将纳米气泡技术与丛枝菌根真菌相结合，可以提升棉铃虫-寄主植物系统中的宿主植物和植食昆虫双方的性状

《Journal of Sustainable Agriculture and Environment》：Integration of Nanobubble Technology With Arbuscular Mycorrhizal Fungi Enhances Both Host and Herbivore Traits in Cotton-Tarnished Plant Bug System

　　摘要

纳米气泡（NB）技术产生的水中含有微小的充气球体，这些球体在提高灌溉水中的溶解氧（DO）水平方面非常有效。尽管对纳米气泡在环境科学和农业领域的多种应用越来越感兴趣，但很少有研究对这些应用进行了实证测试。丛枝菌根真菌（AMF）是一类有益的微生物共生体，它们通过促进根系生长和增加养分吸收来改善植物生长发育。由于低溶解氧会阻碍微生物将氨和硝酸盐转化，导致灌溉水中毒素积累并损害植物根系，因此将纳米气泡与AMF结合使用可能有助于改善植物性状。为了验证这一点，我们研究了在不同浓度和组合下应用纳米气泡水和AMF对棉花植株及其与昆虫食草动物相互作用的影响。研究结果表明，纳米气泡和AMF对植物整体健康有积极影响。我们还发现，在处理过的植株上饲养的昆虫食草动物的存活率高于对照组，这表明存在某种权衡。AMF和纳米气泡的处理组合可以促进植物生长，并有可能被纳入可持续农业策略中。

1 引言

纳米气泡是直径为50-200纳米的微小气泡或“超细气泡”，通常带有负电荷。因此，这些气泡不会凝聚，而是保持分离状态，并在溶液中具有长期稳定性（Alheshibri等人，2021年）。纳米气泡具有多种物理化学性质，如增强吸附能力、疏水性、活性氧（ROS）生成和气体-液体质量转移（Marcelino等人，2023年），使其适用于农业和水资源管理的多种应用。它们的稳定性和较大的气-液界面使其由于浮力小且抗凝聚性强而能够在液体中悬浮较长时间（Napte和Biradar，2024年）。总体而言，纳米气泡提高了液体中的气体溶解度，从而提高了氧气和臭氧的输送效率。根际中的最佳溶解氧水平对有益土壤微生物至关重要。氧气不足会损害微生物活性并导致植物压力（Mamun和Islam，2025年），而纳米气泡可以增强氧气向植物根系的输送，促进养分吸收和健康根系生长，从而加速植物营养生长，提高植物的抗逆性、健康状况和产量（Yemelyanov等人，2023年）。使用纳米气泡水增强有益根区微生物群落还有助于减少根区中引起植物疾病的病原体，如镰刀菌、疫霉菌、轮枝菌和立枯丝核菌（Zhou等人，2020年；Wang和Wang，2023年）。纳米气泡的特点，如小直径、稳定性、负表面电荷、较大的界面表面积、高气体传输能力和滞留时间，使其非常适合用于水培和无土栽培系统。研究表明，纳米气泡的标准氧气传输效率（SOTE）为85%，这是衡量曝气系统将氧气从气体输送到液体中的效率的指标（Wang和Wang，2023年）。纳米气泡技术主要用于温室和有机农场，最近的研究表明这项技术可以提高蓝莓和酿酒葡萄作物的产量（Moleaer.com）。然而，这项技术是否会影响不同农业作物的害虫存活和发育以及微生物、植物和食草动物之间的多种营养相互作用尚不清楚。有益的土壤微生物在植物生长和发育中起着重要作用，植物与土壤中的多种共生微生物相互作用（George等人，2024年）。丛枝菌根真菌（AMF）定殖在植物根系中，可以通过提供额外的磷（P）、氮（N）和锌（Zn）来提高宿主植物的适应性。AMF与植物根系建立共生关系，进入细胞而不造成伤害，并形成丛枝和胞囊等结构。Verbruggen和Toby Kiers（2010年）报告称，大多数农作物根系被多种功能的AMF群落定殖（例如，养分转移、病原体保护、水分吸收）。AMF对植物生理的影响中最重要的是在养分贫瘠的土壤中提高植物从天然来源吸收养分的效率（George等人，1995年）。AMF通过促进养分吸收、改善土壤健康和增强植物对环境压力的抵抗力来推动可持续农业（Kaur等人，2020年；Soti等人，2023年）。据报道，小麦、水稻、玉米、土豆、番茄、洋葱、豆类、棉花和大豆等农作物都与AMF形成了共生关系。一些驯化的AMF在全球范围内可用，它们作为基于菌根的接种剂在农业领域的应用正在增加。如Rhizophagus intraradices这样的AMF与植物根系相互作用，促进共生关系。这些AMF有时对植物有益，有时可能具有潜在的危害性，但它们有助于促进健康的植物群落（Wahab等人，2023年），值得进一步研究。AMF还可以提高植物的耐旱性并预防某些真菌病原体（Tang等人，2022年；Onyeaka等人，2024年）。这些AMF影响害虫生物学并触发植物防御反应的机制尚未完全了解。总体而言，与纳米气泡类似，AMF也可能成为改善植物根系健康和提升植物 overall 生长及作物产量的重要工具。由于纳米气泡可以提高根际中的溶解氧，从而可能增强菌根真菌（尤其是AMF）的养分吸收，因此可以预期将它们结合使用可以显著改善农艺性状。目前发表的研究主要探讨了菌根真菌或纳米气泡在受控环境农业系统中的单独效果。据我们所知，尚无研究报道纳米气泡和AMF的组合如何影响植物营养、根系健康、作物生产和害虫管理，尤其是在棉花和大豆等行作物中。为了解决这一问题，我们研究了在温室条件下向棉花植株施用含氧水和AMF后对植物生长的影响。通过测量多个生长参数来评估处理效果：发芽率、真正叶片出现时间、茎和根的长度以及根和茎的干重。随后，还评估了主要棉花害虫Lygus lineolaris（半翅目：Miridae）的存活率，以考察这些处理是否会影响寄生虫-宿主相互作用。

