《Frontiers in Microbiology》：Assessing the individual and combined effects of ZnO nanoparticles and glyphosate on the gut microbiota of tadpoles
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本研究针对淡水环境中氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）与草甘膦（glyphosate）复合污染日益严重、其对两栖动物肠道菌群的影响机制尚不明确的现状，以东北林蛙（Rana dybowskii）蝌蚪为模型，通过单一及联合暴露实验，结合16S rRNA基因测序、微生物失调指数（MDI）、群落组装模型和功能预测分析，系统评估了两种污染物对肠道菌群的个体与协同效应。结果表明，ZnO NPs和草甘膏单独及联合暴露均能显著改变肠道菌群的α和β多样性，升高MDI，导致以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）为主的优势菌群丰度发生显著偏移，并预测到代谢、免疫及疾病相关通路功能受到干扰。该研究揭示了污染物通过确定性过程主导菌群重组，从而可能增加宿主对疾病的易感性，为评估纳米材料与农药复合污染的生态风险及两栖动物保护提供了关键的微生物学依据。
在全球两栖动物种群面临栖息地破坏、气候变化、污染和疾病等多重威胁而加速衰退的背景下，它们的生存状况拉响了生态警报。作为一种对环境变化极为敏感的“哨兵”物种，两栖动物的健康是生态系统稳定的重要指标。然而，现代工农业活动在推动发展的同时，也将两大类新型污染物大量带入水体：一类是广泛应用于日化、电子等领域的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs），其年产量可达十万吨；另一类则是世界上使用最广泛的除草剂——草甘膦，年产量超过百万吨。这两者通过农业径流、工业废水等途径进入淡水环境，形成了复杂的复合污染局面。尽管已有研究分别关注了它们对水生生物的毒性，但它们如何“联手”影响两栖动物体内一个至关重要的“隐形器官”——肠道菌群，却仍然是一个未被充分探索的科学谜题。肠道菌群被称为动物的“第二大脑”，在宿主的营养代谢、免疫防御和环境胁迫抵抗中扮演着核心角色。对于正处于发育关键期的蝌蚪而言，健康的肠道菌群更是其顺利变态和健康成长的基础。那么，ZnO NPs和草甘膦的单独及“混合双打”，会如何扰动蝌蚪肠道内这个微小的生态系统？这种扰动又是否会削弱蝌蚪的健康，进而影响整个种群的存续？为了回答这些问题，一组研究人员在《Frontiers in Microbiology》上发表了一项聚焦于东北林蛙（Rana dybowskii）蝌蚪的深入研究。
为开展研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，以采自中国黑龙江省萝北县的东北林蛙蝌蚪（Gosner 20期）为研究对象，设计了对照组（C）、草甘膦暴露组（G，10 mg/L）、ZnO NPs暴露组（Z，10 mg/L）以及两者联合暴露组（ZG）进行为期28天的实验。其次，在暴露结束后，采集蝌蚪肠道内容物样本，使用试剂盒提取微生物总DNA。接着，通过PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4可变区，并在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序，以获得肠道菌群的组成信息。最后，利用mothur、QIIME、R语言等生物信息学软件包对测序数据进行处理，系统分析了菌群的α多样性（如Chao、Shannon指数）、β多样性（基于Bray-Curtis和加权UniFrac距离）、微生物失调指数（MDI），并应用中性群落模型（NCM）、β-近缘分类单元指数（βNTI）等模型解析群落组装过程，同时通过PICRUSt2和BugBase工具预测了菌群的功能潜能和表型特征。
研究结果
3.1 ZnO NPs的表征
动态光散射（DLS）显示，所用ZnO NPs的水合粒径为112.7 ± 2.2 nm，呈单峰分布。透射电镜（TEM）图像表明，纳米颗粒为不规则聚集体，高分辨图像可见清晰的晶格条纹，确认了其纳米晶体结构。
