食花行为后花香释放的恢复能力

《Plant Biology》：Resilience of floral scent emission after florivory

　　摘要

在漫长的进化过程中，食花行为一直是影响花朵进化的重要选择压力来源。当食花动物取食时，它们会去除花瓣的部分，这无疑会改变花朵的视觉特征；然而，我们对食花行为对花朵嗅觉信号传递的影响仍处于初步了解阶段。食花动物可能通过取食负责挥发物合成/释放的花部结构，或者通过引发植物生理反应来改变花朵的香气，从而危及花香的释放。因此，在食花行为发生后，花朵可能不再能够吸引传粉者，甚至可能因为局部短期内的香气变化而将它们驱赶 away。在本研究中，我们探讨了食花行为是否改变了花香的量和组成。我们描述了新热带草原地区七种植物的自然食花模式，并对其可能参与香气释放的花瓣结构进行了解剖学分析，这些植物分别由蜜蜂、蜂鸟、天蛾或蝴蝶授粉，且这些植物具有多样的食花动物。此外，我们还进行了自然实验以测试食花行为是否会导致花朵香气的短期局部变化。研究发现，即使食花动物消耗了含有香气释放结构的花瓣部分的15%，花香的总量也没有减少，除了由天蛾授粉的植物外，该植物在仅消耗了3%的香气释放区域后，其香气释放量有所下降。在任何物种中，食花行为都没有影响香气的组成。我们的数据表明，食花行为后的香气释放保持稳定，这可能保证了无论是否发生食花行为，传粉者仍会访问花朵，显示出自然系统具有多重且同时发生的相互作用的能力。

引言

据报道，食花行为自早白垩世（约1.03亿年前）就已经存在，这一结论得到了最早出现的被子植物出现后3000万年化石的证据支持（Xiao等人，2021年）。因此，这种植物-动物相互作用比传粉者的最新辐射演化时间更为古老（Peris和Condamine，2024年），并且在大约1亿至5000年前发生的被子植物陆地革命期间就已经形成（Benton等人，2022年）。此外，许多（授粉）互惠关系可能是从对抗关系演化而来的（例如，共适应对抗假说，Johnson等人，2021年；Etl等人，2022年）。尽管传粉者和食花动物都会被花朵吸引（Sasidharan等人，2023年），但它们的生态角色通常是冲突的（Kessler等人，2013年；Schiestl，2015年）。食花动物可以通过取食植物的生殖器官来降低植物的繁殖成功率，同时也可以通过改变花朵的信号特征（McCall和Irwin，2006年；Zangerl和Berenbaum，2009年）以及干扰植物与传粉者之间的通讯（Chittka和Thomson，2001年；Schaefer和Ruxton，2011年）来影响繁殖。食花行为本质上会影响花朵的视觉特征（Mothershead和Marquis，2000年；Malo等人，2001年），例如当食花动物去除花被的部分时；然而，食花行为如何影响花朵的嗅觉特征（Raguso，2008年；D?tterl和Gershenzon，2023年）目前仍知之甚少。不过，现有的少数研究表明，食花行为可以触发花朵的生理反应，这一点与叶片被食草动物啃食的情况类似（Kessler和Baldwin，2002年；Erb等人，2008年；Dicke和Baldwin，2010年；Rusman等人，2019年），从而导致花香释放的质性和定量变化（Farré-Armengol等人，2015年）。由于食花行为属于食草行为的一种，可以预期花朵组织的去除也会引起花香挥发物的变化，包括总香气的释放量和香气组成的变化。此外，食花动物不仅可能消耗不参与花香合成和释放的组织，还可能消耗具有香气释放特性的特定花部区域（Effmert等人，2006年；Knudsen和Gershenzon，2020年）。在这种情况下，食花动物可能会减少负责香气释放的生物合成区域和物理表面积，从而预期它们会减少花朵释放的香气量和/或香气组成。由于多种原因，食花行为可能会影响植物与传粉者之间的通讯途径，因此传粉者可能会因为花朵香气表型的变化而避开被食花动物损害的花朵（Zangerl和Berenbaum，2009年；Kessler等人，2011年；Schiestl等人，2014年；Vega-Polanco等人，2020年）。因此，本研究旨在综合理解食花行为对花香释放的干扰作用，重点关注食花动物不会使花朵失去吸引力的情况。具体来说，我们选择了七种具有不同授粉系统和食花动物的植物，以（i）识别与香气释放相关的花瓣区域，并调查食花动物是否取食这些花瓣部分；以及（ii）调查食花行为是否会导致花香总量和相对组成的变化。我们测试了食花动物是否通过去除具有香气释放特征的花瓣区域直接减少香气释放量的假设。

材料与方法

为了实现我们的目标，我们从塞拉多草原生态系统中选择了七种植物，这些植物分别由蜜蜂、蝴蝶、天蛾或蜂鸟授粉（表1），同时它们的花朵也会被甲虫、毛虫和蝗虫消耗。其中六种植物由强烈依赖香气的动物（蜜蜂、蝴蝶和天蛾）授粉，一种植物则由不太依赖香气的动物（蜂鸟）授粉。Amphilophium mansoanum（紫葳科）、Lantana camara（马鞭草科）、Tocoyena formosa（茜草科）和Zeyheria montana（紫葳科）是异交植物，完全依赖传粉者进行果实生产（Silberbauer-Gottsberger，1972年；Barrows，1976年；Bittencourt和Semir，2004年，A. mansoanum的数据未发表），而Byrsonima intermedia（锦葵科）和Lippia alba（马鞭草科）主要是异交植物，由昆虫授粉（Schocken，2007年；Boas等人，2013年；Balestra等人，2014年），Centrosema pubescens（豆科）具有混合交配系统（Penteado等人，1996年；Sousa等人，2011年）。野外实验从2018年3月持续到11月，解剖学和组织化学研究则在2022年进行。所有植物实验均遵循相关的机构、国家和国际指南及法规。生物样本采集的授权记录在Sisgen系统中，编号为#A90A83C和#A8C28D6。