2 材料与方法

2.1 纳米气泡的制备

实验使用了一种基于扩散的纳米气泡发生器，该发生器配备了曝气技术，专门设计用于产生直径在80至200纳米之间的气泡，每毫升水中的气泡浓度超过十亿个，标准氧气传输效率（SOTE）为85%（Moleaer Neo，加利福尼亚州洛杉矶）。这种纳米气泡发生器内置氧气发生器，可以现场生成直径为100纳米的气泡。Moleaer Neo型号适用于温室研究和田间研究，以改善水质、增强植物养分吸收、促进有益细菌的生长并抑制病原体。在密西西比州Stoneville的USDA-ARS设施进行的温室研究中，使用了浓度为15 ppm（NB-15）和30 ppm（NB-30）的纳米气泡水，以评估其对棉花植株的影响。纳米气泡水是通过将自来水从200加仑的储罐中循环通过Moleaer纳米气泡发生器机器，经过预定次数的循环后达到15 ppm或30 ppm的处理浓度。30 ppm的纳米气泡比15 ppm的具有更高的溶解氧含量，因为它们经历了更多的氧气富集循环。使用15 ppm和30 ppm浓度的纳米气泡来了解不同溶解氧水平对植物生长特性和植物-昆虫相互作用的影响。从播种开始，每隔一天向盆栽棉花植株（品种Bollgard II?）施用500毫升15 ppm或30 ppm浓度的纳米气泡水，有时会添加15克的AMF，有时不添加。对照组植物仅接受500毫升的自来水。在整个植物生长过程中，我们测量了多个参数：发芽率、植物生长、根系形态（长度和重量）、棉花结铃数量以及昆虫的存活和发育情况。

2.2 AMF的应用

实验使用了一种含有Rhizophagus intraradices（300个繁殖体/克）的商业AMF产品，该产品来自美国罗德岛州Greene的Wallace Organic Wonder公司。据报道，这种土壤接种剂可以改善植物健康和土壤质量，为农业和园艺作物提供生态效益（Onyeaka等人，2024年；Rehman和Farooq，2020年）（https://www.moleaer.com/blog/horticulture/high-plant-yields-oxygen-uptake-by-roots-is-critical-forplantrespiration；https://www.moleaer.com/blog/horticulture/root-respiration）。AMF颗粒在播种时被加入植物根际，施用量为每株植物15克（Wallace Organic Wonder推荐的接种量），可以单独使用或与纳米气泡水结合使用。

