水中，通过雾化器（TQ-50-C0.5；Meinhard）雾化生成PM，并优化了时间控制。产生的气溶胶颗粒在稀释室中用纯空气稀释，然后通过扩散干燥器去除水分。这种干燥的颗粒物（PM）随后被送入全身暴露室中，用于小鼠实验。对照组小鼠通过ASC系统暴露于不含10种成分混合物的蒸馏水中。使用OPC（OPC-N2；α Sense，英国）对暴露室内的颗粒物进行实时监测，以测量其粒径分布和数量浓度。此外，通过收集沉积在47毫米PTFE过滤器（PALL）上的气溶胶来确定颗粒物的质量浓度。暴露室内的温度、相对湿度和氧气水平分别保持在19.3 ± 1.9°C、47.0 ± 11.6%和21.4 ± 1.4%。所使用的颗粒物（PM）的组成与先前报道的一致。在没有小鼠的情况下，颗粒物在约10%的相对湿度下收集在特氟龙过滤器上2小时，然后用5毫升超纯水（25°C时电阻为18.2 MΩ cm）立即提取。无机盐的浓度通过离子色谱法（ICS-90；Dionex）测定。三个过滤器的平均质量离子组成分别为：NO3– = 11.7 μg/m3、SO42– = 11.9 μg/m3和NH4+ = 0.96 μg/m3。假设完全被铵中和，硫酸铵的质量计算为硫酸盐质量×1.38，硝酸铵的质量计算为硝酸盐质量×1.29，结果分别为约16.4 μg/m3和约15.0 μg/m3。无机盐占PM2.5质量的约50%。PM2.5组中的C57BL/6和Prnp小鼠每天接受2小时的雾化颗粒物暴露，持续5天。对照组小鼠在相同的条件下暴露于ASC室中的蒸馏水中。每个笼子内装有4-5只小鼠，所有小鼠都暴露于PM2.5中。使用颗粒计数器（BT-610；Met One）对暴露室内的颗粒物水平进行实时监测。大于PM2.5的颗粒物通过商用聚丙烯熔融吹制过滤器过滤掉。暴露剂量和持续时间是根据先前的研究（18,19）选择的，该研究使用50 μg/m3的浓度对清醒的幼鼠或怀孕小鼠进行5天暴露，导致后代出现肺部炎症。暴露室内的平均PM2.5浓度为51.8 ± 11.3 μg/m3。小鼠暴露测试中使用的PM浓度列在表S1中。在没有小鼠的情况下测量PM浓度和评估空气质量的方法已先前报道（18）。选择51.8 ± 11.3 μg/m3的浓度是基于我们之前的研究（18,19），这些研究表明该浓度产生了生物学上的相关效应，包括造血干细胞的衰老和后代髓增生性疾病的发展。双能X射线吸收测定（DEXA）实验过程中，小鼠通过腹腔注射100 mg/kg的氯胺酮接受麻醉（持续5分钟）。每只小鼠以俯卧姿势放置在扫描床上，四肢和尾巴远离身体。使用成像系统获取肺部图像。在成像过程中允许小鼠自由呼吸。微CT成像和3D肺部分割使用SkyScan 1276系统（Bruker，比利时）进行，源电压为60 kV，电流为200 μA，使用0.5毫米铝过滤器。对于出现呼吸困难和体重下降迹象的小鼠，在扫描前通过腹腔注射Zoletil/Rompun混合物（1:1比例）进行麻醉。图像是在360°旋转范围内以0.6°的角度步长获取的，采用2 × 2合并方式，最终体素大小为20.2 μm。每次扫描包括帧平均和平场校正以提高图像质量。获取后，使用NRecon软件（Bruker，版本1.7.4.6）重建数据集，并以BMP格式导出。然后使用3D Slicer（版本5.2.2）对重建的数据集进行肺部分割和3D可视化。使用半自动阈值处理和手动编辑工具分离肺组织并生成3D模型。肺原代细胞的分离方法如先前所述（26）。小鼠被安乐死后，收集其肺部组织。将肺组织用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，并用剪刀切成小块。组织碎片转移到10厘米培养皿中，加入10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基中，在37°C下孵育3小时。再加入10-12毫升培养基以促进肺纤维细胞从组织块中迁移。每3天更换一次培养基。苏木精和伊红染色（H&E）肺组织先用4%甲醛固定，然后浸入石蜡中。将石蜡块切成5微米厚的切片，用H&E溶液（Gill No. 3苏木精，Sigma-Aldrich LLC）染色，然后用0.25%伊红Y（Sigma-Aldrich LLC）复染。为了进行形态计量分析，所有切片由两名不知道样本来源的独立观察者评估。免疫组化（IHC）分析使用二甲苯对石蜡包埋的5微米厚肺组织切片进行脱蜡，然后用分级乙醇水洗重新水化。通过在室温下将切片在0.3% H2O2的甲醇中孵育30分钟来淬灭内源性过氧化物酶活性。切片在缓冲液中洗涤5分钟，然后用稀释的正常封闭血清封闭30分钟。组织切片在4°C下过夜与特异性抗体孵育，包括c-Myc（sc-42-Santa Cruz Biotechnology）、Sox2（sc-365823-Santa Cruz Biotechnology）、TTF1（sc-53136-Santa Cruz Biotechnology）、K-ras（TA801672-Origene）、Ki67（ab16667-abcam）、CK7（ET1609-63 Huabio）、PrPC（A03202-SPI bio）、HIF-1α（NB-100-449-Novus Biologicals）、COX2（BS1076-BioWord）、IL-1β（sc-52012-Santa Cruz Biotechnology）、TNFα（AB1793-Abcam）、8-OHdG（Ab62623-Abcam）、CD4（25229-Cell Signaling）、CD8（sc-7970-Santa Cruz Biotechnology）和VEGF-A（BS2853-Bio World）。洗涤后，切片与稀释的生物素化二抗溶液孵育30分钟。用VACTASTAIN ABC试剂处理切片以可视化免疫复合物。最后，用苏木精（Sigma-Aldrich）对切片进行复染。使用EasyScan切片扫描仪（Motic）获取整个切片的图像，并使用Motic ImagePlus软件（Motic）对这些图像进行分析。IHC评分在10个随机选择的、不重叠的视野中进行，使用ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov/ij，访问日期2022年4月12日）。平均线截距（MLI）分析固定后，5微米切片进行苏木精和伊红染色。通过100倍显微镜观察，评估平均线性截距（MLI），作为肺泡壁间距的指标。根据先前报道的方法（27），通过计算穿过肺切片的总线长度除以遇到的截距总数（每个肺至少72条线）来确定MLI。