表1. 植物种类及其授粉者

| 植物种类（科） | 授粉者 | 参考文献 | 采样地点 |
|-----------|--------|---------|---------|
| Amphilophium mansoanum (DC.) L.G.Lohmann (紫葳科) | 大型蜜蜂 | Balduino等人，2023年 | 22°49′S 49°13′W |
| Byrsonima intermedia A. Juss. (锦葵科) | 采集花油的蜜蜂 | Boas等人，2013年 | 22°48′S 49°11′W |
| Centrosema pubescens Benth. (豆科) | 大型蜜蜂 | Borges，2006年 | 22°49′S 49°13′W |
| Lantana camara L. (马鞭草科) | 蝴蝶 | Schemske，1976年 | 22°47′S 49°14′W |
| Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex P. Wilson (马鞭草科) | 蝴蝶 | Venancio等人，2016年 | 22°53′S 48°27′W |
| Tocoyena formosa (Cham. & Schltdl.) K.Schum. (茜草科) | 天蛾 | Silberbauer-Gottsberger和Gottsberger，1975年 | 22°47′S 49°14′W |
| Zeyheria montana Mart. (紫葳科) | 蜂鸟 | Bittencourt和Semir，2004年 | 22°54′S 48°30′W |

参与香气释放的花瓣结构特征

我们使用了三种互补的方法来表征可能参与香气释放的花瓣结构。首先，我们使用Vogel中性红测试（Dafni等人，2005年）来初步了解可能释放香气的花瓣区域。其次，我们通过组织学分析来补充Vogel测试的结果，因为这可以帮助我们确定染色区域是否确实包含具有香气释放特性的组织，如具有特定细胞结构的香气释放器官（Effmert等人，2006年）。第三，我们利用组织化学方法确认这些花瓣区域是否参与香气的生物合成/释放，因为淀粉颗粒、亲脂化合物和萜烯的积累与花香的分泌有关（Stern等人，1986年；Ascens?o等人，1999年；Effmert等人，2006年）。除了这三种分析方法外，我们还进行了表面分析，以了解参与香气释放的花瓣区域的整体外观（表皮、质地和微观结构）。结合所有这些方法，我们可以更准确地判断食花行为是否影响了参与香气生产和释放的花瓣部分。在Vogel中性红测试中，我们每种植物选取了三到五朵刚刚开放的花朵/花序进行采样，并将每个样本浸泡在中性红溶液（0.01%，pH 8）中30-45分钟。之后，我们将每个样本用水冲洗，仔细观察并记录染色区域的位置并拍照。Vogel中性红测试的结果指出了用于香气相关化合物组织学分析和定位的花瓣区域。因此，在组织学分析中，我们选取了Amphilophium mansoanum花瓣管的中央上部、Byrsoima intermedia上花瓣的中部、Centrosema pubescens标准花瓣的中央部分、Lantana camara的花瓣管入口、Lippia alba的花瓣裂片、Tocoyena formosa花瓣裂片的中央部分以及Zeyheria montana的花瓣管入口作为样本。从刚刚开放的花朵中获取的样本用Karnovsky试剂（Karnovsky，1965年）固定48小时，然后在酒精系列中脱水，并嵌入甘油-甲基丙烯酸树脂（Historesin，Leica Instruments?）中。使用半自动旋转切片机（Leica Biosystems RM2245，德国韦茨拉尔）制备了大约5微米厚的横截面和纵截面切片。切片用0.05%的toluidine blue（pH 4.7）进行染色，以进行组织学表征（O'Brien等人，1964年）。为了定位与香气释放组织相关的物质群，我们使用了Lugol试剂检测淀粉颗粒（Johansen，1940年）、Sudan IV检测脂质物质（Johansen，1940年）和NADI试剂检测萜类化合物（David和Carde，1964年）。我们对每种测试都进行了适当的对照实验。我们在配备数字相机（Olympus C 5050）的光学显微镜（Olympus BX 41）下分析和记录了切片结果。对于表面分析，我们从刚刚开放的花朵中选取了大约1平方厘米的样本，立即用Karnovsky试剂（Karnovsky，1965年）固定24小时，然后在丙酮系列中脱水，并在临界点设备（Bal-Tec CPD 030）中干燥。样本被粘贴在铝制样品架上，并用约10纳米的金进行真空镀膜（Bal-Tec SCD 050）。分析使用的是Quanta 200型扫描电子显微镜（FEI，美国希尔斯伯勒）。在第一次采样时，我们从A. mansoanum的7株植物中各采了2朵花，从B. intermedia的5株植物中各采了2朵花，从C. pubescens的5株植物中各采了2朵花，从L. camara的2株植物中各采了2朵花，从L. alba的3株植物中各采了2朵花，从T. formosa的7株植物中各采了2朵花，从Z. montana的10株植物中各采了2朵花。进行第二次采样时，有时会导致花朵从植株上脱落。此外，有时食花动物并不会取食这些花朵。在这种情况下，我们会丢弃这些植物的第二次气味样本。我们使用第一次采集的样本来增加对照组的样本数量。因此，在第二次采样时，我们使用的植物数量减少了，对于某些物种来说，采集到的对照组和受损花朵的数量并不相同（见表S2）。图1（在图形查看器中打开）。