2.3 植物生长测量

使用Bollgard II（DP1646，Delta and Pine Land Company，美国密西西比州Scott）种子，种植在含有1:2比例育苗土和表土的盆栽混合土中（Miracle-Gro，The Scotts Miracle-Gro Company，美国俄亥俄州Marysville）。在任何生长阶段均未对实验植物施用杀虫剂。根据所使用的纳米气泡浓度和AMF施用量，共有六种处理方案：纳米气泡-15 ppm（NB-15）、纳米气泡-30 ppm（NB-30）、AMF 15克（AMF-15）、NB-15×AMF 15、NB-30×AMF-15和对照组。每种处理包含三组各10株植物，共计30株植物（N=30）。植物在受控条件下生长（温度30±2°C，相对湿度75%，光照12小时/天）。每株植物每周三天各浇500毫升水。在棉花的不同生长阶段进行了植物生长测量，包括播种后4天（DAP）、真正叶片数量（15 DAP）、植物高度（36 DAG）、结铃数量（36 DAG）以及根、茎和整个植物的干重。根系在主根尖端以上7.5厘米处修剪，用自来水彻底冲洗以去除土壤，然后放入标记好的棕色纸袋中。测量不同处理组之间的根长和植物高度。茎和叶子分别放入不同的纸袋中，在70°C的热风干燥箱中干燥20小时。干燥后称量根和茎的干重。

2.4 处理过的植物上Tarnished Plant Bug Lygus Lineolaris的存活率

温室实验使用了带有幼小棉铃的单独棉花植株。实验在开花第二周进行（大约65天），因为这是棉花生长的一个生理敏感阶段（Rehman和Farooq，2020年）。此外，这个阶段通常与Tarnished plant bug造成的显著经济损失有关。通过将二龄若虫引入经过各种纳米气泡或AMF处理的植物中，并用有机玻璃网袋（22×22×8毫米，网孔约240微米，JoAnn's Fabrics，美国俄亥俄州Hudson）包裹，来评估L. lineolaris若虫的存活率。每种处理使用10只若虫记录5天的存活数据（N=10只若虫/株/处理）。在另一个实验设置中，将五对（5只雄性和5只雌性）4天大的L. lineolaris成虫放置在每株植物的末端，每个处理使用10株植物（N=10只昆虫/株）。连续8天收集成虫的死亡和存活数据。

2.5 统计分析

使用带有泊松分布和对数链接函数的一般线性模型（GLM）分析了真正叶片数量和结铃数量。不同的纳米气泡和AMF处理作为固定效应。通过皮尔逊卡方统计量与残差自由度的比率来评估过度离散性。当检测到过度离散性时，应用准泊松模型。使用Tukey的事后检验在p<0.05的水平上进行均值分离。种子发芽率、地上植物形态参数（植物高度、干茎生物量）和地下形态参数（根长、干根生物量）的数据通过单因素方差分析（ANOVA）进行分析，随后使用R统计软件（R studio版本4.5.2）和JMP统计软件（版本10，SAS公司，北卡罗来纳州Cary）进行Tukey的HSD均值比较。在同一行中没有共享字母的处理在统计上是有区别的（α=0.05）。在分析之前，种子发芽数据经过反正弦平方根变换以满足正态性和方差同质性的假设。数据的正态性通过Shapiro-Wilk正态性检验进行了检验，Bartlett统计量检验用于检验方差的同质性。非正态数据经过平方根变换以满足参数检验程序的要求。使用Kaplan-Meier生存分析结合Log-Rank检验分析了成年L. lineolaris在不同处理植物上的存活情况，并使用Dunn检验在多个水平上进行了比较（p < 0.05）。图表使用GraphPad Prism 10.2.2（GraphPad Software，波士顿，MA）生成。

### 3 结果
#### 3.1 发芽状况
处理后的种子发芽率（NB-15、NB-30、AMF-15、NB-15 × AMF-15、NB-30 × AMF-15和对照组）（每种处理30个样本）显示，纳米气泡和AMF及其组合的发芽率显著高于对照植物（F5, 174 = 13.39，p < 0.001；图1）。NB-15 ppm处理的种子发芽率最高（100%），而对照组最低（40%）。AMF-15 gm处理的种子发芽率也优于对照组（超过43%）。NB-15和AMF-15的组合处理使发芽率进一步提高（超过56%）（图1）。8天后各处理组间的发芽率没有差异。

#### 3.2 植物形态特征
纳米气泡和AMF处理显著影响了植物生长特征，如植物高度（F5, 174 = 13.54，p < 0.001；图2A），其中NB-15处理的植物最高（21.73 ± 1.03 cm），对照组最低（15.57 ± 1.90 cm）。到第15天时，对照组植物的真实叶片数量最少（F5, 174 = 3.55，p < 0.004；图2B）。纳米气泡和AMF也对每株植物的叶片数有显著影响（F5, 174 = 6.022，p < 0.001；图2C）。NB-30 × AMF-15组合处理的植物叶片数最多，但与对照组无显著差异。然而，不同处理组的干茎生物量存在显著差异（F5, 54 = 4.714，p < 0.01；图2D）。热图显示，处理组的植物高度和根长均高于对照组（支持信息S1：图S1）。热图中的颜色梯度也清晰表明，处理组的叶片数和叶片密度高于对照组（支持信息S1：图S1）。