Western Blotting从肺组织和细胞裂解物中提取蛋白质，使用7-12% SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用5%脱脂牛奶（Bio-Rad）封闭，然后与针对K-ras（TA801672-Origene）、CK7（ET1609-63-Huabio）、Sox2（sc-365823-Santa Cruz Biotechnology）、Ki67（ab16667-Abcam）、TTF1（sc-53136-Santa Cruz Biotechnology）、c-Myc（sc-42 Santa Cruz Biotechnology）、PrPC（A03202-SPI bio）、HIF-1α（NB-100-449-Novus Biologicals）、COX2（BS1076-BioWord）、IL-1β（sc-52012-Santa Cruz Biotechnology）、TNF-α（AB1793-Abcam）、Sirt1（Millipore，Billerica，MA）、p-p53（sc-71786 Santa Cruz Biotechnology）、p53（sc-55476 Santa Cruz Biotechnology）、Caspase-1（2225 Cell Signaling）和γH2AX（AB26350 Abcam）的特异性一抗孵育。β-actin作为内部对照。膜洗涤后，与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG孵育。信号通过化学发光检测试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）可视化，并使用密度计扫描仪（FUSION SOLO 4S. WL，Vilber）进行分析。总RNA提取和实时PCR使用Trizol裂解试剂根据制造商的方案（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）从肺组织中提取总mRNA。使用AmpiGene cDNA合成试剂盒（Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY）从0.5至1 μg的总RNA合成第一条链cDNA。然后使用Power SYBER@ Green PCR Master Mix（Life Technologies, CA）和Applied Biosystem平台（Thermo Fisher Scientific）进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）。S18核糖体亚基作为内源性对照，用于标准化原始qPCR数据。检测中使用的引物序列详细列在表S3中。目标基因的表达水平以delta-Ct（ΔCt）值表示，相对于S18，以便精确量化单个基因的表达。统计分析使用GraphPad Prism软件（版本8.0，La Jolla, CA）进行，结果以实验次数的平均值±标准误差（SEMs）表示。统计分析包括Student’s t检验和单因素方差分析（ANOVA），统计显著性定义为95%置信水平（p < 0.05）。结果 PM2.5仅在老年小鼠中导致高死亡率和肺癌，而在年轻小鼠中不会PM2.5暴露对小鼠肺生理的影响取决于年龄，我们将C57BL/6年轻（6周大）和老年C57BL/6（18–24个月大）小鼠暴露于大约50 μg/m3的PM2.5质量浓度中（表S1）。PM2.5暴露对年轻小鼠的存活率没有影响（图1A，未填充的灰色圆圈）。相比之下，暴露于PM2.5的老年小鼠从暴露后1个月开始死亡，大约80%的小鼠在3个月内死亡（图1A，未填充的红色菱形）。这些发现表明老年小鼠对PM2.5的暴露更敏感。图1图1. PM2.5对肺癌发展的年龄依赖性影响。(A) 分析暴露于PM2.5的年轻和老年C56BL/6小鼠的存活率（n = 20）。(B) 使用H&E染色的对照组和暴露于PM2.5的老年小鼠的代表性肺照片和切片（比例尺 = 200 μm）；显示了一个代表性结果（n = 6）。(C) 使用免疫组化技术在暴露于PM2.5的年轻和老年小鼠的肺中检测腺癌的分子标志物（c-Myc、Sox2、TTF1、K-ras）（10倍比例尺 = 200 μm；20倍比例尺 = 120 μm）；(n = 6)。(D) 使用免疫组化（比例尺 = 200 μm）、Western blotting分析和RT-PCR检测肺中PrPC蛋白和mRNA的年龄依赖性表达水平；显示了一个代表性结果（n > 6）。(E) 使用免疫组化（比例尺 = 200 μm）和Western blotting分析检测肺中HIF1α和Sirt1的年龄依赖性表达水平；显示了一个代表性结果（n = 6）。数据以平均值±SEM表示，*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001，通过Student’s t检验比较年轻与老年或对照组与PM2.5。高分辨率图像与暴露于PM2.5的年轻小鼠的肺组织不同，暴露于PM2.5的老年小鼠的肺组织表现出与肺癌相关的表型（图1B）。此外，暴露于PM2.5的老年小鼠的肺组织中表达了可检测水平的c-Myc、Sox2、甲状腺转录因子-1（TTF-1）和K-ras蛋白（图1C），这些都是已知的肺腺癌标志物（28,29），而对照组小鼠则没有（图1C和S1）。相反，肿瘤对细胞角蛋白7（CK7）呈阴性，这是区分某些上皮癌的诊断指标（30）。肿瘤对Ki-67呈散在阳性（大约30–40%），Ki-67是一种与癌症生长相关的生物标志物（31）。PM2.5诱导了氧化应激（8-OHdG）和炎症（COX2和TNF-α）的水平，并导致年轻和老年小鼠的肺中免疫细胞（CD4+和CD8+ T细胞）浸润增加。这些由PM2.5暴露引起的现象在老年小鼠中比在年轻小鼠中更为严重（图S3）。这些发现表明PM2.5对肺癌的发展有年龄依赖性影响。PrPC缺乏加剧了PM2.5暴露后的死亡率和肺癌发病率在肺中检测到PrPC的表达，尽管其水平低于神经系统（32）。与先前的发现一致，PrPC蛋白和mRNA在年轻小鼠的肺中表达水平较高，但在老年小鼠的肺中PrPC的转录和蛋白表达水平降低（图1D）。随着年龄的增长，肺部环境变得更加缺氧，炎症状态升高，这会引发肺气肿和肺癌（33,34）。老年小鼠的肺中HIF1α的表达水平高于年轻小鼠（图1E，顶部面板）。Sirt1参与调节肺癌的进展和迁移。(35) 与PrPC类似，Sirt1在老年小鼠的肺部几乎不表达（图1E，底部面板）。为了研究PrPC作为PM2.5暴露后肺癌死亡率增加和发病率升高的分子决定因素的作用，我们使用了野生型（WT）小鼠和PrPC基因敲除（KO）小鼠，后者表现出相似的表型（图S4）。如图2A所示，未暴露于PM2.5的年轻WT小鼠（6周大）和暴露于PM2.5的小鼠的存活率相当。年轻的KO小鼠（6周大）也表现出相似的存活率。相比之下，年轻的KO小鼠对PM2.5暴露非常敏感，在暴露后6个月内死亡率高达60%（图2A，未填充的红色菱形）。与年轻的WT小鼠相比，暴露于PM2.5的年轻KO小鼠的肺组织中出现了实性腺癌灶，并且肿瘤相关因子（包括c-Myc、Sox2、TTF-1和K-ras）的水平显著升高（图2B–D和S8A）。CK7的水平没有显著变化，Ki67在年轻的对照组和暴露于PM2.5的小鼠中很少观察到（图S5）。在某些情况下，肿瘤转移发生在那些表达c-Myc、Sox2、TTF-1和K-ras蛋白但未表达Ki67和CK7的年轻KO小鼠的大脑周围（图2E）。