图1展示了用于确定食花行为是否改变花朵挥发物释放的实验设计示意图。(A) 在整个实验过程中未受到食花动物影响而保持完整的花朵。(B) 最初完整但后来被食花动物损坏的花朵。在第一次采样时，当两朵花（F1和F2）都完整时，我们在研究植物的花朵/花序上收集了花香；在第二次采样时，其中一朵花（F1）保持完整，另一朵花（F2）被食花动物取食。食花动物在第一次采样后立即被放置在F2上，从食花动物放置到第二次采样之间的时间间隔是可变的，具体时间见表S4。该图由Tunes等人（2022年）使用BioRender软件制作（链接：https://BioRender.com/nt30dbr）。我们按照D?tterl等人（2005年）的协议收集了挥发物样本。花朵（或花序，见表S2）被用聚乙烯袋包裹（袋子的大小根据花朵/花序的大小从7×7厘米到8×15厘米不等，但同一物种内的对照组和处理组花朵/花序的袋子大小相同），然后利用真空泵（流速为200毫升/分钟）将袋子内的挥发物收集到吸附管中。收集时间根据人类嗅觉感知到的气味强度不同而介于15到60分钟之间（见表S2）。吸附管长度为20毫米，内径为2毫米，内部填充了1.5毫克的Tenax-TA（60-80目）和1.5毫克的Carbotrap B（20-40目；均来自德国Supelco公司）。从叶片中收集的挥发物作为阴性对照。样本被储存在-20°C的冷冻室中，直到在自动热脱附系统（TD 20，岛津公司，日本东京）中进行分析，该系统连接着一个气相色谱仪（GC/MS-QP2010 Ultra，岛津公司，日本东京）。该装置配备了一个ZB-5熔融石英柱（长60米，内径0.25毫米，膜厚度0.25微米），并保持恒定的1.5毫升/分钟的氦气流作为载气。注射器的温度为200°C，样本的进样方式根据对每个物种测试样本的初步分析结果设置为可变分割模式（分割比为1、5、10、25和50）。烤箱温度从40°C开始，然后以每分钟6°C的速度升高，最终稳定在250°C并保持1分钟。质谱仪接口设置为250°C。质谱数据在70电子伏特（EI模式）下采集，扫描范围为30-350 m/z。数据使用GCMSolution软件（版本4.41，岛津公司）进行分析。我们通过将挥发物的线性保留指数（根据van den Dool & Kratz 1963年的方法）与ADAMS（Adams 2007）、ESSENTIALOILS-23P、FFNSC 2、Wiley 9和Nist11数据库中的质谱数据进行比较来鉴定挥发物化合物。对于某些化合物，我们通过将其保留指数和质谱数据与萨尔茨堡大学植物生态学实验室收藏的 authentic 参考标准进行比较来确认其身份。对于VOCs的定量分析，我们将大约150种化合物中的每种化合物各注入100纳克到GC–MS系统中，包括单萜类、脂肪族和芳香族化合物。我们使用这些化合物的平均峰面积（总离子电流）根据Etl等人（2016年）的方法来估计每个样本中可用的花香总量。那些在对照组样本中不存在或在花朵中含量至少是对照组五倍的化合物被认为是花香化合物。我们使用基于欧几里得距离的PERMANOVAs（9999次排列）来评估完整花朵和受损花朵/花序之间的花香总量和化合物相对含量的差异。我们还使用基于欧几里得距离的PERMANOVAs（9999次排列）来评估完整花朵和受损花朵/花序之间每种单独香味化合物的相对含量的差异。在这些分析中，我们将花朵所受的处理（完整或被食花动物损坏）和采样时间（1或2）作为固定因素，植物个体作为随机因素。如果Treatment*Sampling moment交互作用显著，则表明食花行为对花香释放有局部短期影响。由于样本量较小，L. camara和L. alba的数据未通过PERMANOVA进行分析，因为可能的唯一排列次数太少（分别为18次和214次），无法获得可靠的结果。我们使用基于Bray–Curtis差异的非度量多维缩放（NMDS）来可视化不同物种内样本之间化合物相对含量的相似性和差异性。所有PERMANOVA和NMDS分析都是使用Primer 6 v. 6.1.15和PERMANOVA+ v. 1.0.5（Clarke & Gorley 2006）软件进行的。为了创建小提琴图并图形化比较完整花朵和受损花朵释放的挥发物总量，我们使用了R v. 4.0.2（R Core Team 2020）软件和ggplot2包（Wickham 2016）。

**花香释放相关花冠组织的特征分析：**

在所有物种中，中性红溶液染色了花冠的某些部分，这些部分在不同物种中的位置、大小和形状各不相同，表明存在潜在的香味释放区域（表2；图2A–G）。显微形态学（图3）和解剖学分析（图4）显示，被中性红染色的区域（图2A–G）具有典型的香味释放组织特征。表2列出了所研究七种物种的花香释放区域的形态和解剖学特征。

| 植物物种 | 角质层 | 表皮表面 | 发香组织 | 腺毛 |
|---------|--------|---------|---------|-------|
| Amphilophium mansoanum (DC.) L.G.Lohmann (Bignoniaceae) | 光滑 | 轻微乳突状 | 单列表皮 | 存在 |
| Byrsonima intermedia A. Juss. (Malpighiaceae) | 深纹状 | 扁平 | 单列表皮 | 不存在 |
| Centrosema pubescens Benth. (Fabaceae) | 光滑 | 乳突状 | 单列表皮 | 存在 |
| Lantana camara L. (Verbenaceae) | 纹状 | 乳突状 | 单列表皮 | 存在 |
| Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex P. Wilson (Verbenaceae) | 纹状 | 乳突状 | 单列表皮 | 存在 |
| Tocoyena formosa (Cham. & Schltdl.) K.Schum. (Rubiaceae) | 光滑 | 扁平 | 表皮和表皮下层 | 存在 |
| Zeyheria montana Mart. (Bignoniaceae) | 纹状 | 乳突状 | 单列表皮 | 存在 |

