吸入的四级铵化合物的差异性和性别特异性毒性

《Environmental Science & Technology》：Differential and Sex-Specific Toxicity of Aspirated Quaternary Ammonium Compounds

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接触抑制线粒体的季铵化合物（QACs）会增加人类患哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的风险。由于QACs不易穿透肠道或皮肤，我们假设肺部暴露可能是导致人体血液中检测到QACs的原因，并且可能加剧了QACs暴露引发呼吸道疾病的风险。实验中，小鼠通过口咽部吸入方式接触了苯扎氯铵（BAC）和十二烷基二甲基铵氯化物（DDAC）。与口服给药相比，QACs的吸入方式使小鼠的致死率和肺损伤增加了100倍。其中，DDAC造成的致死率和肺损伤更为严重。这两种QACs对雄性小鼠的毒性都比对雌性小鼠更强。能够引起显著肺损伤的QACs吸入剂量在血液中的浓度为1–150 nM，这与人体内的浓度范围重叠。因此，在小鼠体内，吸入的QACs比摄入的QACs更具危害性和致死性；吸入的DDAC的毒性是BAC的两倍；而足以引起肺损伤的吸入剂量在血液中的浓度也与人体内的浓度相当。这些实验结果支持了以下假设：QACs通过呼吸道进入体内的效率远高于通过皮肤或肠道的途径，从而导致更严重的肺损伤；同时，空气中的QACs暴露可能增加人类患肺部疾病的风险。

1. 引言
季铵化合物（QACs）是一类广泛用于工业、机构和家庭清洁中的抗菌剂和消毒剂。通常，作为消毒剂使用的QACs具有亲脂性的烷基尾部，连接在一个带正电荷（阳离子）的氮原子上，该氮原子还与其他四个基团相连（即季铵结构）。虽然QACs的挥发性不高，但它们常被用于喷雾型液体消毒剂中，从而形成气溶胶。QACs也可以以液体形式涂抹在表面，并可能通过灰尘颗粒重新悬浮到空气中。已有研究表明，在医疗环境中，QACs会显著增加护士患哮喘和COPD的风险，且这种风险与剂量呈正相关。

此前认为QACs不太可能进入或滞留在人体内，因为动物实验显示其肠道渗透率低于10%，皮肤渗透率更低。然而最近在人体血液（约40 nM）和母乳（约24 nM）中检测到了QACs，这挑战了这些假设。我们推测，呼吸道暴露可能是血液和母乳中QACs浓度高于预期的原因，并可能增加肺部疾病的风险。因此，我们进行了通过口咽部吸入BAC和DDAC的肺部暴露研究，以模拟实际吸入情况。

季铵化合物苯扎氯铵（BAC）最早于1935年被描述为一种消毒剂，并在20世纪40年代以Roccal品牌作为商用杀菌剂使用。早在1943年就有报道指出，BAC不仅具有抗病毒作用，对小鼠呼吸道还具有高度毒性。QACs会刺激哺乳动物的肺组织，而肺部是QACs的蓄积部位。尽管如此，这些及后续关于QACs毒性的研究并未限制其作为气溶胶消毒剂的使用。相反，2015年FDA禁止了替代消毒剂三氯生和三氯卡班后，QACs的使用量反而增加；此外，COVID-19疫情期间QACs在空气中的浓度也有所上升。苯扎氯铵（BAC）、十二烷基二甲基铵氯化物（DDAC）和西替利啶铵氯化物（CPC）这三种最常用的QACs被美国环保署归类为“高产量化学品”，年产量超过100万磅。

QACs有多种用途和配方，包括除草剂（百草枯）、眼药水消毒剂、鼻喷雾、口腔漱口水消毒剂、干衣纸和织物柔软剂等。实验结果显示，吸入QACs对肺部的伤害和致死性比摄入时高100倍；吸入的DDAC对肺部的伤害和致死性明显高于BAC；并且BAC和DDAC对雄性小鼠的毒性更强。一种可能的解释是，QACs通过呼吸道进入体内的效率远高于通过肠道或皮肤，因此对全身负担的贡献更大。此外，吸入QACs达到足以引起肺损伤的剂量时，其在血液中的浓度与人体内的浓度重叠。这些数据支持了以下观点：QACs通过呼吸道进入人体的途径比通过皮肤或肠道的途径更为有效，从而导致更严重的肺损伤；空气中的QACs暴露可能是人类肺部疾病风险增加的原因。