图2. PrPC在调节暴露于PM2.5的年轻小鼠的存活率和肺癌发病率中的保护作用。(A) 分析暴露于PM2.5的年轻WT和Prnp KO小鼠的存活率（n = 20）。(B) 双能X射线吸收测定（DEXA）分析。箭头指示肿瘤；显示了一个代表性结果（n = 6）。(C) (D) 使用免疫组化方法评估暴露于PM2.5的年轻WT和KO小鼠肺部的c-Myc、Sox2、TTF1和K-ras的表达情况（比例尺 = 200 μm）；更高倍数的图像（20×；比例尺 = 120 μm）见图S13，以及Western blotting分析；显示了一个代表性结果（n = 6）。(E) 对暴露于PM2.5的年轻WT和KO小鼠进行DEXA分析；在暴露于PM2.5的年轻KO小鼠中观察到脑部肿瘤转移。显示了Prnp小鼠的代表性照片。使用免疫组化方法评估暴露于PM2.5的年轻KO小鼠肿瘤转移中的c-Myc、Sox2、TTF1和K-ras、Ki67和CK7的表达水平（比例尺 = 200 μm）。箭头指示肿瘤。(F, G) 使用Western blotting和免疫组化方法分析暴露于PM2.5的年轻KO小鼠肺部的Sirt1、p-p53、p53、HIF1α、氧化应激和炎症标志物以及免疫细胞浸润的水平（比例尺 = 200 μm）；更高倍数的图像（20×；比例尺 = 120 μm）见图S13。数据以平均值±SEM显示，**p < 0.01和***p < 0.001表示WT对照组与WT PM2.5或KO对照组与KO PM2.5之间的差异，通过Student’s t检验得出。ns表示无显著性。