**图2（在图形查看器中打开）**展示了花朵、传粉者、被中性红溶液染色的花朵部分、食花模式以及与研究植物物种相互作用的食花动物。A行：Amphilophium mansoanum；B行：Byrsonima intermedia；C行：Centrosema pubescens；D行：Lantana camara；E行：Lippia alba；F行：Tocoyena formosa；G行：Zeyheria montana。[左侧列] 野外条件下完整的花朵及其相应的传粉者（A–D行，G行）；[中间列] 用Vogel中性红溶液染色的花朵；[右侧列] 被食花动物取食的花朵，展示了野外记录的最常见食花模式（A–C行，E行，G行）。图3（在图形查看器中打开）展示了研究植物物种的花香释放组织的表面特征；扫描电子显微照片。(A) Amphilophium mansoanum；花冠管的中央上部。(B) Byrsonima intermedia；上花瓣的中间部分。(C) Centrosema pubescens；标准花瓣的中央部分。(D) Lantana camara；花冠管入口。(E) Lippia alba；花瓣裂片。(F) Tocoyena formosa；花瓣裂片的中央部分。(G) Zeyheria montana；花瓣裂片。(A) 上表面平坦光滑，显示腺毛和非腺毛以及气孔（箭头所示）。(B) 上表面平坦，角质层有深纹。(C) 上表面乳突状，角质层光滑。细节显示表皮的圆锥形细胞。(D) 上表面乳突状，由表皮的圆锥形细胞组成。(E) 上表面乳突状，由表皮的圆锥形细胞组成。(F) 上表面平坦，角质层光滑，有许多平卧的腺毛和非腺毛。(G) 上表面乳突状，由表皮的球形细胞和有纹的角质层组成。符号：gt：腺毛；ngt：非腺毛。

**图4（在图形查看器中打开）**展示了研究植物物种花冠的香味释放组织的解剖学和组织化学特征。横截面；A–B, E, H–K, N–O, Q–R, V，使用甲苯胺蓝染色。(A–D) Amphilophium mansoanum；花冠管的中央上部。(E–G) Byrsonima intermedia；上花瓣的中间部分。(H–I) Centrosema pubescens；标准花瓣的中央部分。(J–M) Lantana camara；花冠管入口。(N–P) Lippia alba；花瓣裂片。(Q–U) Tocoyena formosa；花瓣裂片的中央部分。(V–W) Zeyheria montana；花瓣裂片。(A) 一般视图，显示两侧的单列表皮，中叶由多层薄壁组织和维管束组成。(B) 上表面显示腺毛和单列分泌表皮，由扁平细胞组成，细胞内容物密集，核较大（箭头所示），以及表皮下的分泌薄壁组织层。(C) 表皮和表皮下细胞中的脂滴（箭头所示）和腺毛。(D) 表皮和表皮下细胞中的淀粉颗粒（箭头所示）。(E) 一般视图，显示单列表皮，松散排列的薄壁组织和维管束。注意上表皮细胞内容物密集。(F) 脂滴（箭头所示）位于角质层中并浸入其中，以及表皮细胞中。(G) 角质层和表皮下空间中的萜类物质（箭头所示）。(H) 一般视图，显示上表面的分泌表皮由高大的圆锥形细胞组成，松散排列的薄壁组织和大的细胞间隙，以及扁平的下表面表皮和腺毛。(I) 表皮细胞中含有大的液泡和密集的内含物。(j) 一般视图，显示上表面的分泌表皮由圆锥形细胞组成，松散排列的薄壁组织和大的细胞间隙，以及扁平的下表面表皮。(K) 表皮细胞中含有大的液泡和絮状内含物。(L) 分泌表皮细胞中的脂滴（箭头所示）。(M) 表皮细胞中的萜类物质（箭头所示）。(N) 一般视图，显示上表面的分泌表皮由圆锥形细胞组成，松散排列的薄壁组织和大的细胞间隙，以及扁平的下表面表皮。(O) 表皮细胞中含有大的液泡和密集的内含物。(P) 分泌表皮由圆锥形细胞组成，松散排列的薄壁组织和大的细胞间隙，以及扁平的下表面表皮。(Q) 一般视图，显示上表面的单列表皮，紧密排列的薄壁组织没有细胞间隙，以及维管束。(R) 上表面的分泌表皮和表皮下层由紧密排列的扁平细胞组成，内容物密集。(S) 腺毛、分泌表皮和表皮下层中的脂滴（箭头所示）。(T) 花毛、表皮和表皮下层中的淀粉颗粒（箭头所示)。(U) 表皮和表皮下层中的萜类物质（箭头所示)。(V) 一般视图，显示上表面的单列表皮由球形的分泌细胞组成，松散排列的薄壁组织和大的细胞间隙，以及扁平的下表面表皮和分枝的腺毛。(W) 表皮细胞原生质和角质层中的萜类物质（箭头所示）。符号：ct：角质层；ep：表皮；gt：腺毛；is：细胞间隙；pa：薄壁组织；vb：维管束。在具有香味释放特征的组织中，角质层的类型从光滑到有纹状不等（表2；图3A–G）。此外，表皮表面的类型在B. intermedia和T. formosa中为扁平（图3B,F），在A. mansoanum中为轻微乳突状（图3A），在其他四种物种中为乳突状（表2），表皮细胞的形状在C. pubescens、L. camara和L. alba中为圆锥形（图3C–E），而在Z. montana中为球形（图3G）。我们还验证了大多数物种中具有香味释放特征的组织中存在气孔（图3A）和腺毛（图3A,F；图4B,H,R–T，表2），除了B. intermedia（图3B）。在A. mansoanum（图4A–D）和T. formosa（图4Q–U）中观察到典型的渗透细胞，由表皮和下面的薄壁组织层组成。在B. intermedia、C. pubescens、L. camara、L. alba和Z. montana中，只有表皮细胞显示出香味释放特征（表2，图4E–P,V–W）。在所有物种的上表面，表皮细胞体积较大，核较大（图4B），并且内容物密集（图4I,K,O,V）。五种没有表现出典型香气分泌结构的植物，其薄壁组织排列较为松散，细胞较小，细胞间隙较大（图4E、H、J、N、V）。Amphilophium mansoanum和T. formosa的表皮下层细胞排列紧密，细胞较大且细胞内容物密集（图4A、B、Q、R），细胞核也较大（图4B）。组织化学分析显示这些细胞对淀粉颗粒、总脂质和萜类化合物呈阳性反应。除了B. intermedia外，所有物种的腺毛都位于中性红染色区域，并对NADI试剂呈阳性反应，表明它们参与了萜类化合物的合成和释放。在所有物种的表皮细胞以及T. formosa的腺毛和表皮下层细胞中都检测到了萜类化合物（图4U）。我们在大多数植物的表皮细胞中发现了脂质滴（图4C、F、L、P、S），但Z. montana除外。我们还在A. mansoanum（图4C）、C. pubescens（图4R）和T. formosa（图4S）的腺毛中发现了脂质滴。最后，在A. mansoanum（图4D）和T. formosa（图4T）的表皮和表皮下层细胞中检测到了淀粉颗粒。