2. 材料与方法
2.1. 动物
所有动物实验均获得了加州大学戴维斯分校动物护理使用委员会的批准，并符合NIH关于实验室动物护理和使用的指南（识别编号D16-00272，A3433-01）。实验所用C57BL/6J雄性和雌性小鼠购自Jackson实验室，年龄为8周。实验期间每笼子饲养3–4只小鼠。实验开始时记录了小鼠的体重，以便按体重平衡各组。小鼠自由摄取标准饲料（Teklad 2018，Inotivco），并随时提供水源。每组小鼠数量从4只到15只不等，男女比例大致相等。各组的具体数量见相关图表说明。小鼠生活在温度控制在68–75°F（约20–24°C）和湿度控制在30–70%的环境中，遵循12小时光照/黑暗周期，每天进行健康检查和食物供应。

2.2. QACs的口咽部吸入
实验方案参考了Lakatos等人的研究。小鼠在麻醉状态下通过口咽部吸入（OPA）方式接受BAC或DDAC处理。使用VetEquip雾化器将1–2%异氟醚（Fluriso，Vet One）麻醉小鼠。当观察到呼吸频率下降时，将小鼠悬挂在插管架上，轻轻拉出舌头并用手套抓住舌头向前推送以阻断食道通道。使用钝头微量注射器将含有BAC（产品编号12060，C12含量36%，C14含量36%，C16含量1%，Sigma-Aldrich）或DDAC（产品编号34466，Sigma-Aldrich）的生理盐水30 μL注入小鼠咽喉后部。每次吸入过程中轻轻覆盖小鼠鼻子1–2秒以促进吸入，随后将小鼠留在插管架上直至呼吸频率恢复正常、吸入量完全排出且小鼠开始苏醒。小鼠在单独的笼子中恢复后再放回原笼。给药时间以首次出现吸入迹象的时间为准。若未观察到吸入迹象或小鼠在给药过程中过早苏醒（<10秒），则将其排除在研究之外。

2.3. 致死性研究
小鼠通过OPA方式接受逐渐增加剂量的BAC或DDAC处理（范围从0.625 mg/kg），每天至少监测两次，持续48小时。对于呼吸极度困难或濒死的小鼠，采用二氧化碳或戊巴比妥过量给药实施安乐死。若小鼠死亡或被安乐死，则记录为死亡；存活超过48小时的小鼠则记录为存活。

2.4. 组织采集
为了进行组织学研究，小鼠通过OPA方式接受0.45 mg/kg的BAC或DDAC处理。在指定时间点（组织样本为注射后4小时和24小时，血液样本为注射后10分钟和60分钟），使用戊巴比妥过量给药后实施安乐死，并在深度麻醉状态下抽取血液。血液样本收集于锂肝素涂层管中用于QACs定量分析，或收集于标准Eppendorf管中用于血清分析。样本在冰上冷却后以7500 rpm离心5分钟（4°C）。通过气管插入导管取出肺部组织，用于固定或进行支气管肺泡灌洗（详见下文）。同时取出肝脏、肾脏和脾脏，用磷酸盐缓冲液清洗后迅速冷冻在液氮中。组织在干冰上用研钵研磨，充分混合后分装用于RNA提取。