与年轻的WT小鼠相比，暴露于PM2.5的老年WT小鼠（15–18个月大）在暴露后4周内迅速死亡，存活率为50%（图S6A，未填充的蓝色圆圈）。老年KO小鼠（15–18个月大）对PM2.5的反应比其WT对应物更为严重。所有暴露于PM2.5的老年KO小鼠在暴露后4周内都死亡（图S6A，未填充的红色菱形）。肿瘤相关因子如c-Myc、Sox2、TTF-1和K-ras在老年KO小鼠中表达，而Ki67和CK7则没有（图S6B,C）。这些发现表明PrPC在调节暴露于PM2.5后的存活率和肺癌发病率中起着关键的保护作用。

接下来，我们研究了PrPC在暴露于PM2.5的年轻和老年KO小鼠的各种器官中的保护作用。与相应的WT小鼠相比，年轻和老年KO小鼠的肾脏没有观察到显著的形态学变化（图S7A）。年轻KO小鼠的肝脏显示出脂肪细胞增加和肝细胞损伤，而老年KO小鼠的肝脏则表现出界面性肝炎（图S7B）。WT小鼠在暴露于PM2.5后肝脏没有出现任何组织学变化。老年KO小鼠的脾脏与相应的WT小鼠相比，形状不完整，密度和大小减小，白色髓质边界不清（图S7C）。

PrPC缺乏会加速肺气肿以及随后的缺氧、炎症和血管生成，这些是肺癌发展的风险因素。接下来，我们研究了PrPC缺乏如何加剧暴露于PM2.5后的死亡率和肺癌发病率。我们观察到KO小鼠的肺部发生了明显的形态学变化，表现为类似肺气肿的变化，如远端气腔扩大、肺泡气腔普遍扩张合并成更大的腔体、肺泡孔扩大以及许多肺泡隔膜的狭窄和碎裂（图3A）。在15只KO小鼠中，有11只出现了肺气肿，而WT小鼠中只有5只。肺气肿在年轻和老年KO小鼠中都存在；老年KO小鼠的肺气肿发病率显著高于年轻KO小鼠。相比之下，肺气肿仅出现在老年WT小鼠中，而年轻WT小鼠中没有（图3A,D，底部面板）。无论年龄如何，KO小鼠的平均线性截距（MLI）显著高于WT小鼠（图3A）。肺气肿主要发生在老年患者中，并与缺氧和肺癌的诱导密切相关。(36,37) 即使在没有暴露于PM2.5的老年KO小鼠中，也偶尔会出现肺癌（图3B）。

图3. PrPC缺乏导致肺气肿、缺氧、炎症和血管生成，并引发肺癌。(A) 通过H&E染色（2×比例尺 = 1200 μm；10×比例尺 = 200 μm）和平均线截距（MLI）分析比较Prnp WT和KO小鼠的肺部形态；显示了一个代表性结果（n = 6）。数据以平均值±SEM显示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，通过单因素ANOVA得出。(B) 通过H&E染色（比例尺 = 200 μm）和免疫组化（比例尺 = 200 μm）可视化未暴露于PM2.5的老年Prnp KO小鼠肺部c-Myc、Sox2、TTF1、K-ras、Ki67和CK7的表达水平；显示了一个代表性结果（n = 6）。(C) 通过Western blotting评估从Prnp WT和KO小鼠分离出的原代肺细胞中的Sirt1和HIF1α的表达水平；显示了一个代表性结果（n = 6）。(D) 分析Prnp WT和KO小鼠正常和肺气肿肺组织中的Sirt1表达水平。左侧面板：使用Western blotting和H&E染色检测Prnp KO小鼠中的Sirt1表达水平（比例尺 = 200 μm）。右侧面板：显示Prnp小鼠肺气肿中的Sirt1表达水平；显示了一个代表性结果（n = 6）。(E, F) 通过Western blotting和免疫组化分析暴露于PM2.5的老年Prnp小鼠肺部中的Sirt1、p-p53、p53、HIF1α、氧化应激、炎症标志物和免疫细胞浸润的水平（10×比例尺 = 200 μm；20×比例尺 = 120 μm）；显示了一个代表性结果（n = 6）。(G) 通过免疫组化分析评估暴露于PM2.5的年轻和老年Prnp小鼠肺部VEGF-A的表达水平（10×比例尺 = 200 μm；20×比例尺 = 120 μm）。数据以平均值±SEM显示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001表示WT对照组与WT PM2.5或KO对照组与KO PM2.5之间的差异，通过Student’s t检验得出。ns表示无显著性。