#### 3.3 根形态特征
与对照组相比，纳米气泡和AMF的单独或组合处理对根长没有显著影响（F5, 54 = 2.357，p > 0.05；图3A,C）。然而，纳米气泡和AMF的单独处理显著影响了根的干重（F5, 54 = 9.067，p < 0.001；图3B,C）。NB-15处理（7.44 ± 0.16 gm）和AMF-15处理（7.46 ± 0.4 gm）的干根生物量显著高于对照组（4.87 ± 0.31 gm）。热图显示，纳米气泡处理植物的干根和干茎生物量较高（支持信息S1：图S1）。

#### 3.4 对植食性昆虫适应性的影响
评估了L. lineolaris若虫的存活率，以确定纳米气泡处理和AMF对幼虫表现的影响。结果表明，AMF-15和NB-30 × AMF-15处理的棉花上的存活率显著高于对照组（F5, 54 = 8.680，p < 0.001；图4C）。纳米气泡和AMF的单独处理与对照组相比，L. lineolaris成虫的存活概率有显著差异（Log rank = 20.09，p < 0.001；图4A）。NB和AMF的组合处理与对照组相比，存活概率也有显著差异（Log rank = 15.24，p < 0.001；图4B）。

### 4 讨论
关于纳米气泡水和AMF作为可持续农业资源的协同效应的研究相对较少，尤其是在行作物方面。在本研究中，我们检验了两种不同浓度的纳米气泡和AMF及其组合，以确定它们对植物生长和发育的影响，以及它们与主要植食性害虫L. lineolaris的相互作用。我们的结果表明，纳米气泡水单独使用或与AMF结合使用均有助于提高种子发芽率和整体植物生长（Rehman和Farooq 2020；根部氧气吸收对植物呼吸至关重要）。研究还显示植食性昆虫的适应性得到了改善。总体而言，植物特征的显著改善为可持续农业带来了希望，但需进一步研究宿主-植食性昆虫之间的相互作用。

### 5 结论
本研究总结指出，纳米气泡和AMF的处理显著提高了棉籽的发芽率。地上形态特征（即真实叶片数量、叶片数和植物高度）也得到了积极影响。根的生长也因纳米气泡和AMF的处理而显著改善。此外，健康的植物为植食性昆虫提供了更好的生存机会和适应性。证据表明，纳米气泡水和AMF的组合处理有利于植物生长，并能增加作物的产量。未来的研究重点应放在确定纳米气泡和AMF的最佳浓度上，以最大化不同作物品种和生长条件下的植物生长效益。这种标准化将建立可靠的处理方案，以便在田间统一应用。在多种环境条件和土壤类型下进行田间试验对于验证实验室结果和制定实际的种植者指南至关重要。

**作者贡献**
概念构思与实验设计：Justin George、Rahul Debnath、Rupesh Kariyat 和 Gadi V. P. Reddy
验证：Justin George 和 Rahul Debnath
数据分析：Justin George 和 Rahul Debnath
提供材料：Justin George、Gadi V. P. Reddy 和 Rupesh Kariyat
初稿撰写：Justin George 和 Rahul Debnath
审稿与编辑：Justin George、Rahul Debnath、Rupesh Kariyat 和 Gadi V. P. Reddy
所有作者均已阅读并同意最终发表的手稿版本。

**致谢**
特别感谢 Dayreke Snow 和 Russ Godbold（美国农业部农业研究服务局，密西西比州斯通维尔）在实验室和田间研究中提供的技术支持。同时，我们也感谢 Nathan Little 博士在实验中帮助安装 Moleaer 纳米气泡设备。美国农业部是一个提供平等机会的雇主和机构。本出版物中的发现和结论仅代表作者个人观点，不应被视为美国农业部或美国政府的任何官方立场或政策。文中提及的商标名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。本研究得到了美国农业部农业研究服务局（Research Project# 6066-30400-001-000D）的财政支持，该项目专注于美国南部种植作物的综合害虫控制与抗性管理策略。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**
所有数据均包含在论文中，如有需要，可另行提供更多信息。