3.2 肠道菌群失调指数、α多样性和共享菌群
测序共获得2,332,005条高质量序列，聚类为894个操作分类单元（OTU）。与对照组相比，所有暴露组（G、Z、ZG）的微生物失调指数（MDI）均显著升高，其中Z组（仅ZnO NPs）的MDI最高，表明ZnO NPs对菌群平衡的破坏力最强。α多样性分析（Chao、Shannon、Sobs指数）也显示，各处理组与对照组之间存在显著差异。韦恩图分析揭示，四个处理组共享141个OTU，但各组也拥有大量独特的OTU，表明暴露改变了菌群的核心组成与特有成员。
3.3 β多样性及基于NCM的菌群生态组装
基于Bray-Curtis和加权UniFrac距离的非度量多维标度（NMDS）分析表明，对照组、G组、Z组和ZG组的肠道菌群结构存在显著差异。其中，Z组与其他组的距离最远，说明ZnO NPs对菌群结构的改变最为剧烈；G组与ZG组较为接近。中性群落模型（NCM）拟合度（R2= 0.305）较低，表明菌群组装并非完全随机，确定性过程（如环境选择）在其中发挥了重要作用。
3.4 菌群组装过程和肠型分析
通过零模型（βNTI, RCBray）和iCAMP分析进一步量化了生态过程。结果显示，在污染物暴露下，菌群组装过程以确定性过程（如均匀性选择）为主，但随机性过程（如扩散限制、漂变）在不同组别中也占有相当比例，说明污染物胁迫显著改变了菌群构建的生态规则。肠型分析表明，对照组菌群以真杆菌（Eubacterium）型为主，而各暴露组则分别转向了如嗜糖菌（Robinsoniella）、军团菌（Legionella）或金黄杆菌（Aurantimicrobium）等不同的肠型，揭示了暴露导致菌群功能状态的根本性转变。
3.5 肠道菌群的组成、变化及指示类群
在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）是优势菌门，其相对丰度在各处理组间发生显著偏移。线性判别分析（LEfSe）发现，G组显著富集了厚壁菌门和肠球菌属（Enterococcus）；Z组显著富集了变形菌门、无色杆菌属（Achromobacter）和军团菌属（Legionella）；ZG组则显著富集了放线菌门、肉杆菌属（Carnobacterium）和微杆菌属（Microbacterium）。指示物种分析（IndVal）进一步鉴定出41个与特定处理组显著相关的指示类群，包括一些与健康相关的细菌（如乳酸杆菌 Lactobacillus kefiranofaciens）和潜在的致病相关类群。
3.6 BugBase和KEGG分析
BugBase表型预测显示，暴露组菌群在多种表型上与对照组存在显著差异，包括好氧/厌氧、应激耐受、潜在致病性、生物膜形成和革兰氏阳性/阴性等，表明污染物胁迫增强了菌群的应激适应能力和潜在的致病风险。KEGG通路预测分析发现，暴露显著影响了43条代谢通路，主要集中在免疫系统、代谢（如脂质、氨基酸、碳水化合物代谢）以及细胞过程（如复制修复、信号转导）等相关通路，提示污染物可能通过干扰菌群功能而影响宿主的生理健康。
结论与讨论
本研究综合运用多样性指数、失调指数和群落组装模型，清晰地表明ZnO NPs和草甘膦的单独及联合暴露，能够将东北林蛙蝌蚪的肠道菌群推向一个替代性的功能状态。研究得出的核心结论是：这两种环境污染物能显著破坏蝌蚪肠道菌群的组成与多样性，导致微生物失衡，并通过确定性过程主导菌群重组。这种失衡不仅体现在群落结构上，更延伸至功能层面，预测到宿主的代谢、免疫等关键通路受到干扰，从而可能增加蝌蚪对疾病的易感性，削弱其生理健康。
其重要意义在于：首先，该研究首次系统评估了ZnO NPs与草甘膦对两栖动物肠道菌群的个体与联合效应，填补了该领域的研究空白。其次，研究揭示了污染物通过扰动肠道微生态这一间接途径威胁宿主健康的新机制，为理解复合污染的生态毒理效应提供了新视角。再者，研究所识别的微生物失调指数变化、特定的指示类群（如军团菌属、肉杆菌属的富集）以及受干扰的功能通路，可作为评估两栖动物健康风险潜在的微生物生物标志物和机制靶点。最后，在环境污染日益严峻的当下，该研究为科学评估纳米材料与农药的生态风险、制定更有效的两栖动物保护策略及环境管理政策，提供了至关重要的科学依据。它警示我们，看不见的微观菌群扰动，可能预示着宏观生态系统健康的深远危机。