随着年龄的增长，KO小鼠肺部的肺气肿变得更加明显。它通过触发缺氧相关信号通路导致缺氧，这从老年KO小鼠的原代细胞中升高的HIF1α和Sirt1水平可以得到证明（图3C和S9A）。在未暴露于PM2.5的WT和KO小鼠的肺组织中未检测到Sirt1水平的变化（图3D，左侧面板；图S9B，左侧图表）。在肺气肿发病率升高的KO小鼠中，Sirt1水平上调（图3D，右侧面板；图S9B，右侧图表）。暴露于PM2.5后，年轻和老年KO小鼠的Sirt1、磷酸化p53（p-p53）和p53水平均明显增加（图2F；图3E，左侧面板；图S8B和S9C）。此外，Western blot分析显示暴露于PM2.5后，年轻和老年KO小鼠的HIF1α和炎症标志物（如COX2、IL-1β和TNF-α）水平升高（图2F；图3E，右侧面板；图S8B和S9C）。免疫组化结果显示，暴露于PM2.5的年轻和老年KO小鼠的肺部HIF1α、氧化应激（8-OHdG）和炎症（COX2和TNF-α）水平升高，以及免疫细胞（CD4+和CD8+ T细胞）的浸润增加（图2G和3F）。缺氧和炎症之间存在相互依赖的关系。(38) 在暴露于PM2.5的KO小鼠的肺部观察到VEGF-A水平显著升高，VEGF-A是癌症中血管生成的关键介质（图3G）。这些发现强烈表明PrPC缺乏会诱导类似肺气肿的变化，从而在缺氧条件下激活血管生成并促进肺癌的发展。

PM2.5 NIST作为阳性对照，显示出比合成PM2.5更广泛的致癌潜力。为了验证和比较我们合成PM2.5的致癌潜力，我们使用了Sigma-Aldrich认证的PM2.5 NIST，其中含有PAHs和重金属，(25) 作为阳性对照。暴露于PM2.5NIST的WT和KO年轻小鼠在1–2个月内都出现了可见的肺肿瘤。如图4A所示，早在第3–5周就发生了死亡，50%的WT小鼠和80%的KO小鼠在第11周死亡。相比之下，我们的合成PM2.5缺乏致癌PAHs和重金属，仅在KO小鼠中诱导了肺肿瘤，在暴露6个月后死亡率为60%（图2A）。微CT显示多个边界不清晰的磨玻璃样阴影，提示早期肿瘤形成。随后使用3D Slicer分割进行的3D重建显示了形状不规则、密度不均匀的实性结节肿块，与肿瘤病灶或肿瘤灶一致。肺切片的H&E染色证实了多个具有异常细胞生长和肺泡结构破坏的病灶的存在。这些病灶表现出细胞密度增加、核多形性以及向相邻肺泡空间的局部浸润。病变的空间分布与微CT分析中识别的结节相匹配（图4B）。IHC染色和Western blot分析显示肺腺癌标志物（包括c-Myc、TTF-1、Sox2和K-Ras）显著上调（图4C,D）。暴露于PM2.5 NIST后，WT小鼠中的PrPC表达水平保持不变（图4D），支持了活跃的致癌信号通路的存在。这些结果表明，PM2.5 NIST驱动了一种快速且侵袭性的肿瘤表型，无论在结构还是分子水平上都明显具有早期恶性转化的证据。这种致癌过程可能因NIST颗粒的化学复杂性而加速，这些颗粒可以绕过正常的炎症屏障并直接激活致癌级联反应。

图4. PM2.5 NIST暴露在Prnp WT和KO小鼠中诱导早期和广泛的肿瘤发生。(A) 暴露于PM2.5 NIST后的年轻Prnp WT和KO小鼠的存活分析（每组n = 10）。(B) 代表性的肺部大体图像、微CT扫描（冠状、横截面和矢状面视图）、显示肺组织内肿瘤结节（棕色）的3D重建肺部图像（n = 5），以及H&E染色的肺组织切片（2×比例尺 = 1200 μm；10×比例尺 = 200 μm）（n = 5）。红色箭头指示肿瘤灶。(C) 对每组肺组织中的Ki67、CK7、c-Myc、TTF1和K-ras进行免疫组化分析（比例尺 = 200 μm）；更高倍数的图像（20×；比例尺 = 120 μm）见图S14。呈现了阳性染色区域的量化结果（每组n = 4）。(D) 对对照组和暴露于PM2.5 NIST的WT和KO小鼠肺组织中的CK7、c-Myc、TTF1、Sox2、K-ras和PrPC进行Western blot分析。量化了带强度（每组n=4）。(E) 通过Western blotting分析了PM2.5和PM2.5 NIST诱导的肺肿瘤中SIRT1、p53、γ-H2AX、HIF-1α、TNF-α、IL-1β、COX-2和Caspase-1的蛋白质水平。展示了量化的蛋白质表达水平（每组n=4）。数据以平均值±SEM表示，*p < 0.05，**p < 0.01，使用Student’s t-test比较WT对照组与WT PM2.5 NIST或KO对照组与KO PM2.5 NIST或PM2.5与PM2.5 NIST。ns表示无显著性。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。