我们记录了多种食花动物，包括昆虫（甲虫、蝴蝶幼虫、蝗虫）和鸟类（雀形目鸟类）（表3）。我们发现，在七个采样物种中的六个中，食花动物以具有散发香气的花部为食（表3，图2A–C、E–G）。唯一的例外是L. camara，其具有散发香气的组织位于花冠管的入口处，呈环状，但食花行为仅发生在花冠管的边缘和基部（表3，图2D）。在我们的实验设置中，食花动物造成的损害与自然条件下的观察结果相似。

我们记录了多种食花动物，包括昆虫（甲虫、蝴蝶幼虫、蝗虫）和鸟类（雀形目鸟类）（表3）。我们验证了在七个采样物种中的六个中，食花动物以具有散发香气特征的花部为食（表3，图2A–C、E–G）。唯一的例外是L. camara，其具有散发香气的组织位于花冠管的入口处，呈环状，但食花行为仅发生在花冠管的边缘和基部（表3，图2D）。食花动物在我们的实验设置中造成的损害与自然条件下的观察结果相似。

在所有研究的物种中都检测到了花香（详见表S3），每个物种记录了4-52种化合物。一些物种的花香较弱，低于100 ng/花/小时（见表S3），例如B. intermedia（43-47种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以(E)-β-石竹烯和α-胡薄荷烯为主）、L. alba（41-44种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以芳樟醇为主）和Z. montana（13-20种化合物，主要是芳香族化合物，但也包含萜类化合物和脂肪族化合物，以苯甲酸甲酯为主）。其他物种的花香较强，高于400 ng/花/小时，例如A. mansoanum（30-43种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以(E)-β-奥西缅烯为主）和T. formosa（27-29种化合物，主要是芳香族化合物和萜类化合物，还包括含氮化合物，以甲基苯甲酸酯和(E)-芳樟醇氧化物吡喃oids为主）。L. camara（4-8种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以芳樟醇和甲基辛酸酯为主）和C. pubescens（37-52种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以2-苯基乙醇为主）的花香强度介于弱香和强香之间（100-200 ng/花/小时）。在T. formosa中，我们发现自然食花行为对受损花朵释放的总花香量有显著的负面影响（见图5，详细统计见表S4和S5，PERMANOVA‘处理*采样时刻’）。图5在图形查看器中打开。

通过PERMANOVA分析，我们发现自然食花行为对五个植物物种的花香总量没有影响（P > 0.05，详见表S4，PERMANOVA‘处理*采样时刻’）。在L. camara和L. alba中，由于样本量太小，无法进行稳健的PERMANOVA分析，NMDS分析未能明显区分受损花朵和未受损花朵（见图6）。

非度量多维缩放（NMDS）显示了在采样时刻1和2（SM1和SM2）从对照花和自然受损花中收集的花香样本，基于Bray–Curtis相似性计算，该相似性基于花香化合物的相对含量。对照花在SM1和SM2时都是完整的，被食用的花在SM1时是完整的，但在SM2时被各自的食花动物自然损坏。我们发现A. mansoanum、B. intermedia、L. camara和Z. montana中单个花香化合物的相对含量没有变化（P > 0.05，详见表S6）。然而，在其他三个研究的植物物种中，几种花香化合物在同一个植株内的花朵之间有所变化，或者受到时间的影响。在C. pubescens中，2-苯基乙醇在SM2中的相对含量低于SM1；而在L. alba中，(E)-芳樟醇氧化物呋喃oids在SM2中的含量较高。在T. formosa中，我们发现同源奥西缅烯在同一个植株内的花朵之间有所变化，并受到时间的影响，在SM2中的含量低于SM1，并且在对照花中的含量也较低。此外，几种化合物受到时间的影响，其中顺式-2-甲基丁醛肟、1-己醇、甲基烟酸酯和(E)-芳樟醇氧化物吡喃oids的含量随时间增加；而甲基苯甲酸酯、2,2,6-三甲基-6-乙烯基二氢-2H-吡喃-3(4H)-酮和(Z)-芳樟醇氧化物吡喃oids的含量随时间减少。唯一受到食花行为损害的特定化合物是6-甲基-5-庚烯-2-酮，其在被食花动物损害的花朵中的含量显著增加（表S6和S7）。