2.5. 血浆提取及QACs的LC-MS/MS分析
将10 μL血浆与含有氘标记内标物（d7-BAC C12和C14，浓度分别为0.3 pmol）的乙腈（30 μL）混合，涡旋2分钟后置于冰上冷却15分钟以促进蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质通过16,000 g、4°C条件离心15分钟进行分离。上清液（20 μL）转移至含有40 μL水：甲醇（1:1）的玻璃LC小瓶中。LC小瓶加盖后短暂涡旋混合。使用Waters SYNAPT XS四极杆飞行时间（QToF）质谱仪（Waters Corporation，Milford, MA）结合Waters ACQUITY UPLC系统，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定DDAC（C10:C10）和BACs（C12和C14）的浓度。样品提取液（或标准曲线）的15 μL量注入Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 × 2.1 mm2，1.9 μm颗粒），在室温下以0.400 mL/min流速运行。流动相A为含0.1%甲酸和2 mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。流动相梯度在14分钟内从15% B线性增加到85% B，随后保持100% B 3分钟，再回到15% B以平衡色谱柱。C12-BAC、C14-BAC和DDAC的LC保留时间分别为10.24分钟、11.92分钟和12.77分钟。分析采用电喷雾正离子模式（ESI+），设置如下：毛细管电压2.5 kV，采样锥30 V，源温度150°C，脱溶剂温度500°C，脱溶剂气体流量50 L/h，雾化气体流量1000 L/h。质量校正前使用钠甲酸根离子进行质量校准；运行过程中注入亮氨酸脑啡肽锁定质量（[MH+] = 556.2771 m/z）以获取质量校正参考值。串联质谱（MS/MS）通过四极杆分离前体离子，在转移细胞中诱导碎片化，并在飞行时间质谱仪中检测碎片离子。

2.6. 肺部固定
通过气管插入22 g灌胃导管并取出肺部后，将导管连接到压力计底部的旋塞上。用4%甲醛以28 cm恒定压力对肺部进行1小时灌注。固定后的肺部嵌入石蜡块中，由UC Davis比较病理学实验室切片并进行H&E染色。

2.7. 支气管肺泡灌洗
通过气管插入22 g灌胃导管，取出肺部。按照先前方法使用1 mL（雄性）或0.8 mL（雌性）无菌磷酸盐缓冲液对肺部进行灌洗，重复三次。收集的支气管肺泡灌洗液（BALF）保存在冰上待进一步处理。灌洗后肺部迅速冷冻并储存在-80°C。

2.8. BALF处理
BALF在4°C下以2000 rpm离心10分钟，去除上清液后分装并迅速冷冻。细胞沉淀物被重新悬浮在0.3–1.0毫升的无菌Dulbecco’s PBS中，然后使用血细胞计数器或Cell Count and Viability Kit（Guava Muse）来计算细胞总数和非活性细胞的百分比。从重新悬浮的BALF细胞中制备Cytospin切片，用于标准差异染色（Diff Quik）和量化炎症细胞占总细胞数的百分比。按照试剂盒说明，使用microBCA kit（ThermoFisher）测量蛋白质水平。

2.9 RNA分离和定量实时PCR
根据试剂盒说明，使用RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen）从全肺匀浆中提取RNA。使用Invitrogen的SuperScript III First Strand Synthesis System kit合成cDNA。在QuantStudio 7 Pro实时PCR系统（Thermo Fisher）上使用PowerUp Sybr Green Master Mix进行定量RT-PCR。引物序列见表S1。数据通过delta–delta CT计算进行分析，以性别匹配的空白对照组作为参照。使用核糖体蛋白18S作为参考基因。

2.10 统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 10版本（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）进行。数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。对于分类测量（生存/致死性显著性），根据情况使用卡方检验或Fisher精确检验进行组间比较。对于连续测量，使用单因素ANOVA或多因素ANOVA以及Tukey的事后检验来评估时间和处理和/或性别的总体主效应及其交互作用。当多因素ANOVA中没有性别差异的证据时，我们将性别作为协变量纳入模型。在统计推断测试之前，使用QQ图和残差图验证正态性和同方差性假设。使用GraphPad Prism的Grubb’s Outlier Test识别异常值。统计显著性在双侧p < 0.05时确定。