为了研究潜在的机制差异，我们比较了由合成PM2.5和PM2.5 NIST诱导的肿瘤。Western blot分析显示，仅NIST暴露组的肿瘤中COX-2、HIF-1α和Caspase-1（炎症小体的组成部分）的表达显著升高（图4E），这表明由PM2.5 NIST的复杂化学成分驱动的肿瘤微环境更具侵袭性和缺氧性。相比之下，SIRT1、p53、γ-H2AX（DNA双链断裂的标志物）、TNF-α和IL-1β的表达水平在两组之间相当（图4E），表明应激反应和DNA损伤途径有重叠。这些发现共同表明，两种类型的PM2.5都能诱导肿瘤形成；然而，PM2.5 NIST触发了更严重的炎症和缺氧反应，表明其致癌潜力更高。

讨论
这种蛋白质在全身普遍存在，并有两种异构体：PrPC和PrPSc2。虽然PrPSc因其在人类和其他哺乳动物中的多种神经退行性疾病中的作用而臭名昭著，但PrPC也被认为具有保护作用、细胞分化和铜稳态功能。PrPC在癌症生物学的多个方面发挥作用，包括细胞增殖、转移、细胞死亡、药物抵抗和癌干细胞的调控。在肺癌中，PrPC通过TGF-β和PD-1介导的途径上调Tregs的发育，从而促进肿瘤进展。我们使用50 μg/m3的PM2.5浓度研究了PrPC如何调节对环境压力的敏感性，该浓度反映了东亚主要城市等高度污染地区的常见PM2.5水平。这种生物学上相关的PM2.5暴露使我们能够在保持动物福利伦理标准的同时，模拟小鼠中的PM2.5诱导的肺病理和肿瘤发生。我们在Prnp WT和KO小鼠中的发现可以从环境相关性的角度进行解释，提供了关于年龄相关PrPC丢失如何增加对空气污染物相关肺疾病易感性的机制见解。这一框架通过将实验观察结果与潜在的人类健康后果联系起来，增强了我们结果的转化价值。

在我们的研究中，我们首次证明了PrPC在肺中的表达随着年龄的增长而显著下降（图1D）。此外，老年小鼠暴露于PM2.5后死亡率增加，肺癌发病率也上升（图1A–C）。PM2.5诱导的肺癌检测出c-Myc、Sox2、TFF1和K-ras阳性，实体瘤灶被诊断为腺癌。使用Prnp WT和KO小鼠暴露于PM2.5的实验证明了PrPC在肺生理学中的保护作用（图2）。在Prnp WT和KO小鼠的肺形态学比较分析中，观察到KO小鼠的肺中肺气肿的比例显著更高（图3A）。肺气肿同时存在于年轻的和年老的KO小鼠中，而在年轻的WT小鼠中未检测到。KO小鼠的平均线性截距（MLI）高于对照组小鼠（图3A）。炎症介质（包括COX2、TNF-α和IL-1β）以及缺氧标志物HIF1α的表达水平在KO小鼠中也更高（图2F和S8B）。这些发现表明，PrPC的缺失会增强暴露后的炎症和缺氧反应。由于肺气肿导致的肺组织结构变化，如肺泡表面积减少和气体交换受损，可能通过创造缺氧环境间接促进肺癌。我们在年轻和年老的PrPC缺陷小鼠中观察到VEGF-A表达水平升高（图3G），这与之前的研究结果一致。VEGF-A表达升高可能不会直接导致癌症，但会通过激活与缺氧相关的信号通路（特别是HIF1α通路）产生有利于致癌的微环境。这种解释与肺气肿和肺癌具有共同风险因素的观点一致，包括吸烟和空气污染，但不意味着直接的因果关系。然而，慢性组织缺氧和炎症会促进基因突变和细胞改变，从而促进细胞的恶性转化。

PrPC缺陷不仅影响肺部，在暴露于PM2.5时还会影响其他器官。年轻KO小鼠的肝脂肪细胞积累，肝细胞受损（图S7B），这与之前关于PrPC缺失时脂质代谢的报告一致。PM2.5暴露还导致老年KO小鼠的脾白髓丧失（图S7C），这与之前关于T细胞和B细胞分离紊乱的发现一致。这些系统性疾病与KO小鼠的高死亡率相关，年轻动物的死亡率为60%，老年动物在4周内死亡率为100%（图2A–D和S6A）。相比之下，年轻C57BL/6和WT小鼠在相同条件下未发展出肺癌，但死亡率较高。这些结果共同支持PrPC在肺部和全身对环境压力的抵抗力中的作用。我们还强调了进一步研究PrPC在代谢以及免疫和造血器官中作用的必要性。