评估食花行为对花香的影响时，我们发现所有研究的物种都存在花香（详见表S3），每个物种记录了4-52种化合物。一些物种的花香较弱，低于100 ng/花/小时，例如B. intermedia（43-47种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以(E)-β-石竹烯和α-胡薄荷烯为主）、L. alba（41-44种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以芳樟醇为主）和Z. montana（13-20种化合物，主要是芳香族化合物，但也包含萜类化合物和脂肪族化合物，以苯甲酸甲酯为主）。其他物种的花香较强，高于400 ng/花/小时，例如A. mansoanum（30-43种化合物，主要是萜类化合物，但也包含脂肪族和芳香族化合物，以(E)-β-奥西缅烯为主）和T. formosa（27-29种化合物，主要是芳香族化合物和萜类化合物，还包括含氮化合物，以甲基苯甲酸酯和(E)-芳樟醇氧化物吡喃oids为主）。在T. formosa中，我们发现自然食花行为对受损花朵释放的总花香量有显著负面影响（见图5，详细统计见表S4和S5，PERMANOVA‘处理*采样时刻’）。图5在图形查看器中打开。

通过PERMANOVA分析，我们发现自然食花行为对五个植物物种的花香总量没有影响（P > 0.05，详见表S4，PERMANOVA‘处理*采样时刻’）。在L. camara和L. alba中，由于样本量太小，无法进行稳健的PERMANOVA分析，NMDS分析未能明显区分受损花朵和未受损花朵（见图6）。

非度量多维缩放（NMDS）显示了在采样时刻1和2（SM1和SM2）从对照花和自然受损花中收集的花香样本，基于Bray–Curtis相似性计算，该相似性基于花香化合物的相对含量。对照花在SM1和SM2时都是完整的，被食用的花在SM1时是完整的，但在SM2时被各自的食花动物自然损坏。我们发现A. mansoanum、B. intermedia、L. camara和Z. montana中单个花香化合物的相对含量没有变化（P > 0.05，详见表S6）。然而，在其他三个研究的植物物种中，几种花香化合物在同一个植株内的花朵之间有所变化，或者受到时间的影响。在C. pubescens中，2-苯基乙醇在SM2中的相对含量低于SM1；而在L. alba中，(E)-芳樟醇氧化物呋喃oids在SM2中的含量较高。在T. formosa中，我们发现同源奥西缅烯在同一个植株内的花朵之间有所变化，并受到时间的影响，在SM2中的含量低于SM1，并且在对照花中的含量也较低。此外，几种化合物受到时间的影响，其中顺式-2-甲基丁醛肟、1-己醇、甲基烟酸酯和(E)-芳樟醇氧化物吡喃oids的含量随时间增加；而甲基苯甲酸酯、2,2,6-三甲基-6-乙烯基二氢-2H-吡喃-3(4H)-酮和(Z)-芳樟醇氧化物吡喃oids的含量随时间减少。此外，唯一受到食花行为损害的特定化合物是6-甲基-5-庚烯-2-酮，其在被食花动物损害的花朵中的含量显著增加（表S6和S7）。