3. 结果和讨论
3.1 当通过OPA给药到肺部时，BAC和DDAC的毒性是口服给药的100倍
为了确定QACs的肺部毒性，我们对小鼠进行了BAC或DDAC通过OPA给药的体内毒性研究。通过OPA给药时，BAC的中位致死剂量（LD50）估计为1.94 mg/kg（图1A）。同样，通过OPA给药的DDAC的LD50估计为1.49 mg/kg（图1A）。测量的OPA致死性数据与口服给药的已发表数据进行了比较（图1A（21,22））。这些数据显示，当通过OPA给药到肺部时，BAC和DDAC的毒性比口服给药时高100倍以上（LD50 < 2 mg/kg vs LD50 > 200 mg/kg（21,22）（图1A）。

3.2 OPA给药的DDAC比BAC毒性显著更强
通过Miller–Tainter方法计算出BAC和DDAC的个体LD50（分别为1.94 mg/kg和1.49 mg/kg）（图S1A，表S1B），然后我们检查了1.875 mg/kg单剂量的死亡情况。在这个剂量下，合并性别后，DDAC导致的死亡数量显著多于BAC（p < 0.001）（图1C）。因此，当通过OPA给药到肺部时，DDAC的毒性比BAC更强。

3.3 OPA给药的QAC对雄性小鼠的毒性比对雌性小鼠更强
从BAC和DDAC的剂量依赖性生存曲线（图1B）可以看出，雄性小鼠在两种QAC的较低浓度下就死亡了。这表现为雄性的LD50中位数（BAC为1.2 mg/kg，DDAC为1.8 mg/kg）低于雌性（BAC为2.2 mg/kg，DDAC为1.8 mg/kg），雄性对OPA给药的QAC的致死性几乎是雌性的两倍（图1B）。为了研究QAC毒性的性别特异性，我们不分QAC类型，按性别分析了单剂量（1.875 mg/kg）实验（图1D）；结果显示雄性的死亡数量显著多于雌性（p < 0.05）。对于BAC给药的小鼠，100%的雌性存活，而雄性只有17%存活（p < 0.05，约6倍差异）。同样，43%的DDAC给药雌性存活，而DDAC给药的雄性全部死亡（p = 0.0769）。综合这些数据表明，吸入的DDAC比BAC毒性更强，且雌性对BAC和DDAC诱导的致死性有更强的抵抗力。

3.4 在雌性中，BAC从肺部进入血液的速度明显快于雄性，而DDAC进入血液的程度低于BAC
在OPA给药后10分钟和60分钟时，测量了小鼠血液中的QAC浓度（0.45 mg/kg，滴液中约含30 nmol QAC）。从给药后10分钟到60分钟，血液中的BAC（图2A）和DDAC（图2B）水平显著下降了几倍，这与吸入后血液中QAC的快速清除一致。

3.5 吸入的DDAC引起的损伤比BAC更严重
我们通过分析OPA给药后约1 LD50（约0.45 mg/kg）的BAC或DDAC引起的炎症反应来研究其毒性。我们在QAC给药后4小时和24小时评估了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白质水平（图3A）和细胞浸润计数（图3B）。在4小时时，我们观察到DDAC给药小鼠的BALF蛋白质水平和细胞浸润显著增加（图3A和图3B），而BAC给药小鼠没有显著差异。此外，4小时时DDAC给药小鼠的蛋白质和细胞浸润显著多于BAC给药小鼠。这些数据支持DDAC比BAC对肺部造成的损伤更严重的观点，并且这种增加的损伤可能是吸入的DDAC比BAC具有更高致死性的原因。

3.6 24小时时DDAC的损伤标志物显著低于4小时
尽管在合并性别时，雄性和雌性小鼠的DDAC血液浓度没有显著差异（图2D），但当按性别分开时，雌性在肺部暴露后10分钟的BAC平均血液水平（约150 nM）显著高于DDAC（约50 nM），这支持了DDAC从肺部进入血液的速度比BAC慢是DDAC比BAC造成更大肺部损伤和致死性的一个潜在原因的假设（图S6）。因此，至少在雌性中，DDAC从肺部进入血液的速度较慢可以解释吸入的DDAC比BAC具有更高的毒性。