在分子水平上，我们观察到Sirt1的表达水平通常随年龄增长而下降（图3D，左侧面板；图1E，底部面板），但在Prnp KO小鼠的缺氧条件下显著增加（图3D，右侧面板），这与之前的研究结果一致。在暴露于PM2.5后，KO小鼠的肺组织中Sirt1、p-p53和p53的水平显著上调（图2F；图3E；图8B和S9C），这促进了肺癌的发展。Sirt1是一种依赖NAD+的脱乙酰酶，在应激反应中起两个作用：上调可以防止氧化应激，并脱乙酰化p53，减少其促凋亡活性。PM2.5诱导的氧化应激和DNA损伤在KO小鼠中触发了p53和Sirt1的激活；然而，PrPC的缺失似乎增强了这种反应。PrPC的缺失可能阻止了通常平衡Sirt1-p53信号传导的调节机制，从而使具有DNA损伤的细胞存活和增殖，增加了癌症的风险。在WT小鼠中未观察到这种失调，因为PrPC有助于维持稳态。与我们的发现一致，Sirt1在几种人类癌症中过表达，且Sirt1水平与肺癌患者的p53呈正相关。炎症和p53突变是肿瘤进展的关键驱动因素，这些因素也与Sirt1水平呈正相关。本研究中的PrPC和p53在PM2.5暴露后的上调强调了暴露于高浓度空气污染的人类中类似分子改变的潜力，强调了预防措施和靶向治疗的必要性。了解Sirt1如何调节p53活性为针对人类肺癌的潜在治疗策略提供了见解。

我们的研究首次证明，PrPC在肺中的表达在衰老过程中明显下降（图1D）。此外，老年小鼠暴露于PM2.5后死亡率增加，肺癌发病率也上升（图1A–C）。PM2.5诱导的肺癌检测出c-Myc、Sox2、TFF1和K-ras阳性，实体瘤灶被诊断为腺癌。使用Prnp WT和KO小鼠暴露于PM2.5的实验证明了PrPC在肺生理学中的保护作用（图2）。在Prnp WT和KO小鼠的肺形态学比较分析中，观察到KO小鼠的肺中肺气肿的比例显著更高（图3A）。肺气肿存在于年轻的和年老的KO小鼠中，而在年轻的WT小鼠中未检测到。KO小鼠的平均线性截距（MLI）高于对照组小鼠（图3A）。炎症介质（包括COX2、TNF-α和IL-1β）以及缺氧标志物HIF1α的表达水平在KO小鼠中也更高（图2F和S8B）。这些发现表明，PrPC的缺失会增强暴露后的炎症和缺氧反应。由于肺气肿导致的肺组织结构变化，如肺泡表面积减少和气体交换受损，可能通过创造缺氧环境间接促进肺癌。我们在年轻和年老的PrPC缺陷小鼠中观察到VEGF-A表达水平升高（图3G），这与之前的研究结果一致。VEGF-A表达升高可能不会直接导致癌症，但会通过激活与缺氧相关的信号通路（特别是HIF1α通路）产生有利于致癌的微环境。这种解释与肺气肿和肺癌具有共同风险因素的观点一致，包括吸烟和空气污染，但不意味着直接的因果关系。然而，慢性组织缺氧和炎症会促进基因突变和细胞改变，从而促进细胞的恶性转化。

PrPC缺陷不仅影响肺部，在暴露于PM2.5时还会影响其他器官。年轻KO小鼠的肝脂肪细胞积累，肝细胞受损（图S7B），这与之前关于PrPC缺失时脂质代谢的报告一致。PM2.5暴露还导致老年KO小鼠的脾白髓丧失（图S7C），这与之前关于T细胞和B细胞分离紊乱的发现一致。这些系统性疾病与KO小鼠的高死亡率相关，年轻动物的死亡率为60%，老年动物在4周内死亡率为100%（图2A–D和S6A）。相比之下，年轻C57BL/6和WT小鼠在相同条件下未发展出肺癌，但死亡率较高。这些结果共同支持PrPC在肺部和全身对环境压力的抵抗力中的作用。我们还强调了进一步研究PrPC在代谢以及免疫和造血器官中作用的必要性。