我们评估了蜜蜂、蝴蝶、天蛾和蜂鸟授粉的物种，发现它们的花冠具有不同面积的散发香气的特征。在所有植物物种中，食花动物都去除了这些区域的某些部分，除了L. camara。在六个去除具有散发香气特征的花冠组织的物种中，它们产生了并释放了萜类化合物、脂肪族和芳香族化合物。与我们的预期相反，去除具有散发香气特征的花冠区域并没有减少大多数物种的总花香量或改变花香的相对组成。只有T. formosa在典型的香气分泌区域出现了一些小孔后，释放的花香减少，尽管花香组成保持相似。具有散发香气特征的组织的细胞通过其相对较大的细胞大小、薄的角质层和密集的细胞质被识别出来，这些特征是分泌挥发物的细胞和组织的典型特征（Vogel 1990）。除了表皮细胞外，我们在几个物种中还检测到了对萜类化合物呈阳性的花分泌毛。具有散发香气特征和解剖学及细胞学特性的花分泌毛已在不同的科中被描述，包括Bignoniaceae（Machado等人2006；Guimar?es等人2008）、Fabaceae（Marinho等人2014, 2016）和Orchidaceae（Vogel 1990；Adachi & Machado 2020），这表明这些毛可能参与了所研究物种的花香释放。萜类化合物通常是特定物种特征花香的主要成分（Vogel 1983；Knudsen等人2006；Knudsen & Gershenzon 2020），它们是组织化学分析（图4A–D,F）和所研究物种的花香化学分析中检测到的主要物质类别。有趣的是，组织化学测试检测到的主要物质类别确实也在我们的化学分析中得到了验证。花香组成与其他蜜蜂、蝴蝶和天蛾授粉物种的文献数据一致，蜜蜂授粉物种的花香主要由萜类化合物和芳香族及脂肪族化合物组成；而蝴蝶授粉物种的花香主要由苯类化合物和萜类化合物组成；天蛾授粉物种的花香则包含芳香族和含氮化合物以及萜类化合物（Andersson & Dobson 2003；Dobson 2006）。此外，蜂鸟授粉物种主要含有萜类化合物和一些脂肪族和芳香族化合物，与其它蜂鸟授粉物种有一些共同化合物（Knudsen等人2004；Dellinger等人2019；Tunes等人2022）。食花动物去除的花冠面积在不同物种中有所不同，范围从1%到30%，因此，被食花动物消耗的具有散发香气特征的花冠组织面积也在不同物种中有所不同，范围从0%到15%。在蜜蜂授粉的物种A. mansoanum和C. pubescens中，被食花动物去除的花冠区域分别约为8%和10%，这可能不足以检测到受损花朵释放的总花香量的潜在减少，假设对食花行为的反应程度取决于被消耗的与香气释放相关的区域。在B. intermedia中，无法单独采样花朵；我们采样的花序包含7到23朵花和3到17个花蕾。在‘采样时刻2’，我们遇到了花朵被食花动物消耗（每个花序从1到4朵花）和在实验期间在袋装花序中新开放的花朵（从1到5朵花）的情况。因此，这个物种的结果只能让我们识别出对食花行为的短期系统反应，这并未通过我们的数据得到证实。蝴蝶授粉物种的食花行为水平差异很大。在L. alba中，大约30%的花序和15%的染色部分被食花动物消耗；而在L. camara中，不到1%的花序和0%的具有散发香气特征的花冠区域被食花动物消耗。L. camara中食花行为的显著较低水平可能是由于存在防御性化合物，如花青素（Goh等人2019），由于大量的毛（Silva等人2016；Tozin等人2016），以及由于存在具有高杀虫活性的有毒化合物，这些化合物存在于叶组织中（Kato-Noguchi & Kato 2025），也可能存在于花组织中。尽管我们的样本量不足以对L. camara进行统计分析，但数据表明L. camara的花香对食花行为没有反应，这与Goh等人（2019年）的研究结果相似。这一现象在意料之中，因为食花动物并未取食具有散发香味特征的花冠部分。在该物种中，保持具有香味特征的花冠完整区域对于传粉者来说可能非常重要，因为这些区域在花冠管入口处形成了一个“香味环”，可以作为引导传粉者找到花蜜的化学信号（D?tterl & Jürgens 2005；Lawson等人2017；García等人2021）。在L. alba中，毛虫主要取食花序的中央部分，包括苞片和花蕾，以及少数周围花朵的某些部分。因此，花序中的大部分功能性花朵保持完整，它们可能负责维持花香的量和组成，因为挥发性物质的释放通常在开花初期达到峰值（Knudsen & Gershenzon 2020）。唯一被采样的由天蛾授粉的物种T. formosa表现出较低程度的食花行为，大约只有3%的花朵面积受到影响，这些区域含有典型的嗅觉感受器。对于像T. formosa这样香气浓郁的花朵，有研究表明，低水平的食花行为可能表明花香中含有驱避性挥发性化合物（Kessler & Halitschke 2009及参考文献）。目前没有证据表明T. formosa花香中的主要化合物（苯甲醇、苯甲酸甲酯、（E）-芳樟醇氧化物吡喃衍生物）对食花动物具有驱避作用，然而其他芳香化合物和单萜类物质已被证明可以驱赶食花动物（D?tterl & Gershenzon 2023）。在这一物种中，食花行为使花朵释放的总花香量减少了约2.7倍，显示出食花行为引发的局部反应，因为未被食花动物消耗的花朵即使随着时间的推移也仅表现出轻微的香味减少。这种反应似乎与花朵面积无关，因为唯一对食花行为有反应的T. formosa，其被取食的花冠面积明显较小（2-3%），而那些没有出现花香总量减少的物种包括B. intermedia（9-10%，蜜蜂授粉）、C. pubescens（8-14%，蜜蜂授粉）、L. alba（10-15%，蝴蝶授粉）和Z. montana（12-15%，蜂鸟授粉）。T. formosa花朵中花香的减少可能使其对食花动物的吸引力降低，从而通过植物生理反应降低了食花行为的成本（Kessler等人2013；Boachon等人2015）。另一方面，花香量的减少也可能使这些花朵对传粉者的吸引力降低，因为较高的花香量与较高的植物繁殖成功率相关（Majetic等人2009）。最后，由蜂鸟授粉的Z. montana物种中，部分具有香味特征的组织被食花动物破坏。尽管历史上认为蜂鸟的嗅觉不发达（Bang & Cobb 1968），但最近的研究表明它们能够检测（Steiger等人2008；Wester & Lunau 2017）并对花香作出反应（Kessler等人2008），因此维持Z. montana花朵的香味释放非常重要。尽管食花动物破坏了部分具有香味特征的组织，但两种情况下释放的总花香量及其组成仍然相似（Tunes等人2022）。在本研究中，唯一一个在食花后出现花香变化的物种是T. formosa。然而，与受损营养器官的情况不同（Kessler & Baldwin 2001；Perreca等人2020），我们没有观察到T. formosa受损花朵中与植物防御相关的特定挥发物的产生（其他六个研究物种也是如此）。