3.7 吸入的DDAC引起的损伤更严重
我们通过分析OPA给药后约1 LD50（约0.45 mg/kg）的BAC或DDAC引起的炎症反应来研究其毒性。我们在QAC给药后4小时和24小时评估了BALF的变化。在4小时时，我们观察到DDAC给药小鼠的BALF蛋白质水平（图3A）和细胞浸润（图3B）显著增加，而BAC给药小鼠没有显著差异。此外，4小时时DDAC给药小鼠的蛋白质和细胞浸润显著多于BAC给药小鼠。这些数据支持DDAC比BAC对肺部造成的损伤更严重的观点，并且这种增加的损伤可能是吸入的DDAC比BAC具有更高致死性的原因。

3.8 DDAC引发的炎症细胞因子基因表达显著高于BAC
吸入的DDAC在OPA给药后4小时引发了比BAC更高的炎症细胞因子基因表达，包括白细胞介素1β（Il1β）（图5A）和白细胞介素6（Il6）（图5B）。虽然Ccl2/Mcp1（C–C基序趋化因子配体2，也称为单核细胞趋化蛋白1）在DDAC中的趋势高于BAC，但这种增加没有统计学意义（图5C）。这些数据支持DDAC比BAC更具伤害性的观点。

3.9BAC和DDAC在女性中引起的肺部损伤比男性不明显，而在24小时后，DDAC引起的肺泡塌陷和水肿比BAC更明显。一组小鼠被注射了约0.45 mg/kg的BAC或DDAC，24小时后收集肺部组织进行组织病理学分析。切片经过苏木精和伊红（H&E）染色，并从每个样本中收集了多张图像。图6中的图像代表一个肺泡腔的图像（图6A、C、E、G、I、K），其中一个图像显示了部分支气管上皮（图6B、D、F、G、L）。未给药的小鼠显示出清晰的肺泡间距和极少的浸润（图6A–D），而BAC给药的小鼠在肺泡空间中显示出细胞浸润和水肿的迹象（图6E–H）。DDAC给药的雄性小鼠比BAC给药的小鼠有更多的水肿和浸润（红色箭头，图6I、J），而雌性小鼠仅显示出轻微的水肿/浸润迹象（图6L）。无论是雄性还是雌性小鼠，DDAC给药都出现了支气管上皮损伤（*，图6J、L），但BAC给药的小鼠没有这种情况。因此，在相同的QAC剂量下，雌性小鼠的肺部损伤较轻。就DDAC与BAC的毒性差异而言，DDAC暴露的小鼠表现出更明显的肺泡塌陷和水肿（图6E–L）。

**图6**：0.45 mg/kg QAC给药后24小时的肺部组织病理学分析。BAC和DDAC给药的小鼠都显示出炎症加剧的迹象（A vs E 和 I）。DDAC给药的雄性小鼠表现出严重的水肿和浸润（J）。BAC给药的雌性小鼠表现出许多水肿迹象（G、H）。箭头指向BAC和DDAC暴露的小鼠肺泡中的水肿和细胞浸润区域。在DDAC暴露的小鼠中观察到支气管上皮损伤（*，图6J、L）。

**高分辨率图像**：下载MS PowerPoint幻灯片3.10。**BAC和DDAC在吸入时对小鼠的致死性和肺损伤是口服的100倍**。我们在这里发现，通过OPA将BAC和DDAC吸入C57BL/6J小鼠体内，其LD50约为2 mg/kg，远低于BAC在BALB/C小鼠中的241 mg/kg LD50（图1）。此外，尽管Sekijima等人在2023年发现口服BAC在250 mg/kg剂量下会导致急性肺损伤（25），但我们发现吸入BAC和DDAC在低至0.45 mg/kg的剂量下也会导致显著的肺损伤。因此，吸入QAC的致死性和肺损伤是口服的100倍。吸入QAC与口服QAC导致肺损伤和致死性增加的潜在原因尚不清楚，但可能至少涉及三个因素：（1）QAC通过呼吸道进入体内的总负荷/渗透性更高；（2）QAC在肺部和其他储存组织中的滞留；（3）QAC以类似箭毒碱的方式导致肺部麻痹（26）。