在分子水平上，我们观察到Sirt1的表达水平通常随年龄增长而下降（图3D，左侧面板；图1E，底部面板），但在Prnp KO小鼠的缺氧条件下显著增加（图3D，右侧面板），这与之前的研究结果一致。在暴露于PM2.5后，KO小鼠的肺组织中Sirt1、p-p53和p53的水平显著上调（图2F；图3E；图8B和S9C），这促进了肺癌的发展。Sirt1是一种NAD+-依赖的脱乙酰酶，在应激反应中起两个作用：上调可以防止氧化应激，并脱乙酰化p53，减少其促凋亡活性。PM2.5诱导的氧化应激和DNA损伤在KO小鼠中触发了p53和Sirt1的激活；然而，PrPC的缺失似乎增强了这种反应。PrPC的缺失可能阻止了通常平衡Sirt1-p53信号传导的调节机制，从而使具有DNA损伤的细胞存活和增殖，增加了癌症的风险。在WT小鼠中未观察到这种失调，因为PrPC有助于维持稳态。与我们的发现一致，Sirt1在几种人类癌症中过表达，且Sirt1水平与肺癌患者的p53呈正相关。炎症和p53突变是肿瘤进展的关键驱动因素，这些因素也与Sirt1水平呈正相关。本研究中的PrPC和p53在PM2.5暴露后的上调强调了暴露于高浓度空气污染的人类中类似分子改变的潜力，强调了预防措施和靶向治疗的必要性。了解Sirt1如何调节p53活性为针对人类肺癌的潜在治疗策略提供了见解。

我们的研究强调了PM2.5组成和宿主遗传背景对肺肿瘤发生的关键影响。我们观察到，含有已知致癌物（如PAHs和重金属）的Sigma认证PM2.5 NIST在WT和KO小鼠中迅速诱导肿瘤形成和高死亡率（图4A,B）。相比之下，缺乏这些致癌物的合成PM2.5仅在长期暴露后导致KO小鼠肿瘤形成，表明化学复杂性可以显著加速致癌过程，而遗传脆弱性（如PrPC的缺失）即使对于较弱的颗粒也会使宿主易于肿瘤发展。组织和成像分析确认了两种PM2.5暴露模型中的肺腺癌特征；然而，NIST组的肿瘤更具侵袭性，病变更大且边界不清（图4C）。分子分析显示，两种颗粒类型都激活了核心致癌通路（c-Myc、TTF-1、Sox2和K-Ras），而NIST诱导的肿瘤显示出更高的急性炎症和缺氧相关标志物水平，如COX-2、HIF1α和Caspase-1，表明肿瘤微环境更为恶劣。COX-2和Caspase-1与炎症小体激活和焦亡有关，而HIF1α在缺氧应激下促进血管生成和代谢重编程，这是PAH诱导致癌的常见特征。应激相关蛋白（SIRT1、p53、γ-H2AX、TNF-α和IL-1β）在两组中同样升高，表明暴露于PM2.5后存在共同的细胞应激和DNA损伤反应。合成PM仅在抗氧化防御受损的KO小鼠中诱导肿瘤发生，依赖于累积的DNA损伤和细胞应激。同时，PM2.5 NIST通过炎症和缺氧发挥强烈的致癌作用，与其毒性成分无关。图4E显示同一组内个体间生物标志物表达的变异性，可能是由于个体间对PM2.5的敏感性、肿瘤微环境和疾病阶段的差异。

我们的发现表明，即使短暂的PM2.5暴露也会引起长期的病理变化，尤其是在遗传上易感的个体中。类似的，流行病学证据表明，短期PM2.5暴露会增加急性肺损伤和长期肺癌的易感性。KO小鼠模型不能完全模拟人类肺癌；然而，小鼠和人类之间Sirt1和p53等关键通路的保守性，以及PM2.5的已知致癌性，支持了我们发现的转化相关性。我们的结果表明PrPC对肺疾病具有保护作用，PrPC的缺失使个体易于异常激活致癌通路。然而，这项研究也有一些局限性。短期PM2.5暴露导致老年C57BL/6和PrPC缺陷小鼠的高死亡率，但未在年轻WT小鼠中诱导肺癌或死亡率，表明肺癌的易感性取决于年龄和基因型。未来的研究应延长PM2.5的暴露时间，进行暴露后的监测，并在人类组织或体外模型中验证我们提出的PrPC机制。此外，由于衰老、基因变异或共病导致的PrPC表达或功能降低是否可作为污染相关肺疾病和癌症的易感性的生物标志物仍有待确定。

环境和生态影响
我们的发现突显了暴露于PM2.5对公共健康和生态的显著风险，特别是在老年等脆弱人群中。缺乏PrPC的老年小鼠中肺癌和死亡率的加剧突显了环境压力因素和与年龄相关的保护性分子机制下降的协同效应。这项研究不仅揭示了PrPC作为对抗空气污染引起的肺损伤的生物屏障的潜在作用，还表明其在污染环境中的易感性生物标志物的价值。从公共卫生的角度来看，这些结果加强了更严格的空气质量监测和减少细颗粒物排放政策的必要性，特别是在人口密集和工业区。PM2.5暴露对所有物种的呼吸健康构成威胁，可能通过增加野生动物的疾病负担破坏生态系统平衡。这些见解支持结合环境保护、衰老研究和呼吸健康策略的综合方法，以减轻空气污染的深远影响。