大多数植物物种在食花后没有诱导出化学反应，这似乎与植物的交配系统无关，因为无论是完全异交的、主要是异交的还是具有混合交配系统的物种都显示了类似的结果。此外，唯一一个在食花后出现花香变化的物种也是四个完全异交物种中的一个。此外，这种缺乏诱导反应的情况不能归因于生物合成途径方面的生化或细胞机制的缺失，因为我们从每个参与叶片食草诱导的植物挥发物合成的途径中都检测到了花香挥发物（Dudareva等人2004, 2013；Mumm & Dicke 2010）。这些结果可能表明，叶片在短期食草反应方面的作用与花朵不同。考虑到挥发物的合成局限于特定的花组织（Effmert等人2006；Dudareva等人2013；Knudsen & Gershenzon 2020），并且所有这些花朵都含有所有相关的生物合成途径，我们无法找到其他合理的解释，除非植物不愿意在如此短暂的花朵上投入防御资源。除了植物合成新的香味化合物的能力外，食草动物还可以分泌唾液蛋白来抑制或刺激植物的防御机制（Ma等人2024及参考文献）。可以认为，由于食花动物分泌的唾液效应物能够减弱茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）途径的诱导，从而导致花香没有变化（Felton等人2014），从而减少了植物对食草的潜在反应（Ruan等人2019及参考文献；Ma等人2024及参考文献）。许多鳞翅目物种（Diezel等人2009）和吸汁昆虫（Naessens等人2015；Su等人2019；Dong等人2020）都含有这样的唾液效应物。然而，在我们的研究中，只有L. alba被鳞翅目毛虫取食，其他物种则被甲虫或蝗虫取食。因此，大多数研究物种中花香变化的缺失很可能不是由于食花动物的唾液效应物所致。由于没有花香组成的变化，即使是在唯一一个对食花行为有反应的物种中也是如此，我们也不能认为食花动物可能分泌了能够刺激植物防御的唾液诱导蛋白（例如通过JA和SA途径以及Ca2+内流，Erb & Reymond 2019；Ma等人2024及参考文献）。此外，食花动物在花朵上停留的时间从6到25小时不等（表S1），这意味着从食花动物开始取食（首次采样后1小时）到我们采样花香之间有相当长的时间间隔。在食花动物停留时间少于24小时的物种包括A. mansoanum、T. formosa和Z. montana。然而，尽管T. formosa暴露于食花动物的时间较短，它仍然是唯一一个出现花香变化的物种。尽管有人可能会认为A. mansoanum和Z. montana需要更长时间才能显示出花香变化，但研究表明植物在受到损伤后5分钟到4小时内就可以开始产生反应（Schmelz等人2001；Lin等人2021），并且这种反应可以持续长达48小时（Lin等人2021），花朵在施用JA后4小时也会产生反应（Jiang等人2011）。此外，这两种物种的花朵仅具有大约24小时的功能性。因此，要影响授粉，食花行为必须在这段时间内引起花香变化。大多数物种由于时间和食花行为的影响，没有显示出个别香味化合物的变化，这是预期之中的，因为它们的花香组成和总释放量都没有变化。Centrosema pubescens和L. alba由于时间的推移确实显示出两种香味化合物的变化，尤其是在C. pubescens中，其总香味释放量有所下降。这可能是由于SM2中的2-苯乙醇相对含量减少所致。这种苯类化合物是一种广泛存在于花朵中的香味化合物（Knudsen等人2006；Knudsen & Gershenzon 2020），并能引发各种传粉者的生理和/或吸引反应（D?tterl & Gershenzon 2023）。在T. formosa中，几种常见且广泛存在的香味化合物以及一种较少见的化合物（Knudsen等人2006；Knudsen & Gershenzon 2020）在两次采样之间的相对重要性也发生了变化，这反映了该物种的自然变化，并非由食花行为引起。然而，由于食花行为引起的6-甲基-5-庚烯-2-酮（Knudsen等人2006；Knudsen & Gershenzon 2020）相对重要性的增加可能具有生态学意义，因为这种化合物已被报道会在叶片食草（Tang等人2012；Yu等人2018；但参见D?tterl & Gershenzon 2023）和吸汁行为（Higashida等人2022）中增加或被诱导，并且与吸引食草动物的寄生虫有关（Yu等人2018）。因此，这种特定香味化合物的变化可能会吸引食草动物的天敌，同时可能增强对传粉者的化学信号。总之，我们发现食花行为对花香的影响非常有限，只有一个物种的总花香量受到负面影响。大多数植物没有表现出由食花行为引起的短期局部化学反应，这引发了关于食花行为诱导的反应有多罕见以及这些反应在物种间有多特异性的问题。此外，我们的发现表明，即使在食花动物造成损伤后，单个花朵的香味混合物仍然保持不变，即使在由天蛾授粉的物种中也是如此，尽管花香释放量有所减少。这意味着其他植物的传粉者无法通过花香量和组成来区分完整花朵和受损花朵。这些植物增强了嗅觉信号，从而在花朵因食花行为而发生视觉变化的情况下仍能保持传粉者的访问频率。本研究的结果表明，我们目前对叶片食草化学反应的了解不能直接应用于基于食花行为的相互作用。叶片中释放的防御化合物可以驱赶叶片食草动物并吸引寄生虫/寄生蜂，但在花朵中，这可能会产生副作用，最终驱赶传粉者而不仅仅是食花动物（Kessler & Halitschke 2009；Kessler 2015）。此外，有证据表明，在某些植物物种中，食花行为可能会引发系统性反应，但这种反应仅涉及叶片，而不涉及花香的释放（Goh等人2019），从而确保了与传粉者的化学通信途径的维持。从更广泛的角度来看，我们的结果表明，花香特征似乎比我们之前认为的更稳定，对自然水平的食花行为反应更小。这可以从进化角度解释为在吸引传粉者和释放驱避化合物之间的权衡，因为被子植物的食花行为比最近的一次大规模传粉者辐射（约50百万年）要早（Peris & Condamine 2024），花香特征可能同时受到传粉者和食花动物的选择压力。感谢Roman Fuchs（萨尔茨堡大学）在GC–MS分析中提供的帮助，感谢巴西圣保罗州立大学（UNESP）博图卡图生物科学研究所的电子显微镜中心在材料处理及SEM分析设备供应方面给予的支持，感谢植物-动物相互作用生态与进化实验室的学生们在野外工作中的协助，同时也感谢两位匿名审稿人对本文早期版本提出的宝贵意见。我们还要感谢圣保罗研究基金会（FAPESP）通过项目编号#2021/10639-5 CBioClima（生物多样性动态与气候变化研究中心）提供的财政支持。本文的出版费用由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）资助（ROR标识符：00x0ma614）。

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