**3.11. 吸入与口服QAC致死性和损伤增加100倍的三个潜在原因**
（1）更好的渗透性和全身负荷。Xue等人在研究通过喂食管给予BAC时发现，吸入BAC的小鼠在24小时后的血液、肺、肝脏和肾脏中的BAC水平比未吸入BAC的小鼠高约10倍（16）。因此，通过呼吸道给药比通过肠道给药导致这四种组织中的BAC水平高出10倍，支持了呼吸道给药效率更高、全身负荷更大的观点。
（2）QAC在肺部和其他储存组织中的滞留。Xue等人还发现，未吸入BAC的小鼠在24小时后，肺和肾脏中的BAC水平达到最高，约为1.5 μM，而血液中的BAC水平约为0.15 μM（16）。因此，BAC在肺部和肾脏中滞留24小时，血液中的BAC水平低估了肺部的BAC水平约10倍。如果这些结果适用于人类，那么人体血液中约20 nM的QAC总量相当于肺部约200 nM的QAC。
（3）类似箭毒碱的肺部麻痹机制可能不如线粒体抑制机制具有生理相关性，因为这两种机制发生的QAC浓度不同。乙酰胆碱在其化学结构中是一种QAC，但其疏水尾部比用作消毒剂的QAC短得多。早期关于QAC毒性的假设是QAC可能与乙酰胆碱在胆碱能受体上竞争，从而抑制神经传导（26）。虽然BAC和DDAC确实与乙酰胆碱竞争，但这发生在非常高的浓度下，即IC50为0.5–1 mM（29）。我们之前已经证明BAC和DDAC是剂量依赖性的线粒体抑制剂，这种抑制作用发生在100 nM到10 μM的范围内（30,31），远低于QAC抑制乙酰胆碱酯酶的浓度（30,31）。因此，我们认为线粒体抑制是QAC更可能的肺毒性机制，因为它发生的浓度低于乙酰胆碱酯酶抑制的浓度。此外，用作消毒剂的QAC具有长疏水尾部，属于亲脂性阳离子的一般结构，倾向于在 mitochondria 中积聚（32）。其他人已经证明QAC的消毒活性通过抗OXPHOS和“皂样”机制发挥作用。他们发现抗OXPHOS消毒机制的EC50约为5 μM，而QAC的皂样机制的EC50约为50 μM（33）。因此，QAC最有效的抗菌机制及其肺毒性机制可能是相同的——抗OXPHOS。

**3.12. 吸入相同剂量的DDAC对小鼠的损伤和致死性显著高于吸入的BAC**
在相同剂量下，DDAC的致死性是BAC的两倍（图1C），并且通过BALF蛋白和细胞浸润（图3A、B）、巨噬细胞和中性粒细胞浸润（图4A、B）以及炎症细胞因子表达（图5A、B）测得的肺损伤也是BAC的两倍。这些结果表明吸入的DDAC对小鼠的损伤和致死性更大。我们推测DDAC更高的吸入毒性可能是由于（1）DDAC本身的毒性更强，或者（2）DDAC从肺部排出的速度较慢。未来的研究可以明确不同呼吸道QAC毒性的产品使用和安全影响。吸入的DDAC对小鼠的损伤和致死性明显高于BAC，但尚不清楚这是否也适用于人类。

**3.13. 雌性小鼠对吸入QAC的潜在保护机制**
雌性小鼠相对于雄性小鼠对吸入的BAC具有相对保护作用，这可能是由于BAC从肺部到血液的排出速度更快以及代谢作用（图2），但这无法解释雄性小鼠对DDAC的敏感性，因为两者在肺部向血液的排出速度没有差异。从数据推断，雌性小鼠可能比雄性小鼠更快地将BAC从肺部转移到血液中（图2D）。其他研究也表明雌性小鼠比雄性小鼠更快地将液体从肺部转移到血液中，而卵巢切除术会逆转这一特性（18）。人类女性也将液体从肺部转移到血液中的速度更快（27,28）。因此，我们在雄性小鼠中观察到的BAC从肺部到血液的清除速度较慢可能是它们因BAC死亡风险较高的原因（图1E）。

**3.14. 造成肺损伤的吸入BAC和DDAC剂量会导致人类血液中的QAC水平**
我们在OPA给药后10分钟和60分钟测量了小鼠血液中的QAC浓度，剂量为1 LD50（约0.45 mg/kg）的BAC或DDAC。在这些剂量下，小鼠出现了显著的肺损伤（图3A、C和6）。吸入10分钟后，我们观察到小鼠血液中的BAC浓度为14–213 nM，DDAC浓度为11–84 nM（图2）。我们将这些值与我们之前论文中测量的人类血液水平进行了比较；在43名受试者中，约有一半的人血液中的总QAC水平在1到40 nM之间；血液中QAC水平较高的人与淋巴细胞线粒体活性较低有关（8）。类似地，另一项关于血液中QAC的研究发现超过一半的受试者的QAC水平在1到10 nM之间（12）。因此，导致小鼠肺损伤的QAC暴露水平与人类血液中的QAC水平重叠（6,12），这引发了人们对人类健康的担忧。由于血液中的QAC水平会随时间迅速下降（约50分钟内下降5倍，图2），且两项人类研究中的初次暴露时间未知，人类血液中的QAC水平可能更高。此外，如果大鼠的结果适用于人类，并且血液中的QAC水平低估了肺部的QAC水平约10倍（16），那么人类血液中的QAC水平可能接近200 nM，我们在其他研究中已经证明这一浓度足以抑制线粒体活性（未发表）。吸收途径、时间和代谢的差异可能限制了直接比较的可能性，并为进一步研究慢性QAC暴露提供了依据。我们注意到我们的研究是急性吸入暴露，而人类暴露可能是慢性的，并且可能通过多种途径发生。

**3.15. QAC暴露剂量依赖性地增加人类患肺病的风险**
Gonzalez等人发现，BAC暴露显著增加了护士患哮喘（风险比7.5倍）和鼻部症状（风险比3.2）的风险，尤其是那些参与手动混合和稀释BAC的护士（4）。另一项研究显示，接触BAC的护士患COPD的风险高于未接触BAC的护士（调整后的风险比为1.33）（3）。这项研究还观察到与消毒剂使用频率相关的COPD风险剂量依赖性增加。在第三项研究中，患有职业性哮喘的BAC暴露工人表现出更高的支气管高反应性和更高的痰液嗜酸性粒细胞计数，而其他低分子量物质引起的职业性哮喘则没有这种情况（5）。高痰液嗜酸性粒细胞计数表明人类气道炎症增加，这与我们在小鼠中的结果相似，即QAC暴露的小鼠表现出肺细胞因子和中性粒细胞炎症增加（图4和5）。此外，包括DDAC在内的消毒剂在加湿器中的吸入暴露导致儿童出现致命的间质性肺病（24）。因此，有充分证据表明吸入QAC会增加人类患呼吸道疾病的风险。

**3.16. 启示**
在小鼠中，我们观察到吸入的BAC和DDAC对肺部的损伤和致死性是口服的100倍；这可能是由于这些QAC通过呼吸道进入体内的渗透性高于通过肠道，导致全身负荷和肺部滞留及损伤增加。我们认为肺毒性的潜在机制更可能是线粒体抑制而非乙酰胆碱酯酶抑制（29?31）。由于吸入的DDAC对小鼠的损伤和致死性是BAC的两倍，我们推测吸入的DDAC对人类的风险可能更大。我们观察到吸入的BAC和DDAC对女性的毒性低于男性，部分差异可能是由于BAC从肺部到血液的排出速度不同。通过呼吸道以导致小鼠肺损伤的剂量引入的QAC在血液中的水平为1–100 nM，与人类血液中的1–50 nM水平重叠，这引发了使用QAC作为消毒剂的气溶胶的安全性问题。这些小鼠的结果表明，呼吸道暴露可能是人类血液和母乳中观察到的1–50 nM总QAC浓度的原因（2,8,9），因为呼吸道暴露的可能性大于口服或皮肤暴露。鉴于呼吸道暴露导致的肺损伤是口服的约500倍，这表明呼吸道暴露可能是人类患哮喘和COPD风险增